劉鵑,康剛勁,康海軍,白夢天,蔣燕,韓茜

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院眼科,四川瀘州646000）

槲皮素對(duì)糖尿病大鼠晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響＊

劉鵑,康剛勁,康海軍,白夢天,蔣燕,韓茜

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院眼科,四川瀘州646000）

目的:探討槲皮素對(duì)糖尿病大鼠晶狀體上皮細(xì)胞（lens epithelial cells,LECs）凋亡的影響及機(jī)制。方法:將60只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、糖尿病組、槲皮素組，每組20只。糖尿病組、槲皮素組采用鏈脲佐菌素（streptozotocin,STZ）誘導(dǎo)制作糖尿病性白內(nèi)障模型，糖尿病組和對(duì)照組予以常規(guī)飼料喂養(yǎng)，槲皮素組則予以50mg/kg/d槲皮素灌胃治療。STE注射后4周、8周、12周檢測大鼠血糖，觀察大鼠晶狀體混濁程度，HE染色觀察大鼠晶狀體上皮細(xì)胞，免疫組織化學(xué)檢測大鼠LECs Bcl-2和Bax的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠LECs凋亡率。結(jié)果:12周時(shí)糖尿病組、槲皮素組大鼠體重明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），糖尿病組大鼠體重與槲皮素組之間無明顯差異（P＞0.05）。STZ注射后4周時(shí)、8周時(shí)、12周時(shí)對(duì)照組與糖尿病組、槲皮素組血糖比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），糖尿病組與槲皮素組血糖比較無明顯差異（P＞0.05）。STZ注射后4周時(shí)、8周、12周時(shí)對(duì)照組、糖尿病組、槲皮素組大鼠晶狀體混濁程度兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。HE結(jié)果顯示糖尿病組、槲皮素組均可見LECs形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)疏松，染色淡，后囊區(qū)晶狀體纖維細(xì)胞見大量未被降解的細(xì)胞器。與對(duì)照組比較，糖尿病組和槲皮素組大鼠LECs Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)增加，兩組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與槲皮素組比較，糖尿病組大鼠LECs Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)增加，兩組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。STZ注射后4周、8周、12周時(shí)，各組之間LECs凋亡率兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論:槲皮素對(duì)糖尿病大鼠LECs凋亡有一定的抑制作用，可延緩糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展。

槲皮素；細(xì)胞凋亡；晶狀體上皮細(xì)胞；糖尿病性白內(nèi)障；Bcl-2；Bax

1 材料與方法

1.1 材料與分組

SD大鼠購自西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，散瞳后經(jīng)數(shù)碼裂隙燈顯微鏡檢查晶狀體透明、完整，體重150～180 g。60只SD大鼠隨機(jī)抽取20只為正常對(duì)照組，剩余大鼠成功造糖尿病模型后隨機(jī)分為糖尿病模型組和槲皮素干預(yù)組，每組20只。槲皮素購自華越洋生物公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin,STZ）和戊巴比妥鈉購自美國Sigma公司；兔抗大鼠Bcl-2和Bax多克隆抗體購自美國Bioworld進(jìn)口分裝；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；其余試劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型的建立與槲皮素干預(yù)

一次性腹腔注射STZ 65 mg/kg誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，72 h后尾靜脈取血，空腹血糖≥16.7 mmol/L時(shí)為糖尿病造模成功,納入實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組予以常規(guī)飼料喂養(yǎng)。糖尿病組和槲皮素組，STZ注射后第4 d開始槲皮素組大鼠予以槲皮素50 mg/kg/d灌胃。每周稱重一次，調(diào)整槲皮素用量。分別于STE注射后4周、8周各組隨機(jī)斷髓處死5只大鼠，共30只，12周末處死剩余30只。

1.2.2 觀察大鼠晶狀體混濁情況

使用復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳后，予以大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，分別于4周、8周、12周時(shí)用數(shù)碼裂隙燈顯微鏡對(duì)晶狀體混濁情況進(jìn)行觀察、記錄、拍照，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照Bahmani F等對(duì)晶狀體混濁分級(jí)，共分為5級(jí)[2]：Ⅰ級(jí)：晶狀體無混濁；Ⅱ級(jí)：晶狀體輕度混濁，周邊部出現(xiàn)空泡改變；Ⅲ級(jí)：晶狀體中度混濁，周邊部空泡向中心區(qū)域擴(kuò)展，核出現(xiàn)霧狀混濁；Ⅳ級(jí)：晶狀體高度混濁，周邊空泡擴(kuò)展到核區(qū)，核霧狀混濁加重；Ⅴ級(jí)：晶狀體全混濁，發(fā)展為完全白內(nèi)障。

“昆北”去聲字“媚”唱調(diào)（《鐵冠圖·刺虎》【滾繡球】“俺佯嬌假媚”，787）。該單字唱調(diào)的過腔是。其中即第一節(jié)級(jí)音性過腔，即第二節(jié)級(jí)音性過腔，為第三節(jié)級(jí)音性過腔。這個(gè)過腔即為“主調(diào)+級(jí)音+級(jí)音”兩種不同音樂材料組合而成的多節(jié)型過腔。

1.2.3 HE染色

將石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化；蘇木素染色，蒸餾水沖洗至水變清；1%鹽酸乙醇分化30 s，褪色至紅色，蒸餾水過洗至恢復(fù)藍(lán)色；0.5%伊紅液染色2 min，蒸餾水沖洗；梯度酒精脫水、二甲苯透明；中性樹膠、蓋玻片封片。光學(xué)顯微鏡下觀察、攝片。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色檢測大鼠LECs Bcl-2、Bax表達(dá)情況

切片脫蠟后放在3%H2O2室溫避光孵育10 min，PBS沖洗；切片置于染色架上，再放入0.01 mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液容器中，加熱至沸騰，15 min后取出容器，室溫冷卻30 min，PBS沖洗；滴加1滴5%BSA封閉游離結(jié)合位點(diǎn)，室溫孵育30 min后棄去血清；滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗（1∶100），在4℃冰箱中過夜，PBS沖洗；滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記的二抗（1∶10），37℃水浴箱孵育30 min，PBS沖洗；滴加適當(dāng)比例稀釋的HRP標(biāo)記的鏈霉親和素，37℃孵育30 min，PBS沖洗；加新鮮配制的DAB顯色，顯微鏡觀察控制染色時(shí)間，見黃褐色斑時(shí)放入雙蒸水中終止顯色；自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化，自來水沖洗；梯度酒精脫水，二甲苯透明；中性樹膠、蓋玻片封片；放入60℃烘箱中烤干，光學(xué)顯微鏡下觀察攝片。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

將摘除的晶狀體用平衡液沖洗干凈后，在顯微鏡下從赤道部環(huán)形撕取晶狀體前囊膜，消化后用300目濾網(wǎng)制備成單細(xì)胞懸液；轉(zhuǎn)移細(xì)胞至離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌2次；加入預(yù)冷的結(jié)合緩沖液，調(diào)整細(xì)胞密度為1× 106/mL；按照Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書加入Annexin V-FITC液5 uL和PI 10 uL，輕輕充分混勻，室溫（20°C～25°C）避光染色15 min；PBS洗滌多余染料后，在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用x±s表示。多個(gè)樣本均數(shù)之間比較采用單因素方差分析（ONE-WAY AONVA），兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。等級(jí)資料等級(jí)秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠晶狀體混濁程度

各組大鼠晶狀體混濁情況，見表1。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)照組始終保持晶狀體透明、完整。STZ注射后4周糖尿病組、槲皮素組大鼠均開始出現(xiàn)不同程度的晶狀體混濁，且晶狀體混濁程度隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)行逐漸加重。8周時(shí)，糖尿病組大鼠晶狀體混濁程度較槲皮素組重。12周時(shí)，糖尿病組大鼠全部出現(xiàn)不同程度的晶狀體混濁，槲皮素組大鼠晶狀體混濁發(fā)展速度及混濁程度均較糖尿病組輕，實(shí)驗(yàn)結(jié)束仍未見1只晶狀體發(fā)生Ⅴ級(jí)改變。4周、8周、12周時(shí)三組間晶狀體混濁情況兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 在各時(shí)間點(diǎn)各組大鼠晶狀體混濁程度（單位：只）

2.2 大鼠晶狀體HE染色

對(duì)照組LECs形態(tài)規(guī)則，分布均勻，相鄰細(xì)胞及與晶狀體囊膜緊密結(jié)合，細(xì)胞核呈橢圓形，染色質(zhì)均勻無凝縮，晶狀體纖維細(xì)胞未見異常。而在糖尿病組、槲皮素組均可見LECs形態(tài)不規(guī)則，多呈扁平狀或柱狀，胞質(zhì)疏松，染色淡，可見空泡，細(xì)胞核縮小，核內(nèi)染色質(zhì)不均勻、濃縮，后囊區(qū)晶狀體纖維細(xì)胞見大量未被降解的細(xì)胞器，見圖1。

圖1 各組晶狀體HE染色（×200）

2.3 大鼠晶狀體上皮細(xì)胞Bcl-2、Bax表達(dá)情況

各組大鼠LECs Bcl-2、Bax表達(dá)情況。光學(xué)顯微鏡下觀察陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)中見黃色或棕黃色顆粒，否則為陰性。陽性細(xì)胞率=5個(gè)視野內(nèi)陽性細(xì)胞總數(shù)／5個(gè)視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)×100%，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行觀察及記錄陽性細(xì)胞率。規(guī)定陽性表達(dá)率：0%為陰性（-）；1%～25%為弱陽性（+）；26%～50%為陽性（++）；＞50%為強(qiáng)陽性（+++）。正常大鼠LECs均表達(dá)少量的Bcl-2、Bax，胞漿內(nèi)均可見少量棕黃色顆粒。STZ注射后4周、8周、12周時(shí)槲皮素組Bcl-2蛋白的陽性表達(dá)較糖尿病組增強(qiáng)（P＜0.05），但較對(duì)照組下降（P＜0.05），同一時(shí)間點(diǎn)槲皮素組Bax蛋白的表達(dá)較糖尿病組下降（P＜0.05），但較對(duì)照組增強(qiáng)（P＜0.05）。見圖2、3，表2、3。

圖2 免疫組化顯示Bcl-2的表達(dá)（×200）

表2 各組大鼠晶狀體上皮細(xì)胞Bcl-2表達(dá)情況（n=5）

表3 各組大鼠晶狀體上皮細(xì)胞Bax表達(dá)情況（n=5）

2.4 大鼠晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率

各組大鼠LECs凋亡情況，STE注射后4周、8周、12周時(shí)糖尿病組大鼠LECs的凋亡率顯著高于對(duì)照組，而槲皮素組細(xì)胞凋亡率較糖尿病組顯著降低，但仍高于對(duì)照組。各時(shí)間點(diǎn)三組之間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）,見表4。

表4 各組大鼠晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率（%）

圖3 免疫組化顯示Bax的表達(dá)（×200）

3 討論

糖尿病病人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展是多種因素綜合作用的結(jié)果，糖尿病最早攻擊LECs，LECs能自主發(fā)生凋亡并可自我調(diào)節(jié)來抑制過度凋亡，而在高血糖刺激下產(chǎn)生的高氧化、高滲透壓等將破壞LECs凋亡與增殖的平衡，從而引起LECs過度凋亡，并由此釋放一系列物質(zhì)產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，如Ca2+流入、半胱氨酸酶激活、晶狀體蛋白變性、細(xì)胞骨架降解、水和電解質(zhì)滲入等，晶狀體的穩(wěn)定性破壞，內(nèi)壞境代謝失衡，最終導(dǎo)致白內(nèi)障發(fā)生[1-3]。

槲皮素可通過抑制LECs的凋亡過程而對(duì)晶狀體發(fā)揮保護(hù)作用。研究表明[4]槲皮素可明顯降低老年性白內(nèi)障的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。紫外線誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是通過LECs DNA氧化性損傷引起的，槲皮素則可以在細(xì)胞遭受紫外線輻射前或后起到輻射防護(hù)的作用。Yao等[5]發(fā)現(xiàn)，紫外照射體外培養(yǎng)的LECs會(huì)誘導(dǎo)目標(biāo)分子如p38蛋白、JNK蛋白的磷酸化，激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，MAPK家族等信號(hào)通路的活化，從而誘發(fā)LECs凋亡。Michael等[6]對(duì)大鼠晶狀體紫外線照射發(fā)現(xiàn)，當(dāng)LECs受到的損傷超過自我調(diào)節(jié)的能力時(shí)，細(xì)胞就會(huì)發(fā)生凋亡。Cao等[7]在觀察DMSO和槲皮素共同作用于LECs的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，0.1 umol/L濃度的槲皮素可一定程度上抑制DMSO對(duì)LECs的破壞。Milackova I等[8]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，大鼠晶狀體在高糖中處理后，槲皮素衍生物可顯著降低山梨糖醇的含量，認(rèn)為槲皮素可能對(duì)高糖誘導(dǎo)的人LECs的凋亡有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，同一時(shí)間點(diǎn)糖尿病組晶狀體混濁程度均明顯高于對(duì)照組，槲皮素組又輕于糖尿病組。并且糖尿病組LECs凋亡率明顯高于對(duì)照組，而槲皮素組較糖尿病組低。表明隨著糖尿病性白內(nèi)障病情加重，LECs凋亡增加，予以槲皮素干預(yù)治療糖尿病大鼠后，LECs凋亡程度降低，證實(shí)槲皮素在一定程度上可抑制LECs凋亡的發(fā)生發(fā)展。

Bcl-2家族是最早研究的凋亡相關(guān)基因，Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡，Bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2和Bax是主要的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白，Bcl-2與Bax的比值決定著細(xì)胞的存亡，其它一切凋亡相關(guān)基因?qū)?xì)胞凋亡的作用都取決于Bcl-2與Bax比值的變化。因此，Bcl-2/Bax是目前細(xì)胞凋亡研究的熱點(diǎn)之一，在細(xì)胞凋亡中決定細(xì)胞存活與凋亡的方向[9]。它們主要通過線粒體途徑進(jìn)行細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，Bcl-2主要在線粒體外膜執(zhí)行功能，對(duì)于維持膜完整性起重要作用，而Bax破壞膜完整性。當(dāng)細(xì)胞收到凋亡信號(hào)，被置換出來的Bax使線粒體膜通透性增加，促凋亡蛋白如cyt-c等及一些細(xì)胞因子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，引起細(xì)胞凋亡。在此過程中Bcl-2和Bax以同/異二聚體的形式參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。當(dāng)受到某種刺激（槲皮素干預(yù)）時(shí)，Bcl-2增多，將與Bax形成異二聚體，妨礙Bax之間形成同二聚體而使Bax減少，細(xì)胞免于凋亡；相反，若Bax增多，Bax形成同二聚體增多，細(xì)胞發(fā)生凋亡。有研究報(bào)道，轉(zhuǎn)染Bcl-2能抑制如藥物、加熱、輻射等誘因引起的多種細(xì)胞凋亡[10]。Mao等[11]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Bcl-2通過減少β-晶狀體蛋白，減弱H2O2誘導(dǎo)的兔LECs的凋亡。并且有研究證明[12]，蘆丁可下調(diào)Bax表達(dá)，上調(diào)Bcl-2表達(dá)，保護(hù)晶狀體上皮細(xì)胞。已有研究者認(rèn)為[13]，Bax在硅油眼中對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡起至關(guān)重要的作用。有研究者認(rèn)為，通過改變Bcl-2/Bax的比值可能抑制糖尿病大鼠晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病組與對(duì)照組比較，Bcl-2降低，Bax升高，表明Bcl-2和Bax的改變在糖尿病性白內(nèi)障發(fā)生過程起重要作用，能起到調(diào)節(jié)LECs凋亡的作用。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化檢測Bcl-2、Bax發(fā)現(xiàn)，高糖可引起晶狀體上皮細(xì)胞凋亡。槲皮素組與糖尿病組比較，Bcl-2降低及Bax升高幅度更小，提示槲皮素通過引起B(yǎng)cl-2和Bax的改變來抑制晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，槲皮素對(duì)糖尿病大鼠LECs凋亡有一定的抑制作用，可延緩糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展，作用機(jī)制可能是通過降低Bax的表達(dá)，增強(qiáng)Bcl-2的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。但槲皮素難溶于水，不利于機(jī)體吸收及利用，其溶劑的毒性也將限制其應(yīng)用，如二甲基亞砜可導(dǎo)致溶血、肝腎毒性等，最近有將生物可降解的微粒與槲皮素共同制備成膠囊，不僅增加其吸收，還可延長槲皮素的釋放周期；槲皮素對(duì)晶狀體保護(hù)作用的研究尚不完善，確切的有效濃度、最大濃度、組織毒性等尚無定論；大部分研究仍處于臨床前階段，要廣泛用于臨床還需進(jìn)一步在作用濃度、組織毒性、作用途徑、劑型等方面進(jìn)行探索和研究。

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（2016-05-30收稿）

Apoptotic effect of quercetin on len epithelial cells in diabetic rats

Liu Juan,Kang Gangjin,Kang Haijun,Bai Mengtian,Jiang Yan,Han Qian
Department of Ophthalmology，the Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan Province 646000,China

Quercetin;Cell apoptosis;Lens epithelial cells;Diabetic cataract;Bcl-2;Bax

R776.1

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.06.017

*西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院國際合作課題（2011-43）

劉鵑（1988-），女，碩士，住院醫(yī)師

康剛勁（1968-），女，碩士，教授。E-mail:929460414@qq.com

Astract Objective：To explore the apoptotic effect and the underlying molecular mechanism of quercetin on len epithelial cells in diabetic rats induced by STZ.Methods：60 SD rats were randomly divided into normal control group,diabetic model group and QUE treatment group,with 20 in each group.The rats in control group were maintained normally,and the other 40 rats were given intraperitoneal injection of 1%Stretozocin（STZ）to induce the diabetic cataract rats.The model group was maintained normally,and QUE group was given 50 mg/kg QUE by gavage every day.At 4,8,and 12 weeks after STZ injection,the blood glucose level was measured,the changes of lens opacity were evaluated,the morphology of LECs was observed by HE staining,the expression of Bcl-2 and Bax in LECs were analyzed by immunohistochemical,and the apoptotic ratio of LECs was measured by flow cytometry.Results：At 12 weeks,the average body weight in the model group and QUE group was significantly lower than that of control group（P＜0.05）,whereas there was no statistical difference between model group and treatment group（P＞0.05）.At 4，8，and 12 weeks,the blood glucose level in the model group and QUE group was significantly higher than in the control group（P＜0.05）,whereas there was no statistical difference between model group and treatment group（P＞0.05）.The degree of len opacity after STZ at 4th,8th,and 12th week was statistical different among groups（P＜0.05）,with the QUE group severer than control group（P＜0.05）and model group severer than QUE group（P＜0.05）.HE results showed that LECs were irregular in morphology, loose and lightly stained in cytoplasm,contained many non-degraded organelles in the fibroblasts of the posterior capsule in both model group and treatment group.Compared with the control group,the protein expression of Bcl-2 in the model group and QUE group was reduced and the protein expression of Bax was up-regulated（P＜0.05）. Compared with the QUE group,the protein expression of Bcl-2 in the model group was reduced and the protein expression of Bax was up-regulated（P＜0.05）.At 4,8 and 12 weeks,the differences of the apoptotic rate in each group were statistically significant between any two groups（P＜0.05）.Conclusion：QUE can inhibit LECs apoptosis and delay the occurrence and the development of diabetic cataract in diabetic rats.