姚菊芳， 華征宇， 王 斌， 孫志鍇， 戴慧莉（上海交通大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院， 上海 200127）

近交系侏儒大鼠的培育及其主要生物學(xué)特性測(cè)定

姚菊芳， 華征宇， 王 斌， 孫志鍇， 戴慧莉
（上海交通大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院， 上海 200127）

目的 建立侏儒大鼠近交系 。 方法 選擇Wistar大鼠群中出現(xiàn)的疑似侏儒癥突變動(dòng)物，采用“全同胞兄妹交配”培育和維持，測(cè)定分析其各年齡段生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖性能、臟器重量、血液生理（12項(xiàng)）生化（12項(xiàng)）等主要指標(biāo)，作為品系參考值，并與原種Wistar大鼠進(jìn)行比較。 結(jié)果 至2016年2月， 侏儒大鼠實(shí)現(xiàn)連續(xù)近交達(dá)22～23代，品系暫時(shí)命名為“侏儒大鼠”（SDWR）。SDWR幼年、青年及成年體質(zhì)量分別僅為相應(yīng)年齡段Wistar的45.7%， 37.5%， 36.2%（♂）和49.7%， 41.7%，40.3%（♀）（P＜0.01）； SDWR青年期體長(zhǎng)、尾長(zhǎng)分別僅為Wistar大鼠的77.5%、72.3%（♂）和73.8%、68.9%（♀）（P＜0.01），即隨年齡增長(zhǎng)SDWR與原種Wistar體質(zhì)量和體尺差異顯著增加。SDWR青年及成年期主要臟器（心、肝、脾、肺、腎、睪丸/輸卵管）重量顯著低于同年齡Wistar大鼠（P＜0.01）。SDWR主要繁殖性能（產(chǎn)仔數(shù)、窩重、離乳率）均顯著低于原種Wistar大鼠（P＜0.01）。血液生理生化主要指標(biāo)SDWR與Wistar差異不明顯。 結(jié)論 通過(guò)長(zhǎng)期近交培育成的SDWR在生長(zhǎng)發(fā)育、體尺、繁殖性能、臟器重量等方面均明顯體現(xiàn)侏儒癥狀，并能穩(wěn)定遺傳。

侏儒癥； 近交系； 侏儒大鼠（SDWR）； 體質(zhì)量； 體尺； 臟器重； 血液生理生化

人類(lèi)侏儒癥（Dwarfism）主要是由基因引起的疾病，會(huì)導(dǎo)致身材矮小和骨骼不成比例生長(zhǎng)。盡管任何一對(duì)夫妻都有可能生下一個(gè)侏儒的孩子，但侏儒夫妻有80%的機(jī)會(huì)生下與他們一樣癥狀的后代。除了侏儒癥狀，一些患者還伴有心臟和呼吸系統(tǒng)疾病，這會(huì)顯著縮短他們的壽命；還有一些患者有異?；蛱〉膬?nèi)臟器官，會(huì)使長(zhǎng)期生存變得困難。

侏儒癥的常見(jiàn)病因包括： ①骨胳系統(tǒng)疾病如軟骨營(yíng)養(yǎng)不良和抗維生素D性佝僂??； ②先天性酶的代謝缺陷如粘多糖病和肝糖原累積癥； ③內(nèi)分泌障礙如垂體性侏儒癥，甲狀腺功能減退（克汀病）； ④家族性矮小癥和原發(fā)性侏儒癥； ⑤長(zhǎng)期大劑量腎上腺皮質(zhì)激素的應(yīng)用等等。絕大多數(shù)的病因都與基因缺陷有關(guān)。近交系侏儒癥動(dòng)物模型的建立將為侏儒癥病因、診斷、干預(yù)、預(yù)后、預(yù)防和優(yōu)生優(yōu)育等的研究提供有力的實(shí)驗(yàn)手段。

多種方法可以制作出垂體性侏儒動(dòng)物模型［1，2］，并用于模擬“垂體性侏儒癥”，進(jìn)行相關(guān)的病因、診斷、干預(yù)的研究。然而，自發(fā)性侏儒動(dòng)物模型更有利于從基因突變方式、分布及基因定位的角度對(duì)侏儒癥及其相關(guān)疾病進(jìn)行系統(tǒng)研究。陳芷沅教授于1982年在津白3（TA3） 小鼠群體中發(fā)現(xiàn)侏儒小鼠［3］，經(jīng)十多年的繁殖與選種培育成近交系。這種侏儒小鼠是由一個(gè)基因缺陷決定的垂體性缺陷模型。研究表明，侏儒鼠與多個(gè)系統(tǒng)的功能改變和疾病有關(guān)［4-9］，包括內(nèi)分泌系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和應(yīng)激系統(tǒng)等。更為突出的是與長(zhǎng)壽、睡眠、智力和抗腫瘤密切相關(guān)［10-14］，從而進(jìn)一步拓展了侏儒鼠的研究應(yīng)用范圍。目前國(guó)內(nèi)外自發(fā)性侏儒鼠模型大多集中在小鼠，尤其是國(guó)內(nèi)尚無(wú)自主繁育的自發(fā)性侏儒大鼠的相關(guān)報(bào)道。

2007年作者在 Wistar大鼠繁育群中意外發(fā)現(xiàn)一窩體型與同齡、同性別個(gè)體相比顯著矮小的大鼠，自離乳至成年，體質(zhì)量和體尺的差異越加明顯，疑似突變引起的自發(fā)侏儒癥。經(jīng)22～23代全同胞親兄妹近交（B×S）培育， 目前已形成一定的規(guī)模和種群數(shù)量，種群的生物學(xué)特征逐漸穩(wěn)定，具有符合自發(fā)性侏儒癥動(dòng)物品系評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的趨勢(shì)，又呈現(xiàn)出獨(dú)有的不同于自發(fā)性侏儒小鼠的生物學(xué)和遺傳學(xué)特點(diǎn)。對(duì)這種大鼠種群和品系的深入研究與培育， 可能為人類(lèi)遺傳性侏儒癥研究提供良好的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其設(shè)施

清潔級(jí)突變-近交系侏儒大鼠及其對(duì)照封閉群Wistar大鼠。飼育環(huán)境為本院屏障設(shè)施+IVC［SYXK（滬）2011-0121］。

1.2 主要儀器

TP2101電子天平（中國(guó)上海興澄衡器有限公司）； IVC-Ⅱ（中國(guó)江蘇省蘇州市馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備郵箱公司）； 游標(biāo)卡尺（中國(guó)上海量具刃具廠）； HITACHI 7600 series Automatic Analyzer （日本株式會(huì)社日立制作所）； HEMAVET 950（美國(guó)Drew公司）； Thermo Fisher（美國(guó)Thermo公司）

1.3 培育方法和命名

采用“全同胞兄妹（B×S）交配”方法培育和維持突變-近交系侏儒大鼠品系。當(dāng)出現(xiàn)不孕或性別比例嚴(yán)重失衡時(shí)以“親子交配方式”作為B×S交配的補(bǔ)充。以“修飾平行線法”建立各世代譜系。一般以第2、3胎動(dòng)物作為近交傳代親本。按照近交系培育管理規(guī)范，對(duì)核心群每只大鼠均實(shí)行譜系登記。主要內(nèi)容有： 自身編號(hào)（世代數(shù)，胎次、序號(hào)等信息）； 雙親編號(hào)； 出生、初配、生產(chǎn)、離乳、淘汰日期等等。按照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)命名法則實(shí)施品系命名。

1.4 主要測(cè)定內(nèi)容

自出生（初生）至16周齡（成年）， 對(duì)侏儒大鼠進(jìn)行各周齡體質(zhì)量測(cè)定， 以侏儒大鼠4周齡（幼年）至16月齡（成年）體質(zhì)量與原種Wistar大鼠相應(yīng)年齡、性別體質(zhì)量作差異顯著性檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)侏儒大鼠主要繁殖性能指標(biāo)（初生窩重、胎產(chǎn)仔數(shù)、胎間隔、離乳率）， 觀察其遺傳穩(wěn)定性， 并與原種Wistar大鼠作差異顯著性檢驗(yàn)。測(cè)定幼年期（4周齡）侏儒大鼠主要臟器（心、肝、脾、肺、腎、睪丸/輸卵管）重量， 作為品系參考值； 測(cè)定成年期（16周齡）侏儒大鼠和Wistar大鼠主要臟器重量， 進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。測(cè)定幼年期（4周齡）侏儒大鼠血清總蛋白（ALB）、堿性磷酸酶（ALP）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）等12項(xiàng)生化指標(biāo)，作為品系參考值； 比較測(cè)定、分析青年期（8周齡）和成年期（16周齡）侏儒大鼠和Wistar大鼠主要生化指標(biāo)。測(cè)定幼年期（4周齡）侏儒大鼠血液白細(xì)胞總數(shù)（WBC）、紅細(xì)胞總數(shù)（RBC）； 血紅蛋白（HB）等12項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)， 作為品系參考值； 比較青年期（10周齡）侏儒大鼠和Wistar大鼠主要血液學(xué)指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各測(cè)定組值以x- ± s表示。侏儒大鼠與Wistar大鼠組間比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 突變近交系建立

2.1.1 建立近交系 自體成熟起，對(duì)疑似自發(fā)性侏儒大鼠采取全同胞兄妹交配（B×S）方法建立近交系核心群， 用“修飾平行線法”保種傳代，以第2、第3胎同代同兄妹作為傳代親本。目前近交保持已經(jīng)達(dá)到22～23代，第23代近交系數(shù)F23=99.21%。

2.1.2 品系命名 根據(jù)侏儒癥特點(diǎn)，參照國(guó)際命名法則，將疑似侏儒癥突變-近交系大鼠暫時(shí)命名為“侏儒大鼠”（SDWR）。

2.1.3 正反交試驗(yàn) 在近交過(guò)程中，嘗試以SDWR ♂×Wistar♀及SDWR♀×Wistar♂正、反交方式，觀察后代體質(zhì)量和體尺， 均未表現(xiàn)出明顯侏儒癥狀。表明SDWR可能是由多基因隱性遺傳造成。

2.2 SDWR大鼠主要繁殖性能

SDWR大鼠與原種Wistar大鼠主要繁殖性能比較見(jiàn)表1。SDWR大鼠產(chǎn)仔數(shù)、窩重、離乳率均顯著低于Wistar （P＜0.01），胎間隔無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 SDWR體質(zhì)量

從表2可見(jiàn)， SDWR大鼠從幼年期（4～5周齡）至成年期（16周），其各周齡體質(zhì)量均顯著小于同年齡、同性別Wistar大鼠（P＜0.01）。幼年（4周齡）、青年（10周齡）和成年（16周齡） SDWR體質(zhì)量?jī)H為Wistar大鼠相應(yīng)年齡段的45.7%， 37.5%， 36.2%（♂）和49.7%，41.7%，40.3%（♀），即各年齡階段SDWR體質(zhì)量均不到Wistar的一半，且隨著年齡增長(zhǎng)，這種體質(zhì)量弱小的差異程度更加明顯，是侏儒癥的典型表現(xiàn)。從建立近交系至今，SDWR生長(zhǎng)緩慢、體質(zhì)量低的特性保持不變，并能穩(wěn)定遺傳。

表1 SDWR與Wistar大鼠主要繁殖性能比較

2.4 SDWR大鼠主要體尺指標(biāo)

SDWR大鼠體長(zhǎng)、尾長(zhǎng)增長(zhǎng)緩慢， 1歲以后基本停止增長(zhǎng)或逐漸縮減（表3）。10周齡SDWR大鼠體長(zhǎng)、尾長(zhǎng)（表3）與Wistar大鼠體長(zhǎng)（36.4±1.8 cm♂，34.3±1.4 cm♀）、尾長(zhǎng)（15.4±1.2 cm♂， 14.8± 0.9 cm♀）比較，分別僅為Wistar大鼠的77.5%、 72.3%（♂）和73.8%、68.9%（♀）， 均有極顯著差異（P＜0.01）， 明顯體現(xiàn)侏儒癥狀。10周齡SDWR及Wistar大鼠體型比較見(jiàn)圖1、圖2。

2.5 SDWR大鼠主要臟器重量

4 周齡SDWR大鼠臟器重量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。成年期（16周齡）臟器絕對(duì)重量SDWR均顯著低于Wistar大鼠（P＜0.01，表5），也是矮小、侏儒特征的重要體現(xiàn)。

2.6 SDWR主要血液生化指標(biāo)

4 周齡SDWR大鼠12項(xiàng)生化指標(biāo)： 白蛋白（ALB）；堿性磷酸酶（ALP）； 丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）； 天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）； 尿素氮（BUN）； 肌酐（CREA）； 葡萄糖（GLU）；高密度脂蛋白（HDL）； 低密度脂蛋白（LDL）； 總膽固醇（TCH）； 甘油三酯（TG）； 總蛋白（TP）測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。

表2 SDWR和Wistar大鼠體質(zhì)量比較 g

表3 不同年齡段SDWR大鼠體長(zhǎng)、尾長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果 cm

圖1 10周齡SDWR與Wistar體型比較（♂）

圖2 10周齡SDWR與Wistar體型比較（♀）

16周齡SDWR大鼠兩性別部分生化測(cè)定值（AST、BUN、CREA、TG、TP等）與Wistar有顯著差異（表7）。

2.7 主要血液生理指標(biāo)

4 周齡SDWR大鼠12項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)：白細(xì)胞總數(shù)（WBC）、紅細(xì)胞總數(shù)（RBC）、血紅蛋白（HB）、紅細(xì)胞比容（HCT）、平均血紅蛋白含量（MCH）、平均血紅蛋白濃度（MCHC）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）、中性粒細(xì)胞比率（NE%）、淋巴細(xì)胞比率（LY%）、嗜酸性粒細(xì)胞比率（EO%）、單核細(xì)胞比率（MO%）、嗜堿性粒細(xì)胞比率（BA%）測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表8。

表4 4周齡SDWR大鼠主要臟器重量 g

表5 16周齡SDWR與Wistar大鼠主要臟器重量比較 g

表6 4周齡SDWR大鼠生化指標(biāo)

16周齡SDWR大鼠兩性別血液測(cè)定值中白細(xì)胞總數(shù)（WBC）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）和單核細(xì)胞比率（MO%）均顯著低于Wistar（表9）。

3 討論

至2016年2月，侏儒大鼠實(shí)現(xiàn)連續(xù)近交達(dá)22～23代。品系暫時(shí)命名為SDWR。SDWR幼年、青年及成年體質(zhì)量分別僅為Wistar的45.7%， 37.5%，36.2%（♂）和49.7%，41.7%，40.3%（♀）（P＜0.01）；SDWR青年期體長(zhǎng)、尾長(zhǎng)分別僅為Wistar的77.5%、72.3%（♂）和73.8%、68.9%（♀）（P＜0.01）； SDWR青年及成年期主要臟器（心、肝、脾、肺、腎、睪丸/輸卵管）重量顯著低于同年齡Wistar大鼠（P＜0.01）。除部分指標(biāo)外，SDWR大鼠主要生化、血液學(xué)測(cè)定值與Wistar相比差異不大。

表7 16周齡SDWR與Wistar大鼠生化指標(biāo)

表8 4周齡SDWR大鼠血液學(xué)指標(biāo)測(cè)定

表9 16周齡SDWR與Wistar大鼠血液學(xué)指標(biāo)測(cè)定

人類(lèi)侏儒癥主要表現(xiàn)是生長(zhǎng)緩慢，具體體現(xiàn)在體質(zhì)量、體尺比同年齡、同性別個(gè)體顯著低下。作者通過(guò)對(duì)原種Wistar繁殖群中出現(xiàn)的疑似侏儒癥狀突變動(dòng)物，通過(guò)長(zhǎng)期近交培育，表明其在在生長(zhǎng)發(fā)育、體尺、繁殖性能、臟器重等方面體現(xiàn)明顯的侏儒特征，并能穩(wěn)定遺傳，其遺傳機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

（鳴謝：本課題實(shí)施和完成階段，得到上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司徐平研究員的指導(dǎo)和支持，謹(jǐn)致謝意。）

［1］ 楊佩蓀， 林鍇， 盛樹(shù)力， 等.谷氨酸單鈉引起大鼠垂體性侏儒變化［J］.首都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 1990， 11（4）：283-288.

［2］ 劉應(yīng)科， 張知新， 李鴻， 等.去垂體幼鼠的生物學(xué)特性與激素水平［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)， 2011， 19（3）：259-262，275.

［3］ 陳芷沅， 楊晶， 冷梅， 等.侏儒小鼠（dwt）與津白3（TA3）的臟器稱(chēng)重［J］.天津醫(yī)藥， 1995， 23（12）：740-742.

［4］ Symons AL， Seymour GJ.A histological study of the effect of growth hormone on odontogenesis in the Lewis dwarf rat ［J］.Arch Oral Biol， 2000， 45（2）：123-131.

［5］ Uthusa EO， Brown-Borg HM.Altered methionine metabolism in long living Ames dwarf mice［J］.Exp Gerontol， 2003， 38（5）：491-498.

［6］ Madsen MA， Hsieh CC， Boylston WH， et al.Altered oxidative stress response of the long-lived Snell dwarf mouse［J］.Biochem Biophys Res Commun， 2004， 318（4）：998-1005.

［7］ Miquet JG， Muoz MC， Giani JF， et al.Ames dwarf （Prop1df/ Prop1df） mice display increased sensitivity of the major GH-signaling pathways in liver and skeletal muscle［J］.Growth Horm IGF Res， 2010， 20（2）：118-126.

［8］ Dhahbi J， Li XC， Tran T， et al.Circulating blood leukocyte gene expression profiles： effects of the Ames dwarf mutation on pathways related to immunity and inflammation［J］.Exp Gerontol， 2007， 42（8）：772-788.

［9］ Leiser SF， Salmon AB， Miller RA.Correlated resistance to glucose deprivation and cytotoxic agents in fibroblast cell lines from long-lived pituitary dwarf mice［J］.Mech Ageing Dev， 2006， 127（11）：821-829.

［10］ Hsieh CC， Papaconstantinou J.Akt/PKB and p38 MAPK signaling， translational initiation and longevity in Snell dwarf mouse livers［J］.Mech Ageing Dev， 2004， 125（10-11）：785-798.

［11］ Kinney BA， Meliska CJ， Steger RW， et al.Evidence that Ames dwarf mice age differently from their normal siblings in behavioral and learning and memory parameters［J］.Horm Behav， 2001， 39（4）：277-284.

［12］ Alderman JM， Flurkey K， Brooks NL， et al.Neuroendocrine inhibition of glucose production and resistance to cancer in dwarf mice［J］.Exp Geront， 2009， 44（1-2）：26-33.

［13］ Peterfi Z， Obal Jr F， Taishi P， et al.Sleep in spontaneous dwarf rats.Brain Research， 2006， 1108（1）：133-146.

［14］ Sharma S， Haselton J， Rakoczy S， et al.Spatial memory is enhanced in long-living Ames dwarf mice and maintained following kainic acid induced neurodegeneration［J］.Mech Ageing Dev， 2010， 131（6）：422-435.

Breeding of Inbred Dwarf Rats and its Main Biological Characteristics

YAO Ju-fang， HUA Zheng-yu， WANG Bin， SUN Zhi-kai， DAI Hui-li
（Renji Hospital， Shanghai Jiao Tong University， Shanghai 200127， China）

Objective To breed the inbred strain of dwarf rat and determine the main biological characteristics.Methods The spontaneous mutant litters looks like dwarfism from the Wistar conlony was bred and maintained by brother×sister （B×S） mating system for 22-23 progenies and nominatured as spontaneous dwarfism rat （SDWR） according the standard.As reference of strain， indexes of growth and development， body measurements， reproductive performance， organ weight， serum biochemical （12 items） and hematology （12 items） about dwarf rat at different age stages were measured， and be compared with background Wistar rat.Results Up to February 2016， the dwarf rat was inbreded continuously for 22-23 generations， and named as SDWR temporarily.The weight of weanling， youth and adult individuals in SDWR was respectively only about 45.7%， 37.5%， 36.2%（♂） and 49.7%，41.7%， 40.3%（♀） of the same age Wistar rats （P＜0.01）.The body and tail length of youth and adult individuals in SDWR is respectively 77.5%， 72.3% （♂） and 73.8%， 68.9%（♀） of Wistar rats （P＜0.01）.The weights of major organs （heart， liver， spleen， lung， kidney， testis or oviduct tubes） in youth and adult SDWR are significantly lower than that of the same ages Wistar rats （P＜0.01）.Conclusions Through 22-23 progenies inbreeding， the established inbreeding strain of SDWR exhibited obvious dwarfism symptoms in growth， body measurements， reproductive performance and organs weight， and has stable heredity.The rat may be useful as animal models for the study of inherited dwarfism in human.

Dwarfism； Inbred strain； Spontaneous dwarfism rat （SDWR）； Body mass； Body size； Organ weight； Physiological and biochemical indexes of blood

Q95-33

A

1674-5817（2016）04-0295-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.04.010

·經(jīng)驗(yàn)交流·

2016-03-25

上海市科委課題［13140900100］

姚菊芳（1964-）， 女， 主管技師，E-mail： yaoshirley@163.com