李 濤，程秀麗，黃文俊，閆 莉，曹濟(jì)民△，譚曉秋，△

Flag和GFP雙標(biāo)記的BKCa通道α亞基表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定和序列分析*

李 濤1，程秀麗2，黃文俊1，閆 莉2，曹濟(jì)民2△，譚曉秋1，2△

（1.四川醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)電生理學(xué) 省部教育部重點實驗室 ，四川省心血管疾病防治協(xié)同創(chuàng)新中心 ，瀘州646000；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所生理學(xué)系 ，北京100005）

目的:采用重疊PCR法構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒 ，為下一步研究通道功能奠定基礎(chǔ)。方法:在已有編碼大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（BKCa）通道α亞單位的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-hSlo的基礎(chǔ)上，采用重疊PCR法構(gòu)建Flag和GFP雙標(biāo)簽標(biāo)記的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Flag-hSlo-GFP（Flag-hSlo-GFP）。結(jié)果:構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒Flag標(biāo)簽插入BKCa通道的S1-S2胞外環(huán)，GFP標(biāo)簽連接BKCa通道的胞內(nèi)C末端，測序結(jié)果證實質(zhì)粒構(gòu)建成功。結(jié)論:成功構(gòu)建BK通道基因表達(dá)質(zhì)粒Flag-hSlo-GFP，重疊PCR能夠很好的用于長片段基因擴(kuò)增和插入片段的實驗。

大電導(dǎo)鈣激活鉀通道；重疊PCR；基因工程

【DOI】10.13459/j.cnki.cjap.2016.03.024

大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（large conductance calcium activated potassium channels，BKCa）又稱為 Slo、BK、KCa、KCa1.1或MaxiK通道，是細(xì)胞膜上重要的離子通道，在血管平滑肌上的表達(dá)尤為豐富。BKCa通道作為一種負(fù)反饋機(jī)制，對維持血管張力、調(diào)節(jié)血管功能起重要作用。異源表達(dá)離子通道在工具細(xì)胞如HEK293、CHO等，目前已成為研究離子通道功能活動和藥物篩選的主要方法之一。本研究旨在采用重疊PCR方法進(jìn)行含標(biāo)簽的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，為下一步研究BKCa通道蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)過程以及功能活性奠定基礎(chǔ)，同時探討其在長片段基因的擴(kuò)增和插入片段中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

主要試劑包括膠回收試劑盒（北京天根）、質(zhì)粒提取試劑盒（北京天根）、PCR反應(yīng)試劑（寶生物生物科技）、限制性內(nèi)切酶（寶生物生物科技）、瓊脂糖粉（Biowest公司）、LB培養(yǎng)基（上海生工），大腸桿菌DH5α（碧云天）、DNA Marker（碧云天）和連接反應(yīng)試劑（Promega公司），其余試劑為國產(chǎn)分析純。主要實驗儀器有PCR儀（ABI公司）、紫外分光光度儀（Nanodrop公司）和離心機(jī)（Eppendorf公司）。

1.2 方法

本實驗旨在已有編碼人血管平滑肌BKCa通道α亞單位的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-hSlo的基礎(chǔ)上，構(gòu)建Flag和GFP雙標(biāo)簽標(biāo)記的BKCa通道表達(dá)質(zhì)粒FlaghSlo-GFP。其中Flag標(biāo)簽的氨基酸序列為:DYKDDDDK，擬將其插入BKCa通道S1與S2跨膜序列的胞外側(cè)連接處，插入后的氨基酸序列為:SNPIESDYKDDDDKCQNFYKDF。構(gòu)建Flag標(biāo)簽的目的是用于檢測BKCa通道蛋白在細(xì)胞膜上的表達(dá)水平。GFP標(biāo)簽連接于BKCa通道胞內(nèi)的C末端，用于檢測BKCa通道蛋白在細(xì)胞整體的表達(dá)水平。本實驗的基因克隆在表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-hSlo（丹麥Philip K.Ahring教授友情饋贈）的基礎(chǔ)上，進(jìn)行重疊PCR法和酶切連接完成的。引物序列見表1所示，引物由Invitrogen公司合成。

Tab.1 Primer for Overlapping PCR

Flag標(biāo)簽插入pcDNA3.1-hSlo的具體步驟和實驗流程如下所示:（1）將Flag（紅色）插入到含有酶切位點Hind III和EcoR I的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-hSlo（藍(lán)色）S1與S2胞外環(huán)的位點（圖1A）。以質(zhì)粒pcDNA3.1-hSlo為模板，分段擴(kuò)增包含有部分BKCa通道和Flag標(biāo)簽的片段1和片段2（圖1B）；（2）以片段1和片段2的混合片段為模板，使用片段1的上游引物和片段2的下游引物，進(jìn)行重疊PCR反應(yīng)得到包含有Flag的BKCa通道片段3（圖1C）；（3）選擇酶切位點EcoR I和Hind III，采用雙酶切法酶切質(zhì)粒pcDNA3.1-hSlo和片段3后，然后進(jìn)行T4連接反應(yīng)，將連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化就得到含有Flag標(biāo)簽的BKCa通道表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Flag-hSlo（圖1D，圖1見彩圖頁Ⅵ）。

在此基礎(chǔ)上，采用限制性內(nèi)切酶的方法將GFP（綠色）插入表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Flag-hSlo（藍(lán)色）的胞內(nèi) C末端。以 pcDNA3.1-Flag-hSlo為模板（圖2A），PCR擴(kuò)增得到含有BKCa通道C末端序列和EcoR I、BamH I酶切位點的片段1。在擴(kuò)增片段1時，由于構(gòu)建GFP融合蛋白，所以去掉原來編碼BKCa通道的終止密碼子TGA，增加GCG堿基序列以便于酶切和連接反應(yīng)。以質(zhì)粒pEGFP-N1（含有GFP序列）為模板，PCR擴(kuò)增得到的含有完整GFP序列和BamH I、Xba I酶切位點的片段2（圖2B）。分別將片段1、片段2和質(zhì)粒pcDNA3.1-Flag-hSlo進(jìn)行雙酶切，即片段1使用EcoR I和BamH I，片段2使用BamH I和Xba I，質(zhì)粒pcDNA3.1-Flag-hSlo使用EcoR I和Xba I。然后將酶切后的片段1和片段2連接到含有Flag標(biāo)簽的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Flag-hSlo（圖2C，圖2見彩圖頁Ⅵ）。將連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切鑒定，測序。測序正確的質(zhì)粒進(jìn)行下一步實驗。

PCR反應(yīng)體系、酶切反應(yīng)體系和連接反應(yīng)體系都是根據(jù)試劑公司推薦的實驗條件進(jìn)行。PCR反應(yīng)的退火溫度見表1，酶切反應(yīng)為37℃水浴過夜，連接反應(yīng)為16℃水浴過夜。轉(zhuǎn)化步驟按照碧云天大腸桿菌DH5α說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 Flag標(biāo)簽插入質(zhì)粒pcDNA3.1-hSlo以及pcDNA3.1-Flag-hSlo質(zhì)粒酶切鑒定

使用PCR分別得到含有部分BKCa通道和Flag標(biāo)簽的片段1和片段2，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖3A所示，目標(biāo)條帶位置與預(yù)測大小基本一致。然后以這兩個片段為模板，使用重疊PCR方法得到片段3后，F(xiàn)lag標(biāo)簽插入BKCa通道S1-S2之間，同時還含有EcoR I與Hind III酶切位點，片段3條帶大小約1 000 bp，電泳條帶位置符合預(yù)期（圖3B）。質(zhì)粒pcDNA3.1-hSlo雙酶切后，與片段3進(jìn)行連接反應(yīng)，得到含有Flag標(biāo)簽的質(zhì)粒pcDNA3.1-Flag-hSlo。得到的質(zhì)粒首先經(jīng)過EcoR I與Hind III雙酶切鑒定，結(jié)果如圖3C所示，經(jīng)EcoR I與Hind III雙酶切之后能夠得到一約1 000 bp左右的目的條帶。

Fig.3 Electrophoresis of overlapping PCR productsA:Electrophoresis of PCR products of Fragment 1 and Fragment2；B:Fragment3 was obtained by overlapping PCR；C: Digestion electrophoresis of the pcDNA3.1-Flag-hSlo plasmid；Lane 1:Double digestion by EcoR I and Hind III；Lane 2: Without digestion；M:Marker

2.2 GFP標(biāo)簽插入pcDNA3.1-Flag-hSlo質(zhì)粒以及Flag-hSlo-GFP質(zhì)粒酶切鑒定

采用引入一個酶切位點BamH I的方法，將GFP插入pcDNA-Flag-hSlo質(zhì)粒BKCa通道的C末端。通過三個酶切位點EcoR I，BamH I，Xba I將GFP連接到C末端，得到含有Flag和GFP雙標(biāo)簽融合標(biāo)記的BKCa通道表達(dá)質(zhì)粒Flag-hSlo-GFP。第一步即為得到含有EcoR I和BamH I酶切位點的片段1，含有BamH I和Xba I酶切位點的片段2，兩個片段的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果（圖4A）分別在預(yù)測位置附近有明顯的條帶。將片段1、片段2和pcDNA3.1-Flag-hSlo質(zhì)粒進(jìn)行相應(yīng)的雙酶切后，三個酶切片段進(jìn)行連接，得到含有Flag和GFP雙標(biāo)簽標(biāo)記的質(zhì)粒Flag-hSlo-GFP。質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定（圖4B）所示，F(xiàn)lag-hSlo-GFP質(zhì)粒經(jīng)BamH I和Xba I雙酶切的結(jié)果，可見一約700 bp的條帶，推測為插入的GFP片段。質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和BamH I雙酶切的結(jié)果，可見約2 500 bp左右的條帶，推測為片段1，但存在一定的非特異性條帶。泳道3為未進(jìn)行酶切的質(zhì)粒電泳圖，可見位置較實際大小更靠前，推測質(zhì)粒主要為超螺旋結(jié)構(gòu)，表明質(zhì)粒結(jié)構(gòu)未被破壞，質(zhì)量較好。

Fig.4 Electrophoresisof Flag-hSlo-GFPA:Electrophoresis of PCR products of Fragment 1 and Fragment2；B:Digestion electrophoresisof the plasmid Flag-hSlo-GFP；Lane 1:Double digestion by BamH Iand Xba I；Lane 2:Double digestion by BamH Iand EcoR I；Lane 3:Without digestion；M:Marker

2.3 Flag-hSlo-GFP質(zhì)粒測序結(jié)果

測序結(jié)果顯示:Flag插入BKCa通道的S1-S2胞外環(huán)（圖5B），GFP標(biāo)簽連接與BKCa通道的胞內(nèi)C末端（圖5C）。

Fig.5 Structure diagram and sequencing results of the plasmid Flag-hSlo-GFPA:Structure diagram of BKCa channelwith the labels of flag and GFP；B:Sequencing results of S1-S2 extracellular loop，inwhich the sequencemarked red is the flag label；C:Sequencing resultsof C terminal containing restriction sitesBamH Iand Xba I

3 討論

重疊PCR技術(shù)由于采用具有互補(bǔ)末端的引物，使第一輪PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在第二輪PCR反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴(kuò)增片段重疊連接起來［1］。此技術(shù)不需要限制性內(nèi)切酶的消化和連接酶的處理，在基因的定點突變、融合基因的構(gòu)建、長片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的擴(kuò)增等方面有其廣泛而獨特的應(yīng)用［2］。

為研究BKCa通道蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過程，本研究構(gòu)建Flag與GFP雙標(biāo)記的BKCa通道a亞單位表達(dá)質(zhì)粒Flag-hSlo-GFP，其中Flag插于胞外環(huán)S1-S2之間，GFP連接于C末端。文獻(xiàn)報道跨膜序列之間的連接片段在通道蛋白細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮著重要的作用［3］。因此，本研究選擇一個較小的標(biāo)簽Flag，由八個氨基酸（DYKDDDDK）組成［4］，插入到S1-S2之間，最大限度減少插入位點對BKCa通道結(jié)構(gòu)的影響。目前直接針對BKCa通道胞外抗體的特異性和親和力較差，不能準(zhǔn)確和有效反映通道蛋白在細(xì)胞膜上的表達(dá)。插入Flag的好處在于針對標(biāo)簽的抗體特異性和親和力要比針對直接通道胞外環(huán)的抗體特異性要高很多，更能準(zhǔn)確的研究BKCa通道在細(xì)胞膜上的表達(dá)水平。因此，采用Flag標(biāo)簽抗體研究蛋白定位和表達(dá)時，比直接使用目的蛋白的抗體陽性率、準(zhǔn)確性均有明顯提高，同時還能降低研究的科研成本。

在BKCa通道C末端連接一個GFP標(biāo)簽，插入GFP標(biāo)簽的優(yōu)勢是可以直接使用熒光或激光共聚焦顯微鏡或活細(xì)胞工作站觀察活細(xì)胞BKCa通道蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)過程和機(jī)制。并且，已經(jīng)有文獻(xiàn)報道在BKCa通道C末端連接GFP對通道電壓依賴性、鈣離子敏感性以及向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)沒有明顯的影響［5］。

綜上所述，F(xiàn)lag和GFP標(biāo)簽并不影響B(tài)KCa通道的基本電生理特性，包括大電導(dǎo)特性和通道動力學(xué)特征等，同時使用Flag標(biāo)簽?zāi)軌蚝芎玫臋z測通道在膜上的表達(dá)。因此，使用Flag-hSlo-GFP表達(dá)質(zhì)粒有以下幾方面的優(yōu)勢:（1）通道融合有GFP蛋白，可以直接使用熒光顯微鏡觀察活細(xì)胞BKCa通道蛋白的定位、分布和轉(zhuǎn)運(yùn)軌跡等，實現(xiàn)實時、動態(tài)的研究BKCa通道蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。（2）該質(zhì)粒S1-S2胞外的連接有Flag標(biāo)簽，可以方便的使用抗Flag抗體準(zhǔn)確的檢測BKCa通道蛋白在膜上的表達(dá)，并且結(jié)合能夠代表BKCa通道總體表達(dá)的GFP熒光強(qiáng)度，從而可以使用流式細(xì)胞術(shù)、共聚焦顯微成像技術(shù)準(zhǔn)確地研究細(xì)胞膜上通道的表達(dá)量與整體表達(dá)量之間的比例，從而反映通道蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)效率。因為單純的細(xì)胞膜上表達(dá)的高低是不能準(zhǔn)確反映通道蛋白在細(xì)胞膜上的表達(dá)是促進(jìn)還是抑制的過程。（3）Flag和GFP標(biāo)記的Flag-hSlo-GFP質(zhì)粒不影響B(tài)KCa通道的電導(dǎo)及動力學(xué)等電生理特性，因此可以采用該質(zhì)粒，結(jié)合配套的熒光顯微鏡膜片鉗系統(tǒng)，研究BKCa通道的電生理特性及其藥物作用機(jī)制，大大提高實驗效率并簡化篩選穩(wěn)定表達(dá)克隆的過程。

綜上，表達(dá)質(zhì)粒 Flag-hSlo-GFP不僅可以用于BKCa通道的電生理學(xué)及調(diào)控研究，同時也可以作為研究BKCa通道蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的很好工具。其表達(dá)質(zhì)粒在BKCa通道蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的研究具有明顯的特點和應(yīng)用價值，為以后的研究奠定基礎(chǔ)。

［1］譚曉秋，陳桂蘭，李 濤，等.重疊PCR法構(gòu)建人心房肌SK2（KCNN2）基因表達(dá)質(zhì)粒及鑒定和序列分析［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2012，28（4）:381-384.

［2］王 峰，程海霞，袁冬清，等.重疊PCR法構(gòu)建XLRS1三種不同類型突變體［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，12（16）:3068-3070.

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Construction and identification of BKCaαsubunit exp ression plasm id w ith double labeling of Flag and GFP

LITao1，CHENG Xiu-li2，HUANGWen-jun1，YAN Li2，CAO Ji-min2△，TAN Xiao-qiu1，2△
（1.Key Laboratory of Medical Electrophysiology of Ministry of Education，Collaborative Innovation Center for Prevention and Treatment of Cardiovascular Disease/Institute of Cardiovascular Research，Sichuan Medical University，Luzhou 646000；2.Department of Physiology，Institute of Basic Medical Sciences，Chinese Academy of Medical Sciences，School of Basic Medicine，Peking Union Medical College，Beijing 100005，China）

【ABSTRACT】Objective:This study aimed to constructa large conductance calcium activated potassium channelα（BKCa）subunitplasmid with two tags by the overlapping PCR technique to setup a steady base for future ion channel study.Methods:Based on the existing coding BKCa channelαsubunitexpression plasmid pcDNA3.1-hSlo，we constructed a double-tag expression plasmid，namely，pcDNA3.1-Flag-hSlo-GFP（Flag-hSlo-GFP）.Results:Flag tagwas inserted into the S1-S2 extracellular loop of BKCa channelαsubunit，and GFP tagwas connected to the C-terminusof BKCa channelαsubunit.Sequence of the constructed plasmidwas confirmed successful.Conclusion:The expression plasmid Flag-hSlo-GFPwas constructed successfully with overlapping PCR.Overlapping PCR is a valuablemethod for amplifying long size genes.

large conductance calcium activated potassium channels； overlapping PCR； gene cloning

R34

A

1000-6834（2016）03-279-04

國家自然科學(xué)基金資助項目（31300948）；瀘州市-四川醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合資助項目（2015LZCYD-S03）

2015-06-29

2016-01-25

Tel:13982765332；E-mail:caojimin@126.com，tanxiaoqiu1981@163.com