梁紫璐，畢水蓮，黃琬淳（.廣東藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 5030；.廣東藥學(xué)院 食品科學(xué)學(xué)院，廣東 中山58458）

上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用研究進(jìn)展

梁紫璐1，畢水蓮2，黃琬淳2
（1.廣東藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510310；2.廣東藥學(xué)院 食品科學(xué)學(xué)院，廣東 中山528458）

上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米技術(shù)由于其具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡單、不損傷樣本且無背景熒光等諸多優(yōu)點，正成為研究的熱點。文章介紹了上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米技術(shù)的發(fā)光材料、發(fā)光機(jī)制以及在食品安全檢測中應(yīng)用的最新進(jìn)展。

上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米技術(shù)；食品安全；檢測

食品安全問題是一個全球性話題，它不僅影響著人們的身體健康，甚至也影響著各國的經(jīng)濟(jì)和社會發(fā)展。近年來，國內(nèi)外有關(guān)食品安全惡性事件不斷發(fā)生，造成了巨大的人員傷亡和經(jīng)濟(jì)損失。由此可見，盡早地發(fā)現(xiàn)食品存在的安全隱患，做好食品安全的檢測工作，對于保障人體健康具有非常重要意義。

在食品安全檢測方法方面，較多采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymease chain reaction，PCR）、氣相色譜-質(zhì)譜法聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）［1］、高效毛細(xì)管電泳法（high performance capillary electrophoresis，HPCE）［2］、固相萃取-高效液相色譜法（solid phase extraction-high performance liquid chromatography，SPEHPLC）［3］等儀器分析檢測方法。這些方法要求對檢測樣本先進(jìn)行提取、凈化、濃縮和衍生化等前處理，而且樣品前處理的過程也較為復(fù)雜、耗時費力、成本偏高。相對于常用的檢測方法，酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（enzyme-linked immu-nosorbent assay，ELISA）［4］以及膠體金免疫層析法（immune colloidal gold technique，GICT）［5］等免疫學(xué)快速檢測方法，可直接使用稀釋樣本或提取液來進(jìn)行檢測，因此減少了近70%的工作量。但是，對于某些特殊的檢測靶標(biāo)來說，這些免疫學(xué)快速檢測方法很難在短時間內(nèi)迅速圓滿完成檢測，會出現(xiàn)檢測時間過長或者靈敏度不高的情況。然而，運用上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米技術(shù)（upconversion fluorescence nanoparticles technology，UPNT）可以大幅度地提高特定抗體的檢測靈敏度，為食品安全檢測提供了新的思路。本文主要介紹上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米的發(fā)光材料、發(fā)光機(jī)制以及在食品安全檢測中應(yīng)用的最新進(jìn)展。

1　上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料及其特點

在食品安全檢測中，經(jīng)常利用熒光染料與研究對象吸附或共價結(jié)合形成化合物，然后通過化合物的熒光特性反映有關(guān)研究對象性能的信息。這些結(jié)合后的化合物在紫外波段下發(fā)生激發(fā)光時，有可能會使生物組織及其肽、蛋白質(zhì)、核酸等產(chǎn)生強(qiáng)烈的背景熒光［5］。但某些熒光素會產(chǎn)生生物學(xué)毒性，導(dǎo)致抗原或抗體的靈敏度和選擇性下降，影響實際檢測效果或嚴(yán)重危害到被檢測的生物體［6，7］。

上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料（up converting phosphor，UCP）是新型的低毒性熒光材料，能夠在能量較低的長波輻射激發(fā)下，發(fā)射出能量較高的短波輻射。而且新型的UCP是采用納米材料對生物進(jìn)行標(biāo)記的，可形成上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米顆粒（upconverting nanoparticles，UCNPs）。與有機(jī)熒光染料和量子點等發(fā)光材料相比，UCNPs具有背景熒光極弱、反斯托克斯效應(yīng)大、發(fā)射帶寬窄、不易光漂白［8］、光散射更少和組織穿透力更深［9］等優(yōu)點。這些優(yōu)點使得UCNPs可以在單一激發(fā)光源的激發(fā)下，同時發(fā)射出不同顏色的可見光，方便運用于小動物體內(nèi)或其淺表組織的多色成像［10］，也為食品安全檢測提供了新的進(jìn)展方向。

2　上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米技術(shù)的發(fā)光機(jī)制

UPNT是基于UCNPs的一種新興技術(shù)，其本質(zhì)為反斯托克斯發(fā)光效應(yīng)［11］。與斯托克斯定律不同的是，上轉(zhuǎn)換發(fā)光是基于雙光子或多光子機(jī)制，將長波長激發(fā)光轉(zhuǎn)換成短波長發(fā)射光。UPNT中的反斯托克斯發(fā)光過程，必須基于雙光子或者多光子效應(yīng)，實現(xiàn)上轉(zhuǎn)換納米離子能級之間的躍遷（即上轉(zhuǎn)換納米離子禁戒的f-f躍遷），確保發(fā)光中心的亞穩(wěn)態(tài)擁有較長的能級壽命，從而釋放長波長。

一般來說，上轉(zhuǎn)換發(fā)光的基本機(jī)制分為激發(fā)態(tài)吸收（excited state absorption，ESA）、能量轉(zhuǎn)移（energy transfer，ET）和光子雪崩（photon avalanche，PA）3個過程，完成上轉(zhuǎn)換熒光過程大致需要6個步驟，分別為光子添加能量轉(zhuǎn)移過程（additionde photonspar transfensd energie，APTE）、激發(fā)態(tài)吸收（excited state absorption，ESA）、合作敏化（cooperative sensitization，COS）、合作發(fā)光過程（cooperative luminescence，COL）、雙子光激發(fā)過程（two photon absorbed excitation，TPAE）和光子雪崩過程（photon avalanche，PA）［11-13］，如圖1。

3　UPNT在食品安全檢測中的應(yīng)用

食品安全檢測中運用UPNT，必須先對UCNPs進(jìn)行氨基化、醛基化、羧基化的表面修飾，增強(qiáng)UCNPs在水溶液中的分散性和穩(wěn)定性，使其易于和生物大分子相結(jié)合，便于運用在食品安全檢測中。一般會采用溶膠-凝膠法、共沉淀法、微乳液法、微波水熱法、水熱合成法等方法合成。

目前國內(nèi)外也逐步將UPNT運用于食品安全領(lǐng)域，主要研究在細(xì)菌毒素、真菌毒素、食源微生物、藥物殘留等食品安全檢測方面。

3.1細(xì)菌毒素、真菌毒素的檢測

3.1.1細(xì)菌毒素 細(xì)菌可產(chǎn)生內(nèi)、外毒素，從而引發(fā)細(xì)菌性食源性疾病。細(xì)菌性食源性疾病常造成群發(fā)性腹瀉、嘔吐等，給人們的身體健康帶來危害。

吳世嘉［15］建立了基于核酸適配體識別的上轉(zhuǎn)換熒光納米探針技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌腸毒素B （staphylococcal enterotoxin B，SEB）的方法。該方法靈敏度高，SEB的檢出限可達(dá)0.3 pg/mL，在0.001～1 ng/ mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，已經(jīng)成功應(yīng)用于牛奶樣品中SEB的檢測分析。汪俊麗［16］釆用水熱法合成了上轉(zhuǎn)換納米顆粒，以硝酸纖維素膜作為載體，建立了毒素的夾心式熒光免疫分析方法。在SEB毒素檢測中，檢測限最低為0.01 ng/mL。

3.1.2真菌毒素 真菌毒素是真菌所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，它們可通過食品或飼料進(jìn)入人和動物體內(nèi)，引起人和動物的急性或慢性毒性，損害機(jī)體的肝臟、腎臟、神經(jīng)組織、造血組織及皮膚組織等。

圖1　上轉(zhuǎn)換納米發(fā)光機(jī)制［14］Figure 1 Mechanism of upconversion nanoparticle photoluminescence［14］

段諾等［17］建立了核酸適配體識別-熒光探針技術(shù)檢測赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）的新方法，引起熒光信號發(fā)生變化，從而實現(xiàn)對OTA的定量檢測。其檢出限為1×10-8g/L，檢測線性范圍為2.0×10-8～1.0× 10-5g/L，已成功應(yīng)用于玉米粉中OTA的檢測。吳世嘉［15］也通過組裝建立基于磁分離富集-核酸適配體識別-上轉(zhuǎn)換熒光納米探針技術(shù)，得出OTA的檢出限為1×10-13g/mL，在1×10-13～1×10-9g/mL范圍內(nèi)與熒光值呈線性關(guān)系。

吳世嘉［15］在黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）檢測中，運用水熱法和氨基化修飾的納米顆粒，制備出了anti-AFB1-NaYF4:Yb，Tm的UCNPs和Er UCNPs信號探針。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AFB1檢出限為0.01 ng/mL。Shim等［18］檢驗玉米樣品中的AFB1，采用了化學(xué)發(fā)光競爭性適配體，將G-四聯(lián)體-Hemin辣根過氧化物模擬DNA酶與一個特定的AFB1的適體相連接，該實驗檢出限為0.11 ng/mL。劉曉等［19］采用競爭免疫反應(yīng)建立了黃曲霉毒素M1（aflatoxin M1，AFM1）上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析技術(shù)，檢測奶粉及牛奶中的AFM1。奶粉中的檢測下限可達(dá)0.1 μg/kg，在0.1～0.7 μg/kg之間具有較好的線性關(guān)系，而牛奶中的檢測限為0.3 μg/L，在0.3～0.7 μg/L之間具有較好的線性關(guān)系。

在伏馬菌素B1（Fumonisin B1，F(xiàn)B1）的檢測方面，吳世嘉等［20］采用水熱法合成了NaYF4:Yb，Ho，建立了上轉(zhuǎn)換納米顆粒-金納米顆粒標(biāo)記分子信標(biāo)的新型檢測技術(shù)。結(jié)果表明，F(xiàn)B1在0.01～100 ng/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限達(dá)到0.01 ng/mL。於然等［21］在脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）的檢測中，制備出了羧基修飾的核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換納米顆粒NaYF4:Yb，檢驗的靈敏度為0.7 ng/mL，檢測范圍為0.7～50.0 ng/mL。

3.2食源性微生物的檢測

食源性微生物能夠使食物發(fā)生腐敗變質(zhì)，并導(dǎo)致食源性疾病的發(fā)生，影響人體健康。主要有大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、霍亂弧菌（Vibrio cholera）、副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）等。

李偉等［22］將上轉(zhuǎn)磷光檢測技術(shù)和免疫層析技術(shù)（雙抗體夾心法）結(jié)合，建立了快速檢測炭疽芽孢的方法。該方法可在30 min內(nèi)檢測面粉、淀粉等材料中摻入的炭疽芽孢，其特異性良好，檢測靈敏性為104個芽孢。馬小媛等［23］以上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒為熒光顯示探針，結(jié)合磁性納米材料的磁分離富集作用實現(xiàn)了對沙門菌目標(biāo)DNA的高靈敏檢測，檢出下限達(dá)3 fmol/L，在0.01～10 pmol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。段諾等［24］也采建立了基于磁分離富集-核酸適配體識別-上轉(zhuǎn)換熒光納米探針方法，用于檢測鼠傷寒沙門菌（S. typhimurium）、金黃色葡萄球菌。檢測限分別為5 CFU/mL和8 CFU/mL，檢測線性范圍均為101～105CFU/mL。曲勍等［25］成功研制出用于檢測動物樣品中布魯氏菌（Brucella）的上轉(zhuǎn)換熒光免疫層析檢測技術(shù)，檢測限為5×106CFU/mL，靈敏度變化范圍為2.0×103～3.9×105CFU/mg。

郝民［26］利用UPNT的免疫層析法對水體中霍亂弧菌O1群與霍亂弧菌O139群全菌進(jìn)行定性和定量檢測。檢測結(jié)果表明，霍亂弧菌O1群與霍亂弧菌O139群的靈敏度分別為 1.69×104CFU/mL、1.24×104CFU/ mL，其線性范圍均為105～108CFU/mL。王燕［27］建立基于磁分離富集-上轉(zhuǎn)換熒光材料標(biāo)記的副溶血性弧菌免疫檢測方法。該方法檢測的最優(yōu)反應(yīng)時間為60 min，檢出限為103CFU/mL，在5×103～5×105CFU/mL范圍內(nèi)菌落數(shù)與熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。因此，UPNT在食源性致病菌檢測方面的應(yīng)用僅局限于大腸桿菌、沙門細(xì)菌、金黃色色葡萄球菌、霍亂弧菌和副溶血性弧菌等少數(shù)幾個菌種。

3.3農(nóng)藥和獸藥殘留的檢測

在農(nóng)作物的生產(chǎn)和禽畜動物類的養(yǎng)殖過程中通常會添加農(nóng)藥和獸藥。而農(nóng)藥和獸藥經(jīng)過動植物的代謝后，并不會完全消除，它們會隨著自然循環(huán)進(jìn)入到人體內(nèi)，對人體健康造成影響。長期食用低劑量農(nóng)藥超標(biāo)的農(nóng)副產(chǎn)品，可能引起人和動物的慢性中毒，甚至誘發(fā)癌癥，影響到下一代；而食用大量含高毒、劇毒農(nóng)藥殘留的食物會導(dǎo)致人、畜發(fā)生急性中毒事故。近年來，UPNT在農(nóng)藥、獸藥殘留的檢測方面仍然處于起步階段。

方聰聰［28］利用高溫?zé)峤鉄岱ê退疅崛軇岱ǎ苽涞玫搅藘煞N不同晶型的UCNPs，分別為NaYF4:Yb，Er與NaYF4:Yb，Tm，采用反相微乳法對所制備的UCNPs進(jìn)行SiO2包覆，制備了上轉(zhuǎn)換納米粒子。該方法檢測牛奶中土霉素（oxytetracycline），檢測限為0.036 ng/mL，濃度在0.05～100 ng/mL范圍內(nèi)。張旋旋［29］利用上轉(zhuǎn)換技術(shù)檢測蔬菜、果汁與水樣中烯啶蟲胺（nitenpyram）的殘留。運用水熱法合成 NaYF4:Er3+，Yb3+（OA-UCNPs），然后通過聚丙烯酸（polyacrylic acid，PAA）在高溫下配體交換對OA-UCNPs進(jìn)行表面羧基修飾與活化，形成水溶性的PAA-UCNPs。該方法檢測限為1 ng/mL，線性范圍為1～103ng/mL。

王喜亮等［30］采用上轉(zhuǎn)換發(fā)光顆粒標(biāo)記磺胺嘧啶（sulfadiazine，SD）單克隆抗體，利用磺胺嘧啶競爭物包被于硝酸纖維素層析膜上作為捕獲試劑，制成免疫層析試紙卡。該免疫層析試紙卡可以在15 min內(nèi)完成對磺胺嘧啶殘留的定量檢測。該方法在不同動物源性食品（雞肉、豬肉、牛奶、蝦）的檢測范圍為0.1～30 ng/ mL。相類似的，李麗波等［31］采用上轉(zhuǎn)換發(fā)光顆粒標(biāo)記恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）單克隆抗體，通過恩諾沙星競爭物包被于硝酸纖維素層析膜上作為捕獲試劑，制成免疫層析試紙卡。該免疫層析試紙卡可在15 min內(nèi)完成對恩諾沙星殘留的定量檢測。該方法檢測動物源性食品（豬肉、雞肉、蝦）中恩諾沙星的檢測范圍為0.5～50 ng/mL。

4　結(jié)語

總的來說，在食品安全檢測中運用UPNT可以提高檢測的靈敏度，得到穩(wěn)定的實驗結(jié)果，能更有效、更快速地檢測食品中的有害物質(zhì)。但目前UPNT在食品安全檢測中的應(yīng)用仍處于起步階段，主要集中在細(xì)菌毒素、真菌毒素、食源性微生物和化學(xué)殘留物質(zhì)方面的研究，對轉(zhuǎn)基因食品、食品中所含寄生蟲等檢測的研究則很少。此外，UPNT若要真正廣泛運用在食品安全檢測中，必須重點著手合成粒徑均一、可控、單分散的納米顆粒，改變納米顆粒表面疏水和不具活性基團(tuán)的性能，加強(qiáng)上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米技術(shù)與層析法的結(jié)合，才能夠使上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米技術(shù)在食品安全檢測的各領(lǐng)域得到更有效的開發(fā)和應(yīng)用。

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（責(zé)任編輯：王昌棟）

Progress on the application of upconversion fluorescence nanoparticles technology in food inspection

LIANG Zilu1，BI Shuilian2，HUANG Wanchun2
（1.College of Public Health，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.College of Food Science，Guangdong Pharmaceutical University，Zhongshan 528458，China）

Upconversion fluorescence nanoparticles technology（UPNT）has attracted increasing attention in recent years，because it owns unique advantages such as high detection sensitivity，high stability，easy operation，no damage to the sample，and no background fluorescence.This paper reviews luminescent materials，luminescent mechanisms，and the application of UFNT in food safety detection.

upconversion fluorescent nanoparticle technology；food safety；inspection

R155

A

1006-8783（2016）04-0541-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016031601

2016-03-16

國家自然科學(xué)基金資助項目（31401596）；廣東省科技計劃項目（2014A040401087、2016A020210132）；廣東省自然科學(xué)基金資助項目（S2013040013491）；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項目（B2014205）、廣東藥學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)培育項目

梁紫璐（1991—），女，2015級碩士研究生，Email:dxplzl@163.com；通信作者:畢水蓮（1982—），博士，副教授，主要從事食品質(zhì)量安全及檢測技術(shù)研究，Email:shuilianbi@foxmail.com。

網(wǎng)絡(luò)出版時間:2016-05-026 14:53 網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160526.1453.001.html