陳昌浩，孫岳軍,王建東

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·論著·

受體酪氨酸激酶EphB6蛋白在結(jié)直腸癌中表達及臨床意義

陳昌浩1，孫岳軍2,王建東3

目的探索促紅細胞生成素產(chǎn)生肝細胞激酶受體B6(EphB6)蛋白在結(jié)直腸癌中表達及其臨床意義。 方法采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測一組結(jié)直腸癌組織中EphB6蛋白表達，分析其與臨床病理指標以及患者總生存時間之間的關(guān)系。結(jié)果正常黏膜組織EphB6蛋白陽性表達率為75.0%(93/124)，腺瘤型息肉為73.7%(42/57)，結(jié)直腸癌組織中為54.0%(67/124)， EphB6在結(jié)直腸癌中的表達顯著低于腺瘤和正常黏膜(P<0.05)。EphB6蛋白在癌組織中表達與腫瘤分化(P<0.01)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.01)和Dukes分期(P<0.01)有關(guān)；但與結(jié)直腸癌患者的年齡、性別和部位無關(guān)。EphB6低表達患者比高表達患者預(yù)后差(P<0.05)。結(jié)論EphB6 在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后中可能具有抑癌基因的作用，可能成為一種新的腫瘤預(yù)后和治療靶點。

受體酪氨酸激酶；肝細胞激酶受體B6；結(jié)直腸癌

促紅細胞生成素產(chǎn)生肝細胞激酶受體(erythropoietin producing hepatocyte kinase，Eph)是受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTK)，包括EphAs和EphBs受體，和EphrinAs和EphrinBs配體。Eph及其Ephrin之間傳遞信號在胚胎發(fā)育，特別是神經(jīng)軸突導(dǎo)向和血管生成等方面發(fā)揮著重要功能[1-5]。Eph受體及其配體在多種惡性腫瘤中表現(xiàn)為表達異常，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、和轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)[6-8]。與其他Eph基因不同，EphB6在其酪氨酸激酶活性區(qū)發(fā)生了幾個氨基酸的改變，導(dǎo)致與ATP結(jié)合障礙并失去酪氨酸激酶活性[9-10]。不同研究小組對EphB6在多種腫瘤中的表達及作用開展了研究。Gu 等[11]檢測了一組卵巢漿液性腫瘤中EphB6蛋白的表達，他們發(fā)現(xiàn)EphB6在正常輸卵管和良性卵巢腫瘤中100%表達，78%的交界性腫瘤中表達，18%的漿液性癌中表達。EphB6表達水平與分級和TNM分期相關(guān)，EphB6低表達或丟失 的患者存活時間降低。Dong等[12]研究了EphB6在舌鱗狀細胞癌中的表達及其臨床意義。本文利用免疫組織化學(xué)染色檢測了一組結(jié)直腸癌標本，探索EphB6的表達及其臨床病理指標的相關(guān)性。

A：顯示癌組織與癌旁正常組織交界處，癌組織呈實性片狀分布;B：顯示EphB6蛋白在正常黏膜腺腔的高爾基體分泌部著色，EphB6在腫瘤組織的表達較正常組織中下調(diào);C：顯示結(jié)腸腺瘤型息肉伴低級別上皮內(nèi)瘤變;D：顯示EphB6蛋白在結(jié)直腸腺瘤和正常黏膜腺腔的高爾基體分泌部中均著色(放大倍數(shù)×200，A、C為HE染色，B、D為Envision法)圖1　EphB6蛋白在結(jié)直腸癌、良性病變和正常組織中的表達

1　材料與方法

1.1組織標本本研究所用石蠟標本為東南大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院和江陰市人民醫(yī)院病理科存檔病例，所取標本均獲得患者知情同意，并獲得醫(yī)院倫理委員會批準。收集124例結(jié)直腸癌、57例腺瘤型息肉(2005年8月-2012年7月)的石蠟組織標本，結(jié)直腸癌病例中女54例，男70例，中位年齡56歲(36～82歲)，選取了不同分化腫瘤(高分化癌19例，中分化癌79例，低分化癌26例)。另外還選取了良性息肉57例，中位年齡58歲(31～74歲)，包括低級別上皮內(nèi)瘤變45例，高級別上皮內(nèi)瘤變12例。

1.2方法兔抗人EphB6抗體購自美國ABGENT公司，稀釋度為1∶500；二抗和DAB顯色試劑盒采用福州邁新公司產(chǎn)品。4微米組織切片，脫臘、水化后，高壓抗原修復(fù)，應(yīng)用3% H2O2修復(fù)內(nèi)源性過氧化物酶。 Envision法檢測組織EphB6蛋白表達，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替EphB6一抗做陰性對照，按照試劑盒說明書嚴格操作。

1.3結(jié)果判斷高倍鏡下分析10個視野(×400)，每個高倍鏡視野分析計數(shù)100個腫瘤細胞。本實驗采用半定量計分方法，即陽性細胞百分數(shù)+染色強度：陽性細胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，深黃色為3分。最終結(jié)果：0分為缺失表達，1～2分為低表達，缺失表達和低表達為陰性；3～4分為中表達，5～7分為高表達，中表達和高表達為陽性表達。

1.4隨訪中位隨訪時間為7 個月，79例結(jié)直腸癌獲得有效隨訪資料，隨訪期間，57例(72.1%)死亡(38例死于復(fù)發(fā))。隨訪從手術(shù)之日開始，失訪、死于其他疾病或者在隨訪截至時仍存活視為截尾數(shù)據(jù)?？偵嫫?overall survival, OS)定義為從初次治療開始至死亡或隨訪終點時間。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SSPS 17.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，生存率采用Kaplan-Meier法計算，Log-rank檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1EphB6在腸正常黏膜、腺瘤和結(jié)直腸癌組織中的表達免疫組化示EphB6陽性染色主要表現(xiàn)為為高爾基體分泌部著色(圖1)。EphB6蛋白在正常黏膜、腺瘤和癌組織中陽性表達率分別為75.0% (93/124)、73.7% (42/57)和54.0% (67/124)。結(jié)直腸癌癌組織中EphB6蛋白的表達明低于腺瘤型息肉和正常黏膜(P<0.05)。

2.2EphB6表達與臨床病理指標之間的關(guān)系應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)工具分析EphB6蛋白表達與結(jié)直腸癌患者臨床病理多項參數(shù)之間的關(guān)系，見表1。

表1　EphB6蛋白在結(jié)直腸癌中的表達與

2.3EphB6表達與患者預(yù)后的關(guān)系進一步分析EphB6表達水平與患者的預(yù)后關(guān)系，EphB6表達患者的平均生存期分別為53.8個月；低表達患者的平均生存期為83.3個月，兩組5年總生存率分別為63.2%和83.2%。統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)EphB6低表達的患者較EphB6高表達的患者生存時間短(圖2)

圖2　EphB6表達與患者生存

Kaplan-Meier曲線為結(jié)直腸癌患者的生存分析，EphB6蛋白低表達患者較高表達患者預(yù)后差，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

3　討　論

結(jié)直腸癌是全球危害健康最常見惡性腫瘤，發(fā)病率為全部癌癥的第三位。雖然在結(jié)直腸癌治療方面已取得重大進步，但目前臨床治療手段包括手術(shù)、化療、放療和靶向治療等對晚期轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌的效果并未發(fā)生根本性改善。研究結(jié)直腸癌的分子機制，早期發(fā)現(xiàn)腫瘤和進行個體化治療，改善治療策略，對提高患者的生存率具有重要意義[13]。

本研究利用特異性多克隆抗體進行免疫化學(xué)染色，檢測了一組結(jié)直腸癌、腺瘤及正常黏膜組織中EphB6蛋白的表達情況，分析EphB6蛋白表達與患者臨床病理指標和生存時間之間的關(guān)系，為臨床評估疾病進展及判斷預(yù)后提供線索。本研究揭示了EphB6蛋白表達與臨床病理指標相關(guān)，即EphB6蛋白在結(jié)直腸癌中表達與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Dukes分期有關(guān)，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；但尚未發(fā)現(xiàn)其表達下調(diào)與年齡、性別、腫瘤浸潤深度、部位存在相關(guān)性。這結(jié)果提示EphB6蛋白可能對結(jié)直腸癌的分化、轉(zhuǎn)移和生長浸潤產(chǎn)生影響，與腫瘤進展相關(guān)。本研究通過統(tǒng)計學(xué)分析EphB6蛋白表達與結(jié)直腸癌患者的生存時間，發(fā)現(xiàn)EphB6低表達組平均生存時間明顯低于高表達組患者。我們推測EphB6基因有望評估結(jié)直腸癌患者預(yù)后的重要指標之一。

因此，本研究結(jié)果提示EphB6蛋白表達水平下調(diào)可能參與了良性腺瘤向結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)變過程，即該基因蛋白可能參與了結(jié)直腸癌的早期發(fā)生和腫瘤的進展過程。 EphB6蛋白表達與腫瘤分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示該蛋白可能具有抑制腫瘤細胞發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移。雖然本研究提示EphB6基因在結(jié)直腸癌的進展過程中可能發(fā)揮一定抑制作用，但其表達的調(diào)控機制和腫瘤抑制作用仍有待下一步深入研究。我們相信對EphB6在結(jié)直腸癌中的深入研究，可能為此疾病的風險評估及患者預(yù)后評價提供新的實驗室指標。

[1]Kania A, Klein R. Mechanisms of ephrin-Eph signalling in development, physiology and disease[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2016,17(4):240-256.

[2]Suzuki DG, Murakami Y, Yamazaki Y, et al. Expression patterns of Eph genes in the “dual visual development” of the lamprey and their significance in the evolution of vision in vertebrates[J]. Evol Dev, 2015,17(2):139-147.

[3]King DE. Acute DSS colitis alters EphB6 receptor expression in neurons of the spinal dorsal horn[J]. Neurosci Lett, 2014,559:105-110.

[4]Ende G, Poitz DM, Strasser RH, et al. The role of the Eph/ephrin-system in atherosclerotic plaque development: a complex puzzle[J]. Cardiovasc Pathol, 2014,23(4):251.

[5]Nievergall E, Lackmann M, Janes PW. Eph-dependent cell-cell adhesion and segregation in development and cancer[J]. Cell Mol Life Sci, 2012,69(11):1813-1842.

[6]彭李博, 王建東. 受體酪氨酸激酶Eph基因表達與人類結(jié)直腸癌的研究進展[J]. 東南國防醫(yī)藥, 2013, 15(1):48-51.

[7]Jones AM, Ferguson P, Gardner J, et al. NRAS and EPHB6 mutation rates differ in metastatic melanomas of patients in the North Island versus South Island of New Zealand[J]. Oncotarget, 2016. doi: 10.18632/oncotarget.9351. [Epub ahead of print]

[8]Giaginis C, Alexandrou P, Poulaki E, et al. Clinical Significance of EphB4 and EphB6 Expression in Human Malignant and Benign Thyroid Lesions[J]. Pathol Oncol Res, 2016,22(2):269-275.

[9]Allonby O, El Zawily AM, Freywald T, et al. Ligand stimulation induces clathrin- and Rab5-dependent downregulation of the kinase-dead EphB6 receptor preceded by the disruption of EphB6-Hsp90 interaction[J]. Cell Signal, 2014,26(12):2645-2657.

[10]Akada M, Harada K, Negishi M, et al. EphB6 promotes anoikis by modulating EphA2 signaling[J]. Cell Signal, 2014,26(12):2879-2884.

[11]Gu Y, Li F, Qian N, et al. Expression of EphB6 in ovarian serous carcinoma is associated with grade, TNM stage and survival[J]. J Clin Pathol, 2016,69(5):448-453.

[12]Dong Y, Pan J, Ni Y, et al. High expression of EphB6 protein in tongue squamous cell carcinoma is associated with a poor outcome[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015,8(9):11428-11433.

[13]王建東, 王緒林, 董迎春, 等.TaqMan探針檢測結(jié)直腸癌血漿中微量甲基化EphA7基因[J]. 東南國防醫(yī)藥, 2009，11(2):97-99，130.

(本文編輯：黃攸生；英文編輯：王建東)

Clinical significance of decreased expression of EphB6 receptor tyrosine kinase in colorectal carcinoma

CHEN Chang-hao1, SUN Yue-jun2, WANG Jian-dong3.

1.TheSecondAffiliatedHospitalofSoutheastUniversity,Nanjing,Jiangsu210003,China; 2.JiangyinPeoples’Hospital,Jiangyin,Jiangsu214400,China; 3.NanjingGeneralHospital,Nanjing,Jiangsu210002,China

ObjectiveTo explore the clinical significance of decreased expression of EphB6 receptor tyrosine kinase in colorectal carcinoma. MethodsA set of colorectal carcinoma samples was detected the expression of EphB6 by using immunohistochemical staining. The relationship between the expression of EphB6 and clinicopathological parameters and survival was analyzed. ResultsThe EphB6 expression was detected in normal mucosa (75.0%, 93/124), adenoma (73.7%, 42/57), colorectal carcinoma (54.0%, 67/124). The expression level of EphB6 was significantly decreased in colorectal cancer compared with adenoma and normal mucosa (P<0.05). The decreased expression of EphB6 was significantly associated with differentiation (P<0.01), lymph node metastasis(P<0.01) and Dukes stage (P<0.01). There was no significant difference between the expression of EphB6 and age, sex, and tumor location. The patients with decreased expression of EphB6 had a poor survival (P<0.05). ConclusionEphB6 may have a tumor suppressor role in colorectal carcinoma and may be a new target for therapy.

receptor tyrosine kinase; EphB6; colorectal carcinoma

國家自然基金(81371611)

1. 210003江蘇南京，東南大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科；2. 214400江蘇江陰， 江陰市人民醫(yī)院病理科；3. 210002江蘇南京，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院病理科

王建東，E-mail: jd_wang@outlook.com

R365；R735.37

A

10.3969/j.issn.1672-271X.2016.04.003

2016-06-22；

2016-07-06)

引用格式：陳昌浩，孫岳軍,王建東.受體酪氨酸激酶EphB6蛋白在結(jié)直腸癌中表達及臨床意義[J].東南國防醫(yī)藥，2016,18(4):346-348.