于小龍,　徐　進,　張　昊,　許景升,黃　雯,　胡曉梅,　馮　潔*,　王學利

(1. 天津農學院園藝園林學院, 天津　300384; 2. 中國農業(yè)科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京　100193)

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PMA-PCR方法快速檢測VBNC狀態(tài)青枯菌

于小龍1,2,徐進2,張昊2,許景升2,黃雯2,胡曉梅2,馮潔2*,王學利1*

(1. 天津農學院園藝園林學院, 天津300384; 2. 中國農業(yè)科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京100193)

青枯菌為應對逆境脅迫,可進入活的但非可培養(yǎng)狀態(tài)(viablebutnon-culturable,VBNC)。本文利用疊氮溴化丙錠(PMA)與PCR技術相結合,建立了一種快速有效區(qū)分青枯菌死活細胞的分子檢測方法?；趆rcS基因序列,設計了一對青枯菌種特異性檢測引物hrcSf/hrcSr;利用PMA對青枯菌Po82菌株的細胞懸浮液樣品進行預處理,隨后進行常規(guī)PCR擴增。結果表明,當樣品中PMA質量濃度為3μg/mL、曝光時間大于5min時,PMA可有效抑制死亡菌體細胞中的DNA擴增;且對可培養(yǎng)和VBNC狀態(tài)細胞中的DNA擴增沒有影響;本試驗建立的PMA-PCR方法能有效對包括VBNC狀態(tài)在內的青枯菌活菌進行檢測,避免了假陽性與假陰性結果的產生。

青枯菌;疊氮溴化丙錠;活的非可培養(yǎng)狀態(tài)

茄科雷爾氏菌[Ralstonia solanacearum (Smith, 1896)Yabuuchietal. 1996]簡稱青枯菌,引起植物細菌性青枯病。青枯菌可以侵染54個科,超過450種寄主植物,包括馬鈴薯、香蕉、番茄、煙草、豇豆、花生、腰果、木瓜、油橄欖和生姜等諸多重要糧食及經濟作物[1]。在我國,青枯病自20世紀30年代首次于長江中下游地區(qū)被報道以來,目前已向南擴散至20°N的海南省、向北擴散至42°N河北壩上地區(qū)[2],成為我國農業(yè)生產上的重要限制因子。

作為研究寄主植物與病原細菌互作的模式系統之一,青枯菌毒力調控網絡及致病分子機理等方面的研究已取得了長足的進展。但作為土壤習居菌,青枯菌于土壤及水體環(huán)境中生態(tài)流行學研究領域的工作則相對滯后。一種觀點認為青枯菌利用植物殘體降解后產生的芳香族化合物作為營養(yǎng)代謝底物,從而得以在土壤中長期存活[3];另一種觀點則認為青枯菌,特別是3號小種,在土壤環(huán)境中可進入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)(viablebutnon-culturableVBNC),并于該狀態(tài)下長期存活[4]。VBNC狀態(tài)是細菌為應對極端溫度、滲透壓、寡營養(yǎng)和重金屬等逆境脅迫而普遍采用的一種生存策略。1982年,VBNC狀態(tài)細菌首次被報道。目前已知85種細菌存在VBNC狀態(tài),其中僅有5種植物相關細菌,分別為熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorenscence)、地毯草黃單胞菌柑橘致病變種(Xanthomonas axonopodispv. citri)、大豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)[5]、根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)和茄科雷爾氏菌(R.solanacearum)[6-8]。

由于進入VBNC狀態(tài)的細菌無法采用常規(guī)平板畫線技術培養(yǎng),故而造成VBNC狀態(tài)細菌的假陰性檢測結果,致使以該狀態(tài)存在的細菌成為隱性初侵染源,進而對公共衛(wèi)生安全、糧食安全以及食品安全構成潛在的威脅。目前常用于VBNC狀態(tài)細菌檢測的方法分別基于顯微光學、免疫學以及分子檢測技術[8]。PMA-PCR和EMA-PCR是近年來基于常規(guī)PCR技術發(fā)展起來用于VBNC狀態(tài)細菌的檢測方法。這兩種方法克服了常規(guī)PCR無法區(qū)分活體細菌與死亡菌體釋放出的游離DNA的缺陷,可有效避免假陽性檢測結果。

疊氮溴化丙錠(propidiummonoazide,PMA)與溴化乙錠單疊氮溴(ethidiummonoazidebromide,EMA)是光敏DNA染料,無法透過擁有完整結構的細胞膜,只能修飾細胞死亡后暴露出來的DNA,并與之形成穩(wěn)定的共價氮碳鍵,從而阻斷DNA分子的聚合酶鏈式反應,在強光照射下剩余的PMA和EMA與水分子反應生成沒有活性的羥胺[9]。PMA與EMA較其他方法更快捷,并且能與PCR結合,達到快速檢測的目的,但由于溴化乙錠單疊氮溴(EMA)具有細胞毒性[10]并且其檢測上限為108cfu/mL[11],故本試驗選用PMA為光敏DNA染料。

本研究以用常規(guī)方法難以檢測的VBNC狀態(tài)青枯菌為切入點,旨在建立VBNC狀態(tài)青枯菌的快速分子檢測技術體系,藉此為植物繁殖材料的帶菌檢測與防控策略的效果評價提供技術支持,并為進一步深入解析青枯菌生態(tài)流行學規(guī)律奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料

供試菌株及培養(yǎng)方法:本研究使用的青枯菌菌株與環(huán)境菌株材料均來自本實驗室,詳見表1。

表1　特異性驗證所用青枯菌菌株Table 1　Ralstonia solanacearum strains used in this study

參試菌株均采用NA平板于28℃條件下培養(yǎng),培養(yǎng)基配方如下:葡萄糖10g、多聚蛋白胨5g、牛肉膏3g、酵母提取物0.5g、瓊脂18g,調pH至7.0。定容至1L,121℃滅菌20min。

試劑和耗材:疊氮溴化丙錠(propidiummonoazide)(BiotiumCat.No.40013)、 細菌基因組DNA提取試劑盒(BioTekeCat.No.DP2002)、MarkerI(BingDa)、PCR儀(AppliedBiosystems)、Advantage2PolymeraseMix(Cat.No.639201);其余試劑為國產分析純。

1.2方法

1.2.1青枯菌死菌懸浮液的制備

分別挑取室溫條件下保存于滅菌去離子水中的各供試菌株,于紅四氮唑(triphenyltetrazoliumchloride,TZC)培養(yǎng)平板上畫線,30℃條件下培養(yǎng)48h后,挑取典型的青枯菌野生型菌落,轉至普通NA培養(yǎng)平板,30℃條件下培養(yǎng)48h。采用比濁法,挑取各純培養(yǎng)物,分別于滅菌去離子水中配制成濃度為3×108cfu/mL的細菌懸浮液, 100℃水浴處理10min,獲得青枯菌死菌細胞懸浮液。并于NA平板上畫線,驗證致死效果后備用。

1.2.2PCR引物設計

根據GenBank中登錄的青枯菌Po82菌株的hrcS基因核苷酸序列(NC_017575.1 1330556-1330816),利用NCBI在線引物設計軟件PrimerBLAST進行青枯菌種特異性引物設計,交由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3PCR擴增條件

根據預試驗,確立反應體系。25μL體系中包括PCRMix10μL,hrcSf(0.099nmol/μL)1μL,hrcSr(0.106nmol/μL) 1μL,樣品1μL,ddH2O12μL。

PCR反應程序為:94℃預變性5min;94℃變性30s,59℃退火30s,72℃延伸30s,共30個循環(huán);最后72℃延伸10min。

1.2.4PCR特異性試驗

分別以52個青枯菌菌株和3個參照環(huán)境菌株DNA為擴增模板,用特異性引物hrcSf/hrcSr進行PCR擴增,擴增體系及程序同1.2.3,以滅菌去離子水為陰性對照,擴增產物用2.0%瓊脂凝膠電泳檢測,觀察結果。

1.2.5引物擴增靈敏度

用核酸濃度測定儀(Gene公司,NanoVueplus)測定所提取的Po82基因組DNA濃度,并10倍梯度依次稀釋為25ng/μL、2.5ng/μL、250pg/μL、25pg/μL、2.5pg/μL；按1.2.1方法制備濃度為3×108cfu/mL的Po82菌懸液，10倍梯度稀釋至3×101cfu/mL。利用特異性引物hrcSf/hrcSr,按1.2.3的反應體系和程序分別對梯度稀釋的Po82基因組DNA進行PCR擴增,2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,觀察結果。

1.2.6樣品的PMA處理方法

PMA溶液于-20℃避光保存。取500μL制備好的菌懸液置于1.5mL離心管中,加入2μL濃度為 1mg/mL的PMA溶液,使PMA的終濃度為4μg/mL;PMA與菌懸液混合均勻后在室溫條件下避光放置5min,利用500W的鹵素燈曝光5min,光照交聯時樣品置于冰上(避免過熱),且在距光源50cm處;交聯后的懸浮液1 000g離心5min,所得沉淀溶于500μL無菌水中。

1.2.7青枯菌VBNC狀態(tài)的誘導

高溫處理:將1mL3×108cfu/mL的菌懸液分別以50、52、54、56、58、60、62、64和66℃處理30min后,分別取1μL涂布于NA平板,48h后查看菌落數。

確定青枯菌進入VBNC狀態(tài)后,采用PMA-PCR進行檢測,對照組為同濃度的青枯菌死菌和可培養(yǎng)狀態(tài)的活菌。

2　結果與分析

2.1特異性引物設計

基于我們早期發(fā)表的Po82全基因組序列中hrcS基因,設計了12對引物,從中篩選獲得了一對特異性引物(hrcSf/hrcSr)(表2),可擴增獲得大小為246bp的目的片段。

表2　青枯菌hrcS基因PCR擴增引物序列Table 2　Primer sequences of Ralstonia solanacearum hrcS gene

2.2PCR條件的確立

在反應體系中分別加入7.5、10、12.5μLPCRMix,擴增條帶無明顯差異;不同退火溫度:56、57、58、59、60、61℃所產生的擴增條帶無明顯差異;引物含量分別為0.6、0.8、1.0、1.2μL所得到的擴增條帶也無明顯差異(圖1);由此擬定25μL反應體系組成為:PCRMix10μL、上下游引物各1μL、樣品1μL、ddH2O12μL、退火溫度59℃。

圖1　引物hrcSf/hrcSr PCR條件驗證結果Fig.1　PCR conditions validation with primers hrcSf/hrcSr

2.3PCR特異性與靈敏度驗證

2.3.1特異性驗證

以55個參試菌株的DNA為模板(表1),采用特異性引物hrcSf/hrcSr進行PCR擴增。結果顯示,所有青枯菌DNA均能擴增出246bp左右的單一特異性條帶,與預期結果一致。而甘露醇雷爾氏菌、腸桿菌和金黃桿菌等對照細菌則未產生擴增條帶(圖2)。

2.3.2靈敏度驗證

以特異性引物hrcSf/hrcSr分別對不同濃度梯度的Po82基因組DNA與菌懸液進行擴增,設置無菌水為模板的陰性對照,結果顯示:最低DNA和菌體懸浮液的檢測濃度分別為25pg/μL和3×103cfu/mL(圖3)。

2.4高溫脅迫誘導青枯菌進入VBNC狀態(tài)

如表3所示,菌懸液經52℃以上的高溫處理30min后,按常規(guī)方法涂板培養(yǎng),其菌落計數為0。表明處理后的青枯病菌進入了VBNC狀態(tài),將樣品室溫靜置35d后,所有樣品恢復可培養(yǎng)狀態(tài)。

圖2　引物hrcSf/hrcSr特異性驗證結果Fig.2　Specificity of the primer set hrcSf/hrcSr for detection of Ralstonia solanacearum

圖3　引物hrcSf/hrcSr靈敏度驗證結果Fig.3　Sensitivity of the primer set hrcSf/hrcSr for detection of cell suspension and total DNA of Ralstonia solanacearum

2.5處于VBNC狀態(tài)青枯菌的PMA-PCR檢測

對進入VBNC狀態(tài)的菌懸液進行PMA-PCR檢測,結果顯示(圖4),經過PMA預處理的樣品1～9產生特異性擴增條帶, 而滅活組11則無特異性條帶,表明PMA-PCR能檢測處于VBNC狀態(tài)的青枯病菌,并有效避免了常規(guī)平板計數法檢測出現的假陰性結果。

2.6PMA-PCR 檢測方法的假陽性驗證

為驗證PMA-PCR是否產生假陽性檢測結果,分別采用常規(guī)平板計數、PCR與PMA-PCR對3組死菌樣品進行檢測。結果(表4)表明,常規(guī)PCR能以死菌DNA作為模板正常擴增,檢測結果均為陽性;而PMA-PCR僅以活菌為檢測靶標,未出現假陽性檢測結果(圖5),平板計數進一步驗證了PMA-PCR的可靠性。

表3　不同溫度處理后青枯菌Po82涂板計數結果Table 3　Colony number of bacterial suspensionsof Ralstonia solanacearum strain Po82 treated bydifferent temperatures

圖4　不同溫度處理樣品PMA-PCR擴增結果Fig.4　PMA-PCR products of bacterial suspensions of Ralstonia solanacearum strain Po82 treated by different temperatures

圖5死菌樣品PCR與PMA-PCR擴增結果
Fig.5Comparison of PCR and PMA-PCR for detection of dilution series of dead Ralstonia solanacearum cells

表4　常規(guī)平板培養(yǎng)計數法、常規(guī)PCR法、PMA-PCR測定滅活青枯菌的比較Table 4　Comparison of plate counting, PCR andPMA-PCR for detection of dead Ralstonia solanacearum cells

3　討論

VBNC狀態(tài)是細菌特有的逆境生理生態(tài)響應機制,該狀態(tài)下的細菌具有完整細胞結構、維持低水平呼吸與代謝速率、保持高ATP等級,且基因轉錄表達以及蛋白翻譯合成均發(fā)生了相應改變,并可于適當條件下恢復可培養(yǎng)狀態(tài)。VBNC狀態(tài)的細菌與環(huán)境監(jiān)測,食品加工和檢測技術以及疾病控制等諸多領域均密切相關,且目前對細菌可培養(yǎng)與VBNC兩者狀態(tài)之間相互轉換的分子調控機理尚不清楚,因此研究VBNC狀態(tài)的細菌對于了解細菌的致病機理及生態(tài)適應性至關重要[12-14]。

Grey等2001年首次報道了采用銅制劑誘導青枯菌進入VBNC狀態(tài)[8]。本研究嘗試了采用高溫脅迫誘導青枯菌2號小種Po82菌株快速進入VBNC狀態(tài),并使用常規(guī)平板培養(yǎng)與PMA-PCR結合驗證其是否被成功誘導進入VBNC狀態(tài)。初步試驗結果顯示52℃及以上溫度可成功誘導Po82進入VBNC狀態(tài),68℃為青枯菌的致死溫度。去除脅迫后,進入VBNC狀態(tài)的Po82菌株可復蘇至可培養(yǎng)狀態(tài)。但隨著脅迫溫度的升高,復蘇時間相應延長:52～56℃處理,室溫下靜置數小時后即可復蘇;58～62℃處理,2d后可復蘇;64～66℃,復蘇時間則延長至35d。該結果與OliverandBockian等描述的通過簡單溫度變化可引起VBNC狀態(tài)細菌復蘇基本吻合[15-16],本研究結果同時提示我們應重新審視澳大利亞政府生物安全官方文件報道的青枯菌致死溫度為52℃的結論,以及悶棚、生物熏蒸和50℃溫湯浸種等高溫物理防治措施能否達到預期的青枯病防治效果[17-19]。

本研究錨定與致病密切相關的hrp基因簇中保守基因hrcS作為青枯菌種水平檢測靶標。hrp基因簇廣泛存在于植物與動物病原細菌中,其編碼產物參與組裝形成Ⅲ型分泌系統,并通過該系統直接將Ⅲ型效應子注入寄主細胞,以抑制植(動)物的防御反應。與野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)等植物病原細菌不同,青枯菌的hrp基因簇是與祖先基因共同進化的核心基因組成員,而非通過基因水平轉移獲得的致病島[20]。細菌自然進化過程中核心基因經受了更大的選擇壓力,因此在種水平上具有高度保守性,以此類基因作為檢測靶標,比利用基因間隔區(qū)序列和未知功能片段更為可靠。

綜上所述,本研究建立的PMA-PCR檢測方法能從混合狀態(tài)下的純培養(yǎng)菌中特異性檢測出1×103cfu/mL的青枯菌活菌,并能夠有效區(qū)分死細胞和VBNC狀態(tài)的菌體,為處于VBNC狀態(tài)的青枯菌檢測提供了更為準確、科學的檢測方法,具有一定的實用價值和應用前景。

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(責任編輯：楊明麗)

Rapiddetectionofviablebutnon-culturable(VBNC) Ralstonia solanacearumbyPMA-PCRmethod

YuXiaolong1,2,XuJin2,ZhangHao2,XuJingsheng2,HuangWen2,HuXiaomei2,FengJie2,WangXueli1

(1.CollegeofHorticultureandLandscape,TianjinAgriculturalUniversity,Tianjin300384,China;2.InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,Beijing100193,China)

Ralstonia solanacearumcanenterintotheVBNCstate(viablebutnon-culturable)inresponsetoadverseenvironmentalconditions.Anovelmethodtodifferentiateviable/deadcellsofR.solanacearumwasestablishedbyusingaDNAdyeofpropidiummonoazide(PMA)incombinationwiththepolymerasechainreaction(PMA-PCR).OnthebasisofhrcSgenesequence,aspecies-specificprimersethrcSf/hrcSrwasdesignedfordetectionofR.solanacearum.Sampleswerepre-treatedwithPMAwhichboundDNAfromdeadcellssothatonlyviablecellscanbeamplifiedbyPCR.Afinalconcentrationof3μg/mLPMAand5-minexposuretimewasfoundtocompletelyinhibitPCRamplificationfromDNAofdeadcells,andhadnoinhibitioneffectonviableandviablebutnon-culturable(VBNC)cells.ThePMA-PCRmethodestablishedinthisworkcandetectviableandviablebutnon-culturable(VBNC)cellsandavoidfalsepositiveandfalsenegationresultofR.solanacerum.

Ralstonia solanacerum;propidummonoazide;viablebutnon-culturable

2014-12-31

2015-02-09

公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(201303015); 國家自然科學基金(31272008，31371908); 天津市農業(yè)科技成果轉化與推廣項目(201002250)

E-mail:wxlzxp@sohu.com;jfeng@ippcaas.cn

S436.411

ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.026