侯玥，董占梅，馬野，趙寶珠，郭曉楠，于源華

（1.長春理工大學(xué)　生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春　130022；2.吉林省公安廳物證鑒定中心，長春　130000）

DhHP-6替代過氧化物酶在葡萄糖檢測中的應(yīng)用

侯玥1，董占梅2，馬野1，趙寶珠1，郭曉楠1，于源華1

（1.長春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春130022；2.吉林省公安廳物證鑒定中心，長春130000）

過氧化物酶（POD）是催化H2O2氧化反應(yīng)的生物酶，很多涉及氧化反應(yīng)的臨床診斷試劑盒都采用這個原料。但天然的POD易失活、價格高、實驗條件和儲存環(huán)境都很苛刻。擬開發(fā)一種模擬酶替代過氧化物酶。次血紅素六肽（DhHP-6）是一種生物小分子，由于它穩(wěn)定、實驗條件溫和、成本較低等優(yōu)點，成為近年關(guān)注熱點。將次血紅素六肽（DhHP-6）替代過氧化物酶催化H2O2氧化，通過偶聯(lián)還原型色原N-乙基-N-（2-羥基-3-磺酸基丙基）-3，5-二甲氧基苯胺（DAOS）和4-氨基安替比林4-（AAP）進行顯色反應(yīng)，將該體系應(yīng)用于葡萄糖氧化酶（GOD）催化體系，實現(xiàn)血液中葡萄糖含量的測定。實驗結(jié)果表明，在最佳條件下，H2O2的線性范圍為0.69～22.0mmol/L；葡萄糖測定的線性范圍為0.35～22.0mmol/L。將本法用于血樣中葡萄糖測定，重復(fù)性：CV=2.6%（n=20）；穩(wěn)定性：3小時內(nèi)，濃度CV≤5.0%；與商品血清葡萄糖試劑進行比較，R≥0.98，平均回收率達到96.4%。結(jié)果為過氧化物酶的模擬酶研究與開發(fā)提供實驗技術(shù)基礎(chǔ)。

次血紅素六肽；模擬酶；葡萄糖測定。

過氧化物酶（POD）由于選擇性好和活性高，廣泛應(yīng)用于血清中葡萄糖和尿酸等小分子含量的測定［1］。但天然POD易失、價格高、實驗條件和儲存環(huán)境都很苛刻。已有研究發(fā)現(xiàn)，肌紅蛋白、Fe3O4等能作為POD的模擬酶應(yīng)用于葡萄糖的測定中［2-5］，王麗萍等根據(jù)抗壞血酸過氧化物酶的結(jié)構(gòu)主體，設(shè)計并合成了具有很高POD活性的一種含亞血紅素的短肽-次血紅素六肽（Deutero hemin-His-Peptide，DhHP-6）［6，7］。本文采用DhHP-6代替POD催化過氧化氫（H202），氧化偶聯(lián)還原型色原N-乙基-N-（2-羥基-3-磺酸基丙基）-3，5-二甲氧基苯胺（DAOS）和4-氨基安替比林（4-AAP）顯色反應(yīng)，用于H202的測定，將該體系與葡萄糖氧化酶（GOD）催化體系偶聯(lián)，實現(xiàn)了血液中葡萄糖含量的測定。

1　儀器與試劑

UV-2550紫外-可見分光光度計（日本島津）；DAOS（美國ICN公司）；4-AAP（天津市化學(xué)試劑研究所）；3.0%H2O2（德州新康消毒制品有限公司生產(chǎn)）；葡萄糖（Glucose）標(biāo)準(zhǔn)液（長春匯力生物）；葡萄糖氧化酶（GOD，Sigma）；DhHP-6（吉林大學(xué)生命科學(xué)院王麗萍教授饋贈）；血樣來自解放軍461醫(yī)院；試劑中所用水均為去離子水。

實驗試劑：A：0.2mmol/L Good’s緩沖液，pH7.0，內(nèi) 含 有 12mmol/LDAOS、10mmol/L 4-AAP、30KU/L葡萄糖氧化酶。B：1.0mmol/L （1.23mg/mL）DhHP-6。

對比試劑：長春匯力生物葡萄糖測定試劑盒（吉械注準(zhǔn)2009第20152400093號）。

2　實驗部分

2.1實驗原理

葡萄糖氧化酶（GOD）催化葡萄糖產(chǎn)生葡萄糖酸和H202，用DhHP-6代替POD催化H2O2氧化偶聯(lián)DAOS和4-AAP偶聯(lián)的反應(yīng)。利用氧化產(chǎn)物在592nm波長處的吸收，實現(xiàn)血液中葡萄糖含量的測定。

2.2實驗方法

2.2.1DhHP-6過氧化物酶模擬酶的性質(zhì)實驗

取2支10mL具塞試管，加入實驗試劑A 5.0mL，實驗試劑B 1.0mL（1.23mg DhHP-6），其中一支加入3.0%H2O20.1mL，用去離子水定容到10mL，混合均勻后在37℃時反應(yīng)10min，然后在UV-2550紫外-可見分光光度計上測定產(chǎn)物的吸收光譜，如圖1所示。

圖1　H202-4-A AP-DAOS-DhHP-6的反應(yīng)產(chǎn)物吸收光譜1顯色產(chǎn)物，2試劑空白，不加H202的試劑

2.2.2DhHP-6過氧化物酶模擬酶的線性實驗

取3.0%H2O20.05ml（882mmol/L）加入蒸餾水19.95ml（40倍稀釋）。制成濃度為22.0mmol/L的H2O2溶液。然后分別稀釋成濃度11.0、5.50、2.75、 1.375、0.687mmol/L按表1進行實驗操作，37℃反應(yīng)10min，在UV-2550紫外-可見分光光度計上592nm測定產(chǎn)物的吸光度A值，結(jié)果如圖2所示。

表1　DhHP-6模擬POD測定H2O2（10分鐘）

圖2　H202-4-A AP-DAOS-DhHP-6測定H202的反應(yīng)線性

2.2.3DhHP-6過氧化物酶模擬酶測定葡萄糖及與商品試劑盒的比較

取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（22.0mmol/L）加入蒸餾水分別稀釋成濃度11.0、5.50、2.75、1.37、0.69、0.34mmol/L，按表2進行實驗操作，37℃反應(yīng)10min，在UV-2550紫外-可見分光光度計上592nm測定產(chǎn)物的吸光度A值，同時與長春匯力生物產(chǎn)生的葡萄糖測定試劑盒進行比較。結(jié)果如圖3所示。

表2　DhHP-6模擬POD測定葡萄糖（10分鐘）

圖3　DhHP-6測定葡萄糖及與商品試劑盒的比較

2.2.4DhHP-6酶模擬酶測定葡萄糖的重復(fù)性、穩(wěn)定性實驗

取20支試管，分別加入5.50mmol/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液10μl、實驗試劑A 2.0ml、實驗試劑B10μl，37℃反應(yīng)10min，在UV-2550紫外-可見分光光度計上592nm測定產(chǎn)物的吸光度A值，計算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。

取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（22.0mmol/L）加入蒸餾水分別稀釋成濃度11.0、5.50、2.75、1.37、0.69、0.34mmol/L，按表2進行實驗操作，37℃反應(yīng)，分別在1/6小時（10分鐘）、1.0小時、3.0小時和24小時在UV-2550紫外-可見分光光度計上592nm處測定吸光度A值。結(jié)果如圖4所示。

圖4　

2.2.5回收率實驗

取6份葡萄糖含量不同的血液樣品各1.0m1，每2管分別加入2.0、5.0、10.0mmol/L的葡萄糖溶液各1.0m1，37℃10分鐘在在UV-2550紫外-可見分光光度計上592nm處測定吸光度A值。測定回收率。

3　結(jié)果與討論

3.1DhHP-6作為模擬酶的光譜特征

UV-2550紫外-可見分光光度計上進行光譜掃描顯示，DhHP-6催化H202與DAOS-AAP體系所得產(chǎn)物的吸收光譜最大吸收波長在592nm，與POD催化相同體系的最大吸收波長一致（圖1），證明DhHP-6具有與POD相同的催化特性，可作為POD的模擬酶進行應(yīng)用。

3.2DhHP-6催化H2O2的線性實驗

在0.687-22.0mmol/L范圍內(nèi)，DhHP-6催化H2O2呈線性關(guān)系（圖2），證明DhHP-6有較好的催化H2O2能力。

3.3DhHP-6測定葡萄糖及與商品試劑盒的比較

在0.34～22.2mmol/L范圍內(nèi)，DhHP-6催化葡萄糖呈線性關(guān)系（圖3），證明DhHP-6可應(yīng)用于GOD-DAOS-AAP體系測定葡萄糖。同時與長春匯力生物生產(chǎn)的葡萄糖測定試劑盒進行比較，相關(guān)系數(shù)r=0.9871。

3.4DhHP-6模擬酶測定葡萄糖的重復(fù)性、穩(wěn)定性實驗

20份5.55mmol/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的重復(fù)性實驗結(jié)果為：平均值=5.57mmol/L、標(biāo)準(zhǔn)差=0.144mmol/ L、變異系數(shù)=2.6%。證明DhHP-6作為模擬酶測定葡萄糖有較好的重復(fù)性；

DhHP-6模擬酶測定0.34-22.0mmol/L葡萄糖過程中，在37℃反應(yīng)后，分別在1/6小時（10分鐘）、1.0小時、3.0小時和24小時592nm處測定吸光度A值（圖4）。結(jié)果證明DhHP-6模擬酶在顯色后有較好的穩(wěn)定性。

3.5回收率實驗

用葡萄糖含量不同的3個血液樣品，分別加入3.0mmol/L和5.0mmol/L的葡萄糖溶液各1m1后測定回收率，每個試樣均測定3次，葡萄糖的平均回收率值為96.4%，與葡萄糖氧化酶偶聯(lián)過氧化物酶在相同體系中測定葡萄糖的回收率97%相近。

4　結(jié)論

本文以DhHP-6模擬酶替代POD，實現(xiàn)了對H2O2和葡萄糖含量的測定。DhHP-6可以作為POD的模擬酶，從理論上證實了以亞血紅素為靶分子肽類模擬物DhHP-6具有很高的過氧化物酶活性［7］。作為一種新的模擬酶，它具有合成工藝化、質(zhì)量穩(wěn)定、價格低廉、易儲存等優(yōu)點，具有廣闊的應(yīng)用前景。本實驗結(jié)果為DhHP-6模擬酶研究與開發(fā)應(yīng)用提供了實驗技術(shù)基礎(chǔ)。

［1］尚紅，王毓三，申子瑜.全國臨床檢驗操作規(guī)程［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2015：231.

［2］韓愛霞，常瑞，牛麗紅，等.用肌紅蛋白作為過氧化物酶模擬酶光度測定葡萄糖［J］.分析化學(xué)，2004，32（8）：1123.

［3］Kim MI，Shim J，Li T，et a1.Fabrication of nanoporousnanocompositesentrappingFe3O4magnetic nanoparticles and oxidases for colorimetric biosensing ［J］.Chemistry，2011，12；17（38）：10700-107007.

［4］Jiang X，Sun C，Guo Y，et al.Peroxidase-like activity of apoferritin paired gold clusters for glucose detection［J］.Biosens Bioelectron，2015，64：165-170.

［5］Zhang Weimin，Ma Diao，Dun Jianxiu.Prussian blue nanoparticlesas peroxidase mimetics forsensitive colorimetric detection of hydrogen peroxide and glucose［J］.Talanta，2014，120：362-367.

［6］WANG Liping，LIU Yali，YANG Hui，et al.Synthesis and anti-cataract activity of a novel peroxidase mimetics［J］.Chemical Journal of Chinese universities，2004，25（11）：2171-2173.

［7］Yali L，Lili G，Roger WR，et al.The method improvement of synthyesis and purification of deuterohemin［J］.Acta Sci.Nat.Univ.Jilin，2001，1：91-92.

The Application of DhHP-6 Substitutes for Peroxidase in the Detection of Glucose

HOU Yue1，DONG Zhanmei2，MA Ye1，ZHAO Baozhu1，GOU Xiaonan1，YU Yuanhua1

（1.School of Life Science and Technology，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022；2.Public Security Department Material Evidence Identification Center of Jilin Provincial，Changchun 130000）

Peroxidase（POD）is a biological enzyme that catalyzes the oxidation of H2O2，that material of reagent kit relate to oxidation.Conditions for natural POD were harsh that easily inactivity，high price，difficult experimental conditions and storage line.This study develop mimic enzyme instead of peroxidase.DhHP-6 is small molecule that became the hotspot for stability，safe experimental conditions and low cost.In this experiment，（DhHP-6）replace the peroxidase for catalyzed H2O2oxygen.The chromogenic reaction is through coupling N-Ethyl-N-（2-hydroxy-3-sulfopropyl）-3，5-dimethoxyaniline sodium salt（DAOS）and 4-Aminoantipyrine（4-APP）.This system was applied to the glucose oxidase （GOD）catalytic system for determination of the blood glucose.Experimental results show that，under the optimal conditions，H2O2linear region between 0.69～22.0mmol/L，Linear range of glucose determination between 0.35～22.0mmol/L. The method applied to determination of serum glucose，repeatability CV=2.6%（n=20），stability：concentration CV≤5.0% in 3 hours.Compared with commercial glucose kits，R≥0.98，the average recovery rate is 96.4%.It is helpful for mimic enzyme replaced peroxidase to develop and basical research.

DhHP-6；mimic enzyme；determination of glucose

O652

A

1672-9870（2016）03-0139-04

2016-01-10

侯玥（1988-），女，博士，講師，E-mail：hy46155@126.com

于源華（1962-），女，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：yuyuanhua8888@126.com