冉海燕，江　龍

(貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

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·文獻綜述·

AM真菌離體雙重培養(yǎng)研究進展

冉海燕，江龍*

(貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

AM真菌在農業(yè)生產用“菌肥”以及重金屬污染修復上占據重要地位。AM真菌的生理生化及遺傳特性決定了AM真菌的利用方式。離體雙重培養(yǎng)法是目前研究AM真菌生物學功能特性的高效便利的途徑，利用AM真菌與植物離體轉型根進行共生培養(yǎng)探究AM真菌的生長發(fā)育過程，為未來利用AM真菌孢子生產AM真菌接種劑提供理論參考。本文綜述了近年來國內外AM真菌離體雙重培養(yǎng)的研究進展，針對目前AM真菌純培養(yǎng)存在的問題題提出了相關建議。

AM真菌；離體雙重培養(yǎng)；研究進展

叢枝菌根真菌(AM真菌)與植物根系的共生是自然界最廣泛的共生關系,它能與80%的陸生植物形成互惠共生體，土壤中AM真菌孢子萌發(fā)產生的菌絲通過侵染宿主植物根系形成泡囊-叢枝結構，促進宿主植物從土壤中吸收植物所需的礦質營養(yǎng)，同時AM真菌也將從宿主植物中獲取幫助完成自身生長發(fā)育周期所需的營養(yǎng)物質[1]。1885年，德國植物生理學和森林學家Frank 首創(chuàng)“菌根”(Fungus-root 即Mycorrhiza) 這一術語，掀起了生物學界科研人員對這一類特殊的有益微生物的研究熱潮。AM真菌能促進植物的營養(yǎng)吸收，提高植物的產量與質量，接種AM真菌可明顯的提高茶樹葉片中N、P、K等含量，可溶性糖、蛋白質含量也有所提高，同時茶葉中茶多酚、氨基酸等物質含量提高，降低了氨酚比[2]；自然條件下接種Glomusversiforme促進了柑橘過時組織的發(fā)育，果實中VC含量、酚含量、黃酮含量、礦物質含量等均較未接種的有所提高[3]。AM真菌除了能促進植物的營養(yǎng)吸收，提高植物的產量與質量，在重金屬污染修復上發(fā)揮重要的作用[4]，在鎘污染地黑麥草根圍接種AM真菌可緩解鎘對黑麥草的毒害作用，對黑麥草根系鎘毒害緩解更為明顯[5]；根內球囊霉能顯著降低紫云英莖和根內鑭含量，減少鑭對紫云英的毒害[6]；接種摩西球囊霉能夠有效緩解鎘、銅、砷對金雞菊和蜈蚣草的毒害等[7]。AM真菌促進植物對土壤中礦質營養(yǎng)的吸收，提高植物的抗逆性以及環(huán)境修復上的重要作用，所以AM真菌在農林業(yè)生產上具有廣泛的應用前景[8]。在生產實踐中，AM真菌的作用并未充分發(fā)揮，主要原因在于需要大量的AM真菌孢子，目前規(guī)?；aAM真菌接種劑的方法仍不成熟[9]，因此開展AM真菌的生理、遺傳特性的研究，最終實現(xiàn)AM真菌接種劑作為安全高效菌肥是AM真菌研究的重要方向[10]。

AM真菌的研究涵蓋了菌根的形態(tài)、分類、多樣性、生物學功能等多方面，其中一個研究重點就是利用植物根段或是植物離體轉型根作為寄主進行AM真菌的離體純培養(yǎng)，獲得大量純凈孢子。AM真菌活體專性共生的特性限定了AM真菌不能進行純培養(yǎng)，離體雙重培養(yǎng)是一種安全高效的方法，主要利用植物根系或植物轉型根系來建立與AM真菌的共生體系，在共生體系中，希望AM真菌可以完成生活史，并大量產孢。在植物根系或植物轉型根系這兩種共生體系中，由植物根系建立的共生體系存在生長緩慢，需要添加外源生長調節(jié)劑等不利因素；利用土壤細菌發(fā)根農桿菌對植物體進行轉化得到的植物Ri-TDNA轉型根，具有在無激素MS培養(yǎng)基上生長迅速，存活時間久，同時能保持良好的遺傳特性，是AM真菌雙重培養(yǎng)過程中理想的宿主材料[11]。叢枝菌根真菌的離體純培養(yǎng)從20世紀60年代興起以來，從培養(yǎng)條件、遺傳因素等方面進行了積極的探索，到目前為止，在人工培養(yǎng)條件下能夠建立AM真菌與植物根器官或是植物轉型根的共生體系，遺憾的是不能獲得大量新一代的AM真菌孢子[12]，即不能達到用新生的次生孢子進行二次侵染的效果。AM真菌生長發(fā)育過程的相關理論知識相對較為缺乏，尤其是在其遺傳方面知識的嚴重缺乏導致在實驗研究過程中沒有更多明確的思路，只能逐步探索。本文綜述了AM真菌離體雙重培養(yǎng)研究的發(fā)展、研究現(xiàn)狀和未來的研究方向，希望能通過植物生理與分子生物學手段找出AM真菌生長發(fā)育過程中的關鍵物質，清晰透徹地闡明AM真菌遺傳特性[13]，提高AM真菌次生孢子的產率及成熟率，最終實現(xiàn)AM真菌接種劑的規(guī)?；a。

1　AM真菌雙重培養(yǎng)的提出

AM真菌的擴繁方法主要有活體盆栽法、培養(yǎng)基培養(yǎng)法、玻璃珠分室培養(yǎng)法、AM真菌與植物根器官培養(yǎng)法、AM真菌與植物Ri-TDNA轉型根離體單孢培養(yǎng)法等，活體盆栽法仍是目前獲得AM真菌接種劑的常用且最為簡單有效的方法，該方法具有獲取方便的優(yōu)點，但存在費時費力，培養(yǎng)周期長，繁殖體少等缺點[16]。培養(yǎng)基培養(yǎng)法較盆栽法復雜且只能獲得極少量純度較高的接種物。離體雙重培養(yǎng)法是一種安全、高效的培養(yǎng)方法，該方法是在無菌的人工培養(yǎng)基上接種萌發(fā)的AM真菌孢子以及寄主材料，AM真菌菌絲侵入根系內部建立共生體，從根系獲取營養(yǎng)來保證AM真菌的生長發(fā)育，完成生活史。

AM真菌是土壤中的一種活體寄主有益微生物，不能獨立生存，適宜條件下AM真菌孢子能夠萌發(fā)產生菌絲，在沒有寄主存在的情況下，菌絲生長20天左右就停止生長[14]。究其原因：在脫離寄主后AM真菌不能獨立完成新的細胞核DNA的合成，AM真菌孢子萌發(fā)菌絲需要侵入活體植物組織獲取更多的蛋白質等營養(yǎng)物質保證核DNA的繼續(xù)復制[15]。正是AM真菌專性活體寄主的特性限制了AM離體純培養(yǎng)，只能在寄主存在的條件下完成生長發(fā)育的全過程，為此，科學家們做了大量AM真菌雙重培養(yǎng)的相關研究。AM真菌與植物離體雙重培養(yǎng)經歷了兩個主要階段：AM真菌與植物離體根段共培養(yǎng)，AM真菌與植物轉型根共培養(yǎng)。AM真菌與植物根段的培養(yǎng)存在植物根段在培養(yǎng)基上生長緩慢，需要添加外源生長物質等缺陷最終被否定；植物轉型根則能在無激素培養(yǎng)基上快速生長，且存活時間久，對于需要長期觀察AM真菌的生長發(fā)育過程來說，植物轉型根則是最佳的宿主。

目前，已建立了AM真菌與宿主植物轉型根的雙重培養(yǎng)共生體系，但成熟孢子的數量及次生孢子的發(fā)育狀況仍不能達到生產應用的要求。主要是未能找出AM真菌與宿主識別的關鍵信號物質，對影響AM真菌生長發(fā)育的內外因素認識模糊，對AM真菌生長發(fā)育后期次生孢子形成及成熟缺乏了解。值得高興的是，利用AM真菌與植物轉型根建立了雙重培養(yǎng)共生體系，在進行共生培養(yǎng)過程中，可實時觀察AM真菌的形態(tài)變化及生長發(fā)育的整個過程，同時也能獲得少量純凈AM真菌成熟孢子，為獲得純凈的AM真菌接種劑帶來了希望，但用此法生產AM真菌接種劑還尚待時日。

2　AM真菌離體雙重培養(yǎng)的現(xiàn)狀

2.1AM真菌與植物根器官雙重培養(yǎng)

AM真菌與植物離體根段雙重培養(yǎng)是AM真菌離體培養(yǎng)的早期階段，此方法在組織培養(yǎng)條件下將植物根段作為寄主與AM真菌孢子共培養(yǎng)，共生關系建立后AM真菌也能完成生活史，植物根段作為寄主材料存在植物離體根段在無激素的培養(yǎng)基上存活時間不長，而且根段生長速度較為緩慢，難以滿足AM真菌完成整個生活史所需營養(yǎng)物質等弊端[16]。

1975年Mosse和Hepper首次將番茄和紅三葉草的根段與Glomusmosseae建立成功共生關系，遺憾的是未能產生新生孢子；1984年，Miller-Widman 和Watrud在改良的培養(yǎng)基上建立了番茄離體根段與Gigaspora雙重培養(yǎng)關系，且獲得了次生球狀巨孢囊霉孢子；Mossea等人利用Glomus真菌孢子在改良的懷特培養(yǎng)基上建立AM真菌與苜蓿根的共生體系[17]；Mosse and Hepper建立番茄及紅三葉草與摩西球囊霉AM真菌的共生體系[18]；邵菊芳等人在改良的White培養(yǎng)基上建立了Gigasporamargarita孢子與白三葉草離體根系雙重培養(yǎng)并獲得次生孢子[19]；目前為止至少有27個AM真菌株系與植物根器官建立共生關系，統(tǒng)計結果如表1(轉引 Nishi Mathur & Anil Vyas，2007)。

表1　AM真菌-植物離體根系列表

2.2AM真菌與植物離體轉型根雙重培養(yǎng)

AM真菌與植物離體根段共培養(yǎng)產生次生孢子的研究成功后，對AM真菌雙重培養(yǎng)的研究越來越多，相繼取得了一定的成果。利用植物根段作為宿主存在生長緩慢，需外源物質，存活時間短等缺陷，但AM真菌與植物根段能夠建立共生關系為AM真菌與植物轉型根建立雙重培養(yǎng)體系奠定了基礎。發(fā)根農桿菌侵染植物獲得植物離體轉型根，毛狀根能夠在無激素培養(yǎng)基快速生長，同時存活時間較植物根段長，研究者利用植物離體轉型根作為AM真菌離體培養(yǎng)的寄主材料。1987年， Mugnier和Mosse首次成功建立了Convolvulussepium毛狀根與Glomusmosseae的共生關系，遺憾的是未能產孢，之后利用毛狀根與AM真菌孢子建立共生關系的報道逐漸增多。對于不同種屬植物以及不同種屬關系的AM真菌共生關系的研究結果不盡相同，這可能與植物和AM真菌本身的生理特性存在差異有關。以下是國內外近十年來AM真菌與植物轉型根系雙重培養(yǎng)結果見表2。

表2　AM真菌與植物轉型根建立雙重培養(yǎng)體系

3　存在的問題

利用AM真菌孢子萌發(fā)的菌絲與植物離體轉型根進行共生培養(yǎng)是能快速獲得大量真菌孢子的有效方法，也是最能直觀體現(xiàn)AM真菌生長發(fā)育過程的最佳方法。目前利用離體雙重培養(yǎng)技術僅能夠獲得少量純凈的次生孢子； AM真菌的生長發(fā)育過程中，可觀察從孢子萌發(fā)產生菌絲，菌絲侵入根段到產生次生孢子的過程，但對整個過程卻不能清晰具體地闡述。AM真菌的離體純培養(yǎng)仍處于探索階段，AM真菌與植物離體轉型根建立的雙重培養(yǎng)體系中的孢子產率遠遠不能滿足AM真菌商品接種劑的要求，以下問題亟待完善。

培養(yǎng)方法：固體培養(yǎng)仍是主流趨勢，固體培養(yǎng)是在固體培養(yǎng)基上接種AM真菌孢子與植物轉型根建立共生關系。但有的AM真菌孢子的生長周期較長，培養(yǎng)過程中難以更換培養(yǎng)基，導致AM真菌在完成生活史前宿主植物已衰老，不能為孢子生長繼續(xù)提供營養(yǎng)物質。

培養(yǎng)裝置：目前的研究大多在培養(yǎng)皿內進行，在培養(yǎng)過程中，由于植物需要進行代謝過程，培養(yǎng)中在培養(yǎng)皿內容易出現(xiàn)水珠，容易導致污染且影響后續(xù)的鏡檢；

培養(yǎng)條件：營養(yǎng)情況、外界物理條件及遺傳因素都會影響AM真菌的生長發(fā)育，目前的研究主要放在了營養(yǎng)狀況及物理條件上，在遺傳因素上的研究相對較少；

理論基礎：AM真菌生理遺傳方面的理論知識相對較為缺乏，仍處于探索階段。

4　展望

AM真菌純培養(yǎng)能否成功是生產AM 真菌接種劑應用于農業(yè)生產的前提，生理學與分子生物學相結合來開展AM真菌的離體純培養(yǎng)研究是一種必然的趨勢。AM真菌的離體雙重培養(yǎng)主要是在固體培養(yǎng)基上接種AM真菌孢子與植物轉型根，建立共生關系幫助AM真菌完成生活史。信號物質是建立共生關系的紐帶，是后期培養(yǎng)過程中能否獲得次生孢子的關鍵，當前的研究只能觀察生長發(fā)育的整個過程，并不能清晰透徹的闡明AM真菌的生理遺傳特性。AM真菌的雙重培養(yǎng)處在一個封閉的空間里，培養(yǎng)結束后若利用GC-MC分析技術來檢測容器里的物質成分及其變化，或許能找出促進共生關系建立的信號物質。AM真菌純培養(yǎng)仍處于瓶頸階段，分子生物學及基因工程技術將會是研究AM真菌遺傳特性的有效途徑，劉潤進等人(2009)針對未來AM真菌的研究方向時提出：“必須加強AM真菌與植物共生關系基因表達的分子生物學研究，探索新的方法，完善并規(guī)范相應的菌根技術”。我們期待在分子生物學及高新科技的推動下，弄清AM真菌的生理遺傳特性，通過設計一套合理的培養(yǎng)裝置獲得大量純凈的AM真菌孢子，為工業(yè)化生產AM真菌接種劑提供切實有效的方法。

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The research progress of AM fungi in vitro dual culture

RANHai-yan,JIANGLong*

(Collegeoflifescience,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

Arbuscularmycorrhizae(AM) has play an important role in repairing the heavy metal pollution and producing the bacterial manure. The utilization of AM fungi was depended on the physiology and biochemistry or hereditary character of it. The vitro dual culture is a high-efficiency and convenient approach to study the biological function of AM. Using AM fungi spore and Ri-TDNA transformed roots to explore the growth and development of it that can present some theoretic conference about using AM fungi to product fungicide in the future. Some currently research progresses were summarized in here and related suggestions were proposed to the cultivation of AM in the future based on some issues which have encountered.

Arbuscularmycorrhizae; vitro dual culture; research progress

2016-03-10；

2016-04-05

貴州省社發(fā)攻關項目(黔科合SY字2011-3085)；教育部重點項目(2011-167)；貴陽市社發(fā)攻關計劃項目(筑科合同 2011103-51)；貴州省煙草公司遵義分公司科技項目(遵煙技 2012-07號)。

江龍(1970-)，男，博士，教授，主要研究方向：植物生理學、菌根生物學；E-mail:jianglonggy@sina.com。

R283.6

A

1008-0457(2016)02-0062-06國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.02.012