氨水協(xié)同60Co-γ射線輻照預處理促進芒草酶解糖化的研究

彭勝男，陳　亮，蘇小軍，3，周紅麗*

（1.湖南農業(yè)大學 食品科技學院，湖南 長沙 410128；2.湖南省核農學與航天育種研究所，湖南 長沙 410125；3.生物質醇類燃料湖南省工程實驗室，湖南 長沙 410128）

氨水協(xié)同60Co-γ射線輻照預處理促進芒草酶解糖化的研究

彭勝男1，陳亮2，蘇小軍1，3，周紅麗1*

（1.湖南農業(yè)大學 食品科技學院，湖南 長沙 410128；2.湖南省核農學與航天育種研究所，湖南 長沙 410125；3.生物質醇類燃料湖南省工程實驗室，湖南 長沙 410128）

以經400 kGy60Co-γ射線輻照處理過的芒草為原料，采用氨水室溫下浸泡對其進行協(xié)同預處理，考察氨水體積分數(shù)、固液比及浸泡時間對芒草化學組分和酶解糖化效果的影響，并設計正交試驗優(yōu)化了氨水協(xié)同60Co-γ射線輻照預處理芒草的工藝。結果表明，在固液比為1∶10（g∶mL）條件下，經10%（V/V）氨水浸泡48 h的輻照芒草酶解后，還原糖含量達到471.74 mg/g。

氨水；輻照；芒草；酶解糖化

能源作為國家發(fā)展和國民經濟的支柱，其重要性不言而喻，而隨著時代的進步和人口的增長、傳統(tǒng)化石能源日益短缺，亟需尋找一種資源豐富、價格低廉的新型能源來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的化石能源以支持人類的進步和發(fā)展［1-2］。如今對新型能源的研究多種多樣，而以木質纖維素類植物如芒草、玉米秸稈、蘆葦?shù)葹樵仙a燃料乙醇正是目前的研究熱點［3］。預處理是木質纖維素類原料轉化為燃料乙醇的重要工藝環(huán)節(jié)。目前有物理、化學、生物3種類型的預處理方法，輻照預處理通常被歸為物理預處理，是一種綠色無污染的有效預處理手段。木質纖維素在高劑量輻照條件下纖維素聚合度下降，結構松散，酶解反應的酶解效率顯著提高［4-6］。

單純輻照處理所需劑量大，而低劑量輻照的纖維素降解效果不理想［7］。前期研究表明低劑量輻照與其他預處理的方法結合使用可使酶解糖化效果更佳［8］。彭姿等［9］研究了稀硫酸結合低劑量輻照能節(jié)省成本并大幅度提高原料的酶解效率。氨水是種價格相對低廉的弱堿，經稀釋還可作為農業(yè)用的肥料，對環(huán)境影響相對較小，其對纖維素及半纖維素破壞較小，并能去除原料中所含對發(fā)酵不利的乙酞基，不會產生對后續(xù)發(fā)酵不利的副產物［10］。

本實驗以纖維素和半纖維含量高的芒草［11-12］為原料，以降低預處理成本為目的，研究了室溫下氨水對較低劑量輻照芒草的協(xié)同處理效果，優(yōu)化了氨水協(xié)同輻照處理芒草的工藝，以期能為建立氨水協(xié)同輻照預處理芒草酶醇糖化的技術體系提供數(shù)據(jù)支撐，為輻照預處理木質纖維素的大規(guī)模商業(yè)應用提供技術參考和理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

芒草：湖南農業(yè)大學教學科研基地提供。將采集的芒草烘干，于室溫條件下經60Co-γ射線以輻照劑量率為2 kGy/h進行輻照處理，輻照200 h后得到400 kGy60Co-γ射線輻照處理芒草（以下簡稱輻照處理芒草），未輻照的芒草剪成長5 cm左右備用。

氨水、亞氯酸鈉、冰醋酸、丙酮、硫酸、硝酸、乙醇、醋酸鈉、3，5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）、氫氧化鈉、無水亞硫酸鈉、四水合酒石酸鉀鈉、苯酚、葡萄糖、纖維素酶（5 000 U/mL）：國藥集團化學試劑有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

Fz102微型植物粉碎機：天津市泰嬌特儀器有限公司；DZKW-56光明電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；DGH-9246A電熱恒溫鼓風干燥箱、LD5-2A低速離心機：上海精密試驗設備有限公司；277547纖維素測定儀：意大利VELP Scientifica公司；ZHWY-2012C恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海天域分析儀器制造有限公司；R0704135可見分光光度計：上海尤尼柯試驗有限公司。

1.3試驗方法

將經處理后的輻照及未輻照芒草材料進行粉碎，放入密封袋中保存，同時制備經不同氨水濃度、浸泡時間、固液比處理的輻照芒草樣品。測定不同樣品的綜纖維素、纖維素、半纖維素及木質素含量，制備不同樣品的酶解液，測定其還原糖含量。再根據(jù)單因素試驗結果對輻照芒草進行氨水預處理條件優(yōu)化正交試驗。

酶解液的制備：取1 g待測樣品，置于50 mL錐形瓶中，加入600 U/g纖維素酶及pH 4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，使得最后的酶解固液比為1∶10（g∶mL）。每個單因素做3個平行。置于溫度50℃、轉速120 r/min的搖床中，酶解96 h后，置于沸水浴5 min使酶失活，待酶解液冷卻后定容、離心，取上清液備測。

1.3.1不同預處理方法對芒草基本成分和酶解糖化效果的影響

配制體積分數(shù)為10%的氨水溶液500 mL。分別于2個500 mL錐形瓶中裝入25 g輻照、未輻照芒草，再分別加入250 mL 10%的氨水溶液，浸泡24 h，過濾洗滌至中性，收集殘渣，放入65℃烘箱干燥18 h后，得到經10%氨水處理的輻照及未輻照芒草，并與未經處理的輻照及未輻照芒草測定綜纖維素、纖維素、半纖維素和木質素含量。酶解糖化，以還原糖含量評定不同預處理方法對芒草基本成分和酶解糖化效果的影響。

1.3.2不同體積分數(shù)的氨水溶液對輻照芒草酶解糖化效果的影響

分別配制體積分數(shù)為0、5%、10%、15%、20%氨水溶液各500 mL。分別裝入5個1 L的錐形瓶中，再分別加入50 g經輻照處理的芒草，每個處理重復3次。密封后于室溫（25℃）條件下浸泡24 h，過濾洗滌至中性，收集殘渣，部分放入65℃烘箱干燥18 h，用于測定綜纖維素、纖維素、半纖維素和木質素含量。未烘干部分先測定水分含量，再用于酶解糖化，以還原糖含量評定氨水預處理的效果。

1.3.3不同固液比浸泡對輻照芒草酶解糖化效果的影響

取5個1 L錐形瓶，裝入50 g經輻照處理的芒草，分別以固液比1∶1、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20（g∶mL）加入體積分數(shù)為10%氨水，密封后于室溫（25℃）條件下下浸泡24 h，每個處理重復3次。過濾、洗滌、收集固體殘渣，部分放入65℃烘箱干燥18 h，用于測定綜纖維素、纖維素、半纖維素和木質素含量。未烘干部分先測定水分含量，再用于酶解糖化，以還原糖含量評定氨水預處理的效果。

1.3.4不同浸泡時間對輻照芒草酶解糖化效果的影響

取5份50 g經輻照的芒草樣品置于1 L錐形瓶中，各加入體積分數(shù)為10%氨水500 mL，密封后置于室溫（25℃）條件下分別浸泡0、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h，過濾、洗滌至中性、收集殘渣，放入65℃烘箱干燥18 h，用于測定綜纖維素、纖維素、半纖維素和木質素含量的測定。未烘干部分先測定水分含量，再用于酶解糖化，以還原糖含量評定氨水預處理的效果。

1.3.5正交試驗

在確定氨水體積分數(shù)、浸泡時間及固液比對400 kGy60Co-γ射線輻照芒草酶解糖化影響的基礎上，以還原糖含量為評價指標，設計出如表1所示的正交試驗因素與水平，以尋求最佳氨水預處理條件。

表1　氨水預處理條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for ammonia water pretreatment conditions optimization

1.3.6分析測定

綜纖維素的含量的測定按照國標GB/T 2677.10－1995《造紙原料綜纖維素含量的測定》中的方法進行；纖維素的含量的測定采用硝酸—乙醇法［13］；木質素的含量的測定按照國標GB/T 2677.8－94《造紙原料酸不溶木素含量的測定》中的方法進行；纖維素酶活測定按照輕工行業(yè)標準QB 2583—2003《纖維素酶制劑》中濾紙酶活力測定方法測定；半纖維素含量=綜纖維素含量－纖維素含量。

還原糖的測定采用3，5-二硝基水楊酸法。葡萄糖標準曲線制備：準確稱取1.000 g經（103±2）℃恒質量的葡萄糖，用蒸餾水溶解并定容至100mL，配制為質量濃度為10g/L葡萄糖標準溶液。分別取該葡萄糖標準溶液0.05mL、0.10mL、0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL、0.35 mL各3管于25 mL具塞比色管中，再分別加入蒸餾水0.45mL、0.40mL、0.35mL、0.30 mL、0.25 mL、0.20 mL、0.15 mL，加一支空白管，空白管內加入0.5 mL蒸餾水，共22支比色管各加1.5 mL pH 4.8醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，混勻后再各加入3 mL DNS試劑，繼續(xù)混勻，沸水浴10min，迅速冷卻至室溫并定容至刻度、搖勻。以空白管為對照，在波長540 nm處測定各管的吸光度值。

2　結果與分析

2.1葡萄糖標準曲線的建立

以葡萄糖標準溶液的質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線，結果見圖1。

圖1　葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

由圖1可知，葡萄糖標準曲線回歸方程為y=0.073 0x+ 0.025 3，相關系數(shù)R2為0.999 21，表明二者線性關系良好。

2.2不同預處理方法對芒草基本成分和酶解糖化效果的影響

表2　不同預處理方法對芒草基本成分和其酶解液還原糖含量的影響Table 2 Effect of different pretreatment methods onM.sinensisbasic components and reducing sugar content in enzymolysis liquid

由表2可知，經輻照或是經10%氨水浸泡處理后的芒草，綜纖維素含量均有下降，但幅度都不大，木質素含量基本保持不變，表明輻照或氨水浸泡處理降解木質素的能力不明顯。輻照處理的芒草酶解后還原糖含量由11.271 mg/g升高至31.965 mg/g，提高了近2倍，氨水浸泡未輻照的芒草酶解后還原糖含量由11.271 mg/g升高至69.026 mg/g，提高了近5倍，說明輻照預處理和氨水浸泡對芒草的酶解糖化促進作用效果都很明顯，而經10%氨水浸泡的輻照芒草酶解后還原糖含量達到399.575 mg/g，說明氨水浸泡對輻照預處理芒草的酶解糖化有顯著的協(xié)同作用。

2.3不同體積分數(shù)的氨水溶液對芒草基本成分和酶解糖化效果的影響

由表3可知，隨著氨水體積分數(shù)對芒草棕纖維、纖維素及半纖維素含量影響都不大，而隨氨水體積分數(shù)升高，木質素含量有所下降，說明氨水能選擇性脫除木質素?？赡苁且驗榘彼w積分數(shù)升高，引起了綜纖維的進一步被部分分解破壞，導致還原糖得率減少［15］。氨水體積分數(shù)由0升高至20%，輻照芒草酶解后還原糖含量依次增大，從0到10%的增加幅度最大。當氨水溶液體積分數(shù)繼續(xù)由10%升至20%，還原糖含量增加的幅度減小。10%與15%之間綜纖維與木質素差別不大，因此體積分數(shù)為10%氨水溶液為輻照芒草糖化前預處理的較優(yōu)選擇。

表3　氨水體積分數(shù)對芒草基本成分和其酶解液還原糖含量的影響Table 3 Effect of ammonia concentration onM.sinensisbasic components and reducing sugar content in enzymolysis liquid

2.4固液比對輻照芒草基本成分及酶解糖化效果的影響

表4　固液比對芒草基本成分和其酶解液還原糖含量的影響Table 4 Effect of solid-liquid ratio onM.sinensisbasic components and reducing sugar content in enzymolysis liquid

由表4可知，在固液比從1∶1（g∶mL）升至1∶20（g∶mL）的過程中，酶解后還原糖含量的變化先升高后下降。固液比從1∶1（g∶mL）升至1∶10（g∶mL），還原糖含量增長明顯，固液比＞1∶10（g∶mL），還原糖含量有所下降。而綜纖維素、纖維素及半纖維素含量均保持微小幅度增長，不溶木素含量基本保持不變。因此，采用10%氨水浸泡輻照芒草固液比以1∶10（g∶mL）比較合適。

2.5不同浸泡時間對輻照芒草酶解糖化效果的影響

由表5可知，處理時間在0～60 h范圍內，還原糖含量隨時間增加而升高，浸泡48 h和60 h的差別不大，而后隨著浸泡時間繼續(xù)增加，還原糖含量降低。0～72 h綜纖維素、纖維素含量變化不大，而半纖維素和木質素含量逐漸減少，72 h時出現(xiàn)反現(xiàn)象。這可能是由于隨著浸泡時間增長，木質素被脫除得越多，使得纖維素暴露得越多，酶解效果就越明顯。但浸泡時間過長，會產生糠醛、酮類等物質，它們對酶解反應有抑制作用，影響還原糖的轉化［15］。而浸泡時間過長在實際生產中影響經濟效益，因此，認為氨水浸泡處理輻照芒草時間以48 h為宜。

表5　浸泡時間對芒草基本成分和其酶解液還原糖含量的影響Table 5 Effect of soaking time onM.sinensisbasic components and reducing sugar content in enzymolysis liquid

2.6正交試驗結果

在單因素試驗基礎上，選取浸泡時間（A）、氨水體積分數(shù)（B）及固液比（C）為影響因素，還原糖含量為考察指標，進行3因素3水平正交試驗，結果與分析見表6，正交試驗結果方差分析見表7。

表6　氨水預處理條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 6 Results and analysis of orthogonal experiments for ammonia water pretreatment conditions optimization

由表6可知，對還原糖含量結果影響順序為氨水體積分數(shù)＞固液比＞浸泡時間，根據(jù)k值大小選擇得到氨水預處理條件優(yōu)化最佳條件組合為A2B2C2，即浸泡時間為36 h，氨水體積分數(shù)10%，固液比為1∶10（g∶mL）。在此最佳條件下，還原糖含量為471.735 mg/g。

表7　正交試驗結果方差分析Table 7 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表7可知，氨水體積分數(shù)對試驗結果有顯著影響（P＜0.05），浸泡時間及固液比對試驗結果沒有顯著性影響。

3　結論

本試驗確定了氨水協(xié)同輻照預處理能顯著提高芒草酶解效率，最優(yōu)氨水預處理條件：10%氨水以1∶10（g∶mL）的浸泡固液比，浸泡48 h，酶解還原糖含量達到471.735 mg/g。本試驗所用的氨水能有效提高酶解效率，且價格相對低廉，經稀釋還可作為農業(yè)用的肥料，對環(huán)境影響較小。本研究提供了氨水協(xié)同輻照預處理的最優(yōu)工藝，對于輻照協(xié)同其他方法預處理纖維素材料提供了理論依據(jù)和研究基礎，對于協(xié)同預處理具有一定的指導意義。

［1］CEOTTO E.Grasslands for bioenergy production，a review［J］.Agron Sust Dev，2008，28（4）：47-55.

［2］蘇小軍，熊興耀，譚興和，等.燃料乙醇發(fā)酵技術研究進展［J］.湖南農業(yè)大學學報：自然科學版，2007，33（4）：480-485.

［3］WANG B，WANG X，F(xiàn)ENG H.Deconstructing recalcitrantMiscanthus with alkaline peroxide and electrolyzed water［J］.Bioresource Technol，2010，101（2）：752-760.

［4］李春光，董令葉，吉洋洋，等.花生殼纖維素提取及半纖維素與木質素脫除工藝探討［J］.中國農學通報，2010，26（22）：350-354.

［5］RAGAUAKAS A J，WILLIAMS C K，DAVISION B H，et al.The path forward for biofuels and biomaterials［J］.Science，2006，311（5760）：484-489.

［6］BAK J S，KO J K，HAN Y H，et al.Improved enzymatic hydrolysis yield of rice straw using electron beam irradiation pretreatment［J］.Bioresource Technol，2009，100（3）：1285-1290.

［7］張木明，徐振林，張興秀，等.預處理對稻草秸稈纖維素酶解產糖及纖維素木質素含量的影響［J］.農產品加工·學刊，2006（3）：4-6.

［8］彭姿，譚興和，熊興耀，等.NaOH處理提高輻照芒草木質纖維素酶解效率的研究［J］.中國農學通報，2014，30（14）：185-191.

［9］彭姿，譚興和，熊興耀，等.稀硫酸處理促進輻照芒草木質纖維素酶解糖化條件的優(yōu)化［J］.安徽農業(yè)科學，2013，41（31）：12455-12457，12461.

［10］陳靜萍，王克勤，彭偉正，等.60Co-γ射線處理稻草秸稈對其纖維素酶解效果的影響［J］.激光生物學報，2008，17（1）：39-42.

［11］胡春婷，楊丹青，張婷婷，等.輻照-纖維素酶糖化降解芒草工藝條件優(yōu)化研究［J］.中國釀造，2011，30（2）：29-32.

［12］VRIJE T D，BAKKER R R，BUDDE M A W，et al.Efficient hydrogen production from the lignocellulosic energy cropMiscanthusby the extreme thermophilic bacteriaCaldicellulosiruptor saccharolyticusand Thermotoga neapolitana［J］.Biotechnol Biofuel，2009，4（2）：12-17.

［13］王林風，程遠超.硝酸乙醇法測定纖維素含量［J］.化學研究，2011，22（4）：52-55.

［14］徐忠，汪群慧，姜兆華.氨預處理對大豆秸稈纖維素酶解產糖影響的研究［J］.高校化學工程學報，2004，18（6）：773-776.

［15］SCHELL D，NGU Y Q，TUCKER M，et al.Pretreatment of softwood by acid-catalyzed steam explosion followed by alkali extraction［J］.Appl Biochem Biotech，1998，72（1）：17-24.

Enhance enzymatic saccharification ofMiscanthus sinensisby synergic pretreatment with60Co-γ ray irradiation and ammonia water

PENG Shengnan1，CHEN liang2，SU Xiaojun1，3，ZHOU Hongli1*
（1.College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；2.Hunan Institute of Nuclear Agricultural Science&Space Mutation Breeding，Changsha 410125，China；3.Hunan Engineering Laboratory for Alcohol Fuels from Biomass，Changsha 410128，China）

Miscanthus sinensiswas irradiated by 400 kGy60Co-γ ray，and then was soaked in ammonia water at room temperature.The effects of ammonia water concentration，solid-liquid ratio and soak time onM.sinensischemical constituents and enzymolysis saccharification were investigated. The conditions ofM.sinensissynergic pretreatment with60Co-γ ray irradiation and ammonia water were optimized by orthogonal experiments.The results showed that under the conditions of solid-liquid ratio 1∶10（g∶ml），M.sinensisirradiated was soaked in 10%（V/V）ammonia water for 48 h，and the reducing sugar content was 471.74 mg/g.

ammonia water；irradiation；Miscanthus sinensis；enzymatic saccharification

S543.9

0254-5071（2016）03-0023-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.006

2015-12-12

國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2007AA10Z320）

彭勝男（1990-），女，碩士研究生，研究方向為農產品加工及貯藏工程和生物質能源。

周紅麗（1972-），女，副教授，博士，研究方向為農副產品綜合利用、發(fā)酵食品研究與開發(fā)。