楊曉云,　張　斌,　劉郵洲,　陳志誼

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,南京　210014)

?

4種常用殺菌劑對江蘇省番茄枯萎病菌的毒力

楊曉云,張斌,劉郵洲,陳志誼*

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,南京210014)

采用菌絲生長速率法測定了4種殺菌劑對36株番茄枯萎病菌(Fusariumoxysporum)的毒力。結(jié)果表明,不同殺菌劑對番茄枯萎病菌的毒力水平有顯著差異,25%氰烯菌酯懸浮劑和50%多菌靈可濕性粉劑對菌落生長的抑制毒力最強(qiáng),EC50分別為1.65 μg/mL和2.91 μg/mL;3%中生菌素可濕性粉劑的毒力次之,EC50為12.56 μg/mL;75%百菌清可濕性粉劑的毒力最小。不同地區(qū)的番茄枯萎病菌對4種殺菌劑的敏感性存在明顯的差異,銅山地區(qū)的菌株除了對多菌靈、氰烯菌酯有較高的敏感性外,對其他2種殺菌劑都呈不同程度耐藥性;沭陽地區(qū)的菌株對4種殺菌劑的敏感性均很強(qiáng);姜堰地區(qū)的菌株對百菌清有較弱的敏感性,對其他3種殺菌劑的敏感性均較強(qiáng)。本研究為化學(xué)防治番茄枯萎病、科學(xué)合理用藥提供參考依據(jù)。

殺菌劑;番茄枯萎病菌;尖孢鐮刀菌;毒力測定

番茄枯萎病(病原菌為尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum)是番茄生產(chǎn)中的主要土傳病害,具有寄主范圍廣,防治困難的特點(diǎn),一直是國內(nèi)外研究的焦點(diǎn)和熱點(diǎn)[1-3]。近年來,隨著全國范圍內(nèi)設(shè)施番茄種植面積的擴(kuò)大,番茄枯萎病已成為常見、易發(fā)和傳播迅速的重要土傳病害,嚴(yán)重影響了番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)。用于防治番茄枯萎病的方法有多種[4-6],但在生產(chǎn)上主要以化學(xué)防治為主。為了減少菜農(nóng)在用藥時(shí)的盲目性,本文作者通過對江蘇省設(shè)施番茄生產(chǎn)基地實(shí)地調(diào)查,選用了江蘇省設(shè)施番茄土傳病害常用的4種化學(xué)藥劑,從江蘇省徐州市銅山區(qū)、泰州市姜堰區(qū)、宿遷市沭陽縣設(shè)施番茄種植基地采集土樣,分離番茄枯萎病菌,測定了4種化學(xué)藥劑對番茄枯萎病菌的毒力,分析了3個(gè)地區(qū)的番茄枯萎病菌對4種化學(xué)藥劑的敏感性水平,為番茄生產(chǎn)上科學(xué)合理用藥提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

36個(gè)供試病原菌菌株分別從江蘇省3個(gè)地區(qū)的番茄示范基地(A.徐州市銅山區(qū)；B.泰州市姜堰區(qū)；C.宿遷市沭陽縣)番茄枯萎病病株根圍土壤中分離獲得。大棚連續(xù)多年種植番茄,每年1茬,枯萎病發(fā)生較重。沭陽地區(qū)設(shè)施番茄采用水旱輪作的種植模式,春季-夏季種植水稻,秋季-冬季種植番茄,連續(xù)種植番茄3～4年后就換地,基本上不專門用藥防治枯萎病;銅山地區(qū)在日光大棚中種植番茄,秋季-冬季種植番茄,春季-夏季種植其他蔬菜,枯萎病菌在土壤中存活年代久,數(shù)量大,每年使用大量化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行多次防治。姜堰地區(qū)為大棚蔬菜示范新區(qū),主要使用多菌靈防治番茄枯萎病,且用藥量較大。每次取樣在同一大棚進(jìn)行,大棚面積667 m2,五點(diǎn)取樣法取土樣。

供試藥劑:75%百菌清可濕性粉劑,廣東中迅農(nóng)業(yè)科技股份有限公司生產(chǎn);3%中生菌素可濕性粉劑,福建凱立生物制品有限公司生產(chǎn);50%多菌靈可濕性粉劑,上海滬聯(lián)生物藥業(yè)有限公司;25%氰烯菌酯懸浮劑,江蘇省農(nóng)藥研究所股份有限公司生產(chǎn)。

供試選擇性培養(yǎng)基:KH2PO41 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,K2S2O50.2 g,KCl 0.6 g,NH4NO30.5 g,蛋白胨5 g,蒸餾水1 000 mL,山梨糖10 g,蔗糖5 g,瓊脂20 g,PCNB 620 mg,Oxgall 1 g,硫酸鏈霉素300 mg,鹽酸金霉素75 mg。

PDA培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂15 g,蒸餾水1 000 mL。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1病原菌的分離、檢測及鑒定

根據(jù)文學(xué)等[7]的枯萎病菌分離方法獲得病菌,在PDA培養(yǎng)基平板上進(jìn)行純化。于28℃培養(yǎng)4 d,觀察菌落形態(tài)特征,大、小型分生孢子和厚垣孢子著生情況和形態(tài)特征。并依據(jù)Botha分類系統(tǒng)[8]和Nelson等[9]鑒定手冊進(jìn)行病原菌鑒定。

1.2.2含藥培養(yǎng)基配制

每個(gè)供試藥劑各設(shè)5～6個(gè)濃度(質(zhì)量濃度),50%多菌靈可濕性粉劑濃度分別為0.3、1、2.5、5和10 μg/mL。75%百菌清可濕性粉劑濃度分別為1、3.3、10、33.3、100和333 μg/mL。3%中生菌素可濕性粉劑濃度分別為1、5、10、50和100 μg/mL。25%氰烯菌酯懸浮劑濃度分別為0.5、1、2、4和8 μg/mL。將4種試驗(yàn)藥劑分別用溶劑配制成所需各濃度的10倍,取1 mL注入經(jīng)消毒滅菌的、直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中,隨后倒入9 mL冷卻至約50℃的PDA培養(yǎng)基,搖勻后制成含藥培養(yǎng)基。

1.2.3供試殺菌劑對番茄枯萎病菌的室內(nèi)毒力測定方法

菌餅的制備:將保存在試管斜面上的供試菌株轉(zhuǎn)接于PDA平板上,28℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d,用直徑5 mm的打孔器切取菌落外緣制備成菌餅,備用。

菌絲生長速率測定法[10]:將4種殺菌劑分別制成不同濃度的含藥PDA培養(yǎng)基平板,設(shè)置不加藥劑的對照,每個(gè)濃度重復(fù)3次。在每個(gè)平板中央接入一塊直徑為5 mm的菌餅。28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。采用十字交叉法測量菌落直徑,以平均值代表菌落大小,根據(jù)以下公式計(jì)算各藥劑濃度對菌絲生長的抑制率。所得數(shù)據(jù)經(jīng)Finney幾率分析法和DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,求出各單劑毒力回歸方程、EC50及相關(guān)系數(shù)(r)[11]。

抑菌率計(jì)算公式如下:

2　結(jié)果與分析

2.136個(gè)番茄枯萎病菌的分離和鑒定

在江蘇銅山、姜堰、沭陽3個(gè)基地采集土壤,使用選擇性培養(yǎng)基分離枯萎病菌。分離獲得36株病原菌,有2種菌落形態(tài)(圖1)。

圖1　兩種類型菌株的培養(yǎng)性狀Fig.1　Colony morphology of two types of strains

類型Ⅰ菌落初為粉色,菌絲茂密,菌落中心略有皺縮凸起,5～6 d時(shí)菌落變?yōu)槊倒寮t色,8～10 d后菌落顏色為暗紫色;類型Ⅱ菌落初為白色,菌絲絨狀,略帶粉狀,菌落中心略有凸起,后變?yōu)闇\紫色,菌落底淺肉色。初步鑒定菌株屬于尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)。

在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)96 h后,菌落平均直徑為48.9 mm,菌株間有差異,氣生菌絲絨狀、氈狀,白色或粉色,菌落背面常帶有紫色或紅色色素(圖1)。鏡檢發(fā)現(xiàn),可觀察到3種分生孢子,分別為:(1)小型分生孢子,較多,卵形或橢圓形,假頭狀著生于產(chǎn)孢細(xì)胞上。(2)大型分生孢子“美麗型”,較勻稱,基細(xì)胞足跟明顯,多數(shù)為3個(gè)隔膜。(3)厚垣孢子球形,頂生、間生或串生。產(chǎn)孢細(xì)胞較短,單瓶梗,單生或具分支(圖2)。根據(jù)菌落形態(tài)和鏡檢特征,將分離得到類型I、類型Ⅱ的菌株初步鑒定為尖孢鐮刀菌。

ITS序列分析:利用真菌通用引物(ITS1和ITS4)對形態(tài)學(xué)初步確定的36個(gè)代表菌株進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。序列分析結(jié)果顯示,36株菌株的ITS序列相似性≥98%,且與尖孢鐮刀菌親緣關(guān)系最近(相似性≥99%),結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征,可確定供試36個(gè)菌株均為尖孢鐮刀菌,其中,類型I有22個(gè)菌株,類

型Ⅱ有14個(gè)菌株。

圖2　尖孢鐮刀菌的產(chǎn)孢細(xì)胞(a)和分生孢子(b)形態(tài)Fig.2　Conidiogenous cells (a)and conidia (b) of Fusarium oxysporum

2.24種殺菌劑對番茄枯萎病菌的毒力測定結(jié)果

通過室內(nèi)測定4種殺菌劑對36株番茄枯萎病菌菌絲生長速率抑制作用結(jié)果可知,不同殺菌劑對番茄枯萎病菌的毒力水平有顯著差異。75%百菌清可濕性粉劑的毒力較弱,平均EC50為(55.140±5.711) μg/mL,3%中生菌素可濕性粉劑的毒力次之,平均EC50為(12.560±0.199) μg/mL;50%多菌靈可濕性粉劑和25%氰烯菌酯懸浮劑的毒力較強(qiáng),平均EC50分別為(2.908±0.086) μg/mL和(1.652±0.173) μg/mL。

75%百菌清可濕性粉劑對沭陽菌株的毒力最強(qiáng),EC50范圍0.36～61.44 μg/mL,對姜堰菌株的毒力次之,EC50范圍22.01～95.34 μg/mL,對銅山菌株的毒力最弱,EC50范圍1.52～246.61 μg/mL(表1～2)。

表1　75%百菌清可濕性粉劑對番茄枯萎病菌的室內(nèi)毒力測定結(jié)果Table 1　Toxicity of 75% chlorothalonil WP to tomato Fusarium oxysporum

表2　江蘇省不同地區(qū)番茄枯萎病菌對75%百菌清可濕性粉劑的敏感性1)Table 2　Sensitivity of tomato Fusarium oxysporum from different regions to 75% chlorothalonil WP in Jiangsu Province

1) 表中不同小寫字母表示差異顯著(Duncan氏新復(fù)級差法,P<0.05)。下同。

The different letters indicated significant difference at 0.05 level by DMRT.The same below.

3%中生菌素可濕性粉劑對沭陽菌株的毒力最強(qiáng),EC50范圍3.76～16.04 μg/mL,對姜堰菌株的毒力次之,EC50范圍4.60～14.62 μg/mL,對銅山菌株的毒力最弱,EC50范圍4.07～112.00 μg/mL(表3～4)。

表3　3%中生菌素可濕性粉劑對番茄根際鐮刀菌群的室內(nèi)毒力測定結(jié)果Table 3　Toxicity of 3% zhongshengmycin WP to tomato Fusarium oxysporum

表4　江蘇省不同地區(qū)番茄枯萎病菌對3%中生菌素可濕性粉劑的敏感性Table 4　Sensitivity of tomato Fusarium oxysporum from different regions to 3% zhongshengmycin WP in Jiangsu Province

50%多菌靈可濕性粉劑對銅山菌株的毒力最強(qiáng),EC50范圍1.66～3.31 μg/mL,對姜堰菌株的毒力次之,EC50范圍1.84～3.93 μg/mL,對沭陽地區(qū)菌株的毒力最弱,EC50范圍2.05～4.38 μg/mL(表5～6)。

25%氰烯菌酯懸浮劑對姜堰菌株的毒力最強(qiáng),EC50范圍0.01～3.66 μg/mL,對沭陽菌株的次之,EC50范圍0.05～3.57 μg/mL,對銅山菌株的毒力最弱,EC50范圍0.05～4.69 μg/mL(表7～8)。

比較4種殺菌劑對來自3個(gè)地區(qū)的36個(gè)番茄枯萎病菌的毒力水平,結(jié)果表明,不同地區(qū)的番茄枯萎病菌對4種殺菌劑的敏感性存在明顯的差異。銅山地區(qū)的菌株,除了50%多菌靈可濕性粉劑,對其他3種殺菌劑的敏感性都很弱;沭陽地區(qū)的菌株對4種殺菌劑的敏感性均很強(qiáng);姜堰地區(qū)的菌株對75%百菌清可濕性粉劑有較弱的敏感性,對其他3種殺菌劑的敏感性較強(qiáng)。

表5　50%多菌靈可濕性粉劑對番茄根際鐮刀菌群的室內(nèi)毒力測定結(jié)果Table 5　Toxicity of 50% carbendazim WP to tomato Fusarium oxysporum

表6　江蘇省不同地區(qū)番茄枯萎病菌對50%多菌靈可濕性粉劑的敏感性1)Table 6　Sensitivity of tomato Fusarium oxysporum from different regions to 50% carbendazim WP in Jiangsu Province

1) 表中不同小寫字母表示差異顯著(Duncan氏新復(fù)級差法,P<0.05)。

Different letters indicate significant difference at 0.05 level by DMRT.

表7　25%氰烯菌酯懸浮劑對番茄根際鐮刀菌群的室內(nèi)毒力測定結(jié)果Table 7　Toxicity of 25% JS399-19 SC to tomato Fusarium oxysporum

表8　江蘇省不同地區(qū)番茄枯萎病菌對25%氰烯菌酯懸浮劑的敏感性Table 8　Sensitivity of tomato Fusarium oxysporum from different regions to 25% JS399-19 SC in Jiangsu Province

3　討論

隨著設(shè)施番茄連續(xù)種植年代的增加,由枯萎病菌引起的土傳病害導(dǎo)致的連作障礙日趨嚴(yán)重,現(xiàn)已成為設(shè)施番茄安全生產(chǎn)的主要瓶頸[12]。目前生產(chǎn)上防治番茄枯萎病主要依靠化學(xué)農(nóng)藥。我們通過實(shí)地調(diào)查和試驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),不同地區(qū)的枯萎病菌菌株對化學(xué)農(nóng)藥的敏感性存在顯著差異,這與當(dāng)?shù)卦O(shè)施番茄的種植模式和用藥水平有密切關(guān)系,例如與其他兩個(gè)地區(qū)的菌株相比,沭陽地區(qū)的枯萎病菌幾乎對所有的化學(xué)農(nóng)藥都比較敏感,其原因之一是沭陽地區(qū)設(shè)施番茄采用水旱輪作的種植模式,春季-夏季種植水稻,秋季-冬季種植番茄,連續(xù)種植番茄3～4年后就換地,所以基本上不用藥防治枯萎病;銅山地區(qū)的枯萎病菌對化學(xué)農(nóng)藥的敏感性較弱,主要原因是銅山地區(qū)在日光大棚中種植番茄,秋季-冬季種植番茄,春季-夏季種植其他蔬菜,枯萎病菌在土壤中存活年代久,數(shù)量大,每年必須使用大量化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行多次防治。因此,在制定設(shè)施番茄枯萎病綜合防控對策時(shí),我們要了解當(dāng)?shù)胤逊N植模式和防治枯萎病的用藥水平,以便能夠初步估算出枯萎病菌對化學(xué)農(nóng)藥的敏感性,做到適時(shí)適量用藥,達(dá)到經(jīng)濟(jì)、有效地防控設(shè)施番茄枯萎病的目的。

從本試驗(yàn)結(jié)果可看出,化學(xué)藥劑50%多菌靈可濕性粉劑和25%氰烯菌酯懸浮劑對番茄枯萎病菌表現(xiàn)出較好的抑菌活性,平均EC50分別為2.91 μg/mL和1.65 μg/mL,但是我們通過設(shè)施番茄生產(chǎn)基地實(shí)地調(diào)查發(fā)現(xiàn),多菌靈和氰烯菌酯對番茄枯萎病的防治效果并不十分理想,分析主要原因是這兩種化學(xué)藥劑的殘效期太短,無法全面防控枯萎病菌的侵害。番茄枯萎病菌長期存活在土壤中,通過番茄植株的根部傷口侵染到植株體內(nèi)繁殖,因此需要在苗期定植時(shí)用藥處理土壤,阻止病原菌侵入番茄植株內(nèi);多菌靈和氰烯菌酯的殘效期一般為7～10 d,必須大量、連續(xù)地使用藥劑才能達(dá)到較好的防控效果,而在番茄生產(chǎn)基地一般只在移苗定植前一次性用藥處理土壤,兩種化學(xué)藥劑的殘效期又短,致使達(dá)不到很好的防控效果。另外,大量、多次使用化學(xué)藥劑處理土壤會造成環(huán)境污染,并且增加農(nóng)民生產(chǎn)成本。

由此可見,使用化學(xué)防治技術(shù)控制設(shè)施番茄枯萎病并不是最佳選擇。解決病原菌抗藥性的有效途徑,可以采用替代藥劑(生防菌劑)以及與不同作用靶標(biāo)的其他藥劑混用或復(fù)配等。本實(shí)驗(yàn)室以番茄枯萎病菌為指示菌,定向分離和篩選了對病原菌有較好拮抗作用的生防菌芽胞桿菌B-1619,通過田間試驗(yàn)表明,B-1619不僅可有效控制設(shè)施番茄枯萎病,而且對番茄植株有一定促生作用[13-14]。使用生物防治技術(shù)控制設(shè)施番茄枯萎病,將減少化學(xué)農(nóng)藥造成的環(huán)境污染,并且可以修復(fù)生態(tài)環(huán)境,是一種具有應(yīng)用前景的防控技術(shù),有待今后深入研發(fā)和推廣應(yīng)用。

[1]徐艷輝, 李燁, 許向陽. 番茄枯萎病的研究進(jìn)展[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 39(11): 128-134.

[2]Fuchs J G, Moёnne-Loccoz Y, Défago G. NonpathogenicFusariumoxysporumstrain Fo47 induces resistanceFusariumwilt of tomato [J]. Plant Disease, 1997, 81(5): 492-495.

[3]閆敏, 龐金梅, 焦曉燕, 等. 番茄枯萎病對植株維管束危害及抗氧化系統(tǒng)影響的研究[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2013, 21(5): 615-620.

[4]錢曉雍, 沈根祥, 黃麗華, 等. 3 株非致病性鐮刀菌Fusariumoxysporum菌株對番茄枯萎病的生物防治效果[J]. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2008, 23(4): 60-62.

[5]田連生, 張根偉. 木霉菌劑防治番茄枯萎病效果[J]. 現(xiàn)代化農(nóng)業(yè), 2002(10): 14.

[6]張丹, 張萬民, 洪曉燕, 等. 申嗪霉素對番茄枯萎病的防治效果[J]. 中國蔬菜, 2012(23): 32.

[7]文學(xué), 籍秀琴, 陳其煐. 從土壤中分離棉枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum(Atk.) Synder & Hansen) 選擇性培養(yǎng)基研究[J]. 棉花學(xué)報(bào), 1993, 5(2): 87-93.

[8]Botha A, Denman S, Lamprecht S C, et al. Characterisation and pathogenicity ofRhizoctoniaisolates associated with black root rot of strawberries in the Western Cape Province, South Africa [J].Australasian Plant Pathology,2003,32(2):195-201.

[9]Nelson P E, Toussoun T A, Marasas W F O.Fusariumspecies: an illustrated manual for identification [M]. Pennsylvania： Pennsylvania State University Press, 1983:193.

[10]方中達(dá).植病研究方法[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1998:46-47.

[11]唐啟義, 馮明光. 實(shí)用統(tǒng)計(jì)分析及其DPS處理系統(tǒng)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2002.

[12]王治林, 朱劍花, 岳菊, 等. 茄果類蔬菜枯萎病及其綜合防治[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011(6): 168-171.

[13]陳志誼,劉郵洲,喬俊卿,等.利用芽胞桿菌生防菌防控土傳病害引起的設(shè)施蔬菜連作障礙[J].中國蔬菜,2012(8):29-30.

[14]喬俊卿, 劉郵洲, 夏彥飛, 等. 生防菌 B1619 在番茄根部的定殖及對根際微生態(tài)的影響[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2013, 40(6): 507-511.

(責(zé)任編輯：王音)

Toxicity of four common fungicides to tomatoFusariumwilt in Jiangsu Province

Yang Xiaoyun,Zhang Bin,Liu Youzhou,Chen Zhiyi

(Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing210014,China)

The inhibitory activity of 4 fungicides against 36Fusariumoxysporum, the pathogen of tomatoFusariumwilt, was investigated by mycelium growth rate method. The results showed that different fungicides have certain inhibition effects on the growth ofF.oxysporum. 25% JS399-19 SC and 50% carbendazim WP had the highest inhibitory activities, with the EC50values of 1.65 μg/mL and 2.91 μg/mL, respectively, followed by 3% zhongshengmycin WP with EC50value of 12.56 μg/mL, and 75% daconil WP was the weakest. Moreover, pathogens collected from different regions showed significant difference on the sensitivity to the four fungicides. The pathogens from Tongshan District were sensitive to carbendazim and JS399-19 but fairly resistant to the other 2 fungicides. Pathogens from Shuyang District were highly sensitive to the 4 fungicides. Pathogens from Jiangyan District had low sensitivity to daconil, but very sensitive to the other 3 fungicides. This study provides an important theoretical and practical basis and reasonable selection of fungicides for the control of tomatoFusariumwilt.

fungicides;tomatoFusariumwilt;Fusariumoxysporum;toxicity test

2014-12-21

2015-03-04

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(“863”計(jì)劃)(2011AA10A201)；江蘇省農(nóng)科院科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目(CX(13)3061)

E-mail:chzy@jaas.ac.cn

S 482.2

B

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.039