周貽兵，吳　坤，李　磊，林　野，劉利亞（.貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550004；.貴州師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 55008）

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定啤酒中伏馬毒素的含量

周貽兵1，吳坤2，李磊1，林野1，劉利亞1*
（1.貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550004；2.貴州師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550018）

該文建立了免疫親和柱凈化-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定啤酒中FB1、FB2和FB3的含量。與液相色譜相比較，無需衍生化，避免了化學(xué)衍生法受衍生產(chǎn)物的不穩(wěn)定性、衍生劑的濃度、溫度和反應(yīng)時(shí)間等衍生效率的影響。采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式進(jìn)行檢測，3種物質(zhì)在2.5～100 ng/m L范圍具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.999，在空白樣品中加入1.0μg/kg和8.0μg/kg兩個(gè)濃度水平的伏馬毒素，平均回收率為88.3%～95.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在4.5%～8.1%，3種物質(zhì)定量限均低于0.6μg/kg，精密度試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.9%～1.7%。該方法準(zhǔn)確度高、精密度好，適用于啤酒中伏馬毒素含量的測定，可為啤酒中伏馬毒素的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估數(shù)據(jù)來源提供參考依據(jù)。

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法；伏馬毒素；檢測；啤酒

伏馬毒素（fumonisins，F(xiàn)Bs）是一類由串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）、多育鐮刀菌（Fusarium proliferatum）、輪狀鐮刀菌（Fusarium verticillioides）和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）等產(chǎn)生的真菌毒素［1-2］。目前發(fā)現(xiàn)伏馬毒素類似物有28種，分為A、B、C和P四組，以B族的FB1、FB2和FB3為主要存在形式［3］。伏馬毒素是污染食品的主要成分之一，特別是FB1廣泛存在于玉米及其制品中，約占伏馬毒素總量的70%，伏馬毒素通過污染大米、小麥、大麥、調(diào)味品、高粱、啤酒、牛奶等多種食品和飼料，對(duì)人的健康和畜牧業(yè)發(fā)展構(gòu)成潛在威脅［4-7］。毒理學(xué)及流行病學(xué)調(diào)查表明，伏馬毒素與馬腦白質(zhì)軟化癥（equine leukoencephalomalacia，ELEM），豬肺水腫癥（pig pulmonary edema，PPE）以及人類食道癌等人畜疾病有關(guān)［8］。另外，伏馬毒素還是一種慢性促癌劑，并能引起靈長類動(dòng)物的動(dòng)脈粥樣硬化樣改變。FBs由于分布廣泛且毒性較大，因此它在食品安全檢測中越來越受到人們的重視。國際上認(rèn)為FBs是一種具有重大衛(wèi)生學(xué)意義的真菌毒素，已形成繼黃曲霉毒素之后的又一個(gè)研究熱點(diǎn)［4］。目前國際上對(duì)于食品與飼料中伏馬毒素的限量及檢測方法尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。如歐盟規(guī)定嬰幼兒玉米制品中FB（含F(xiàn)B1和FB2）的總含量為0.2mg/kg，玉米中的限量值為4mg/kg；美國食品及藥物管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）規(guī)定玉米中FB1、FB2和FB3總量的最高限量值為2mg/kg；而我國雖然制定了玉米和玉米飼料中伏馬毒素的高效液相色譜檢驗(yàn)方法，但尚無明確的限量規(guī)定［5］。釀造啤酒原料（主要是谷物、水果等）中產(chǎn)毒真菌在一定的條件下產(chǎn)生、積累形成的伏馬毒素從而污染啤酒?；谑称钒踩谋O(jiān)管、控制，建立啤酒中FB1、FB2和FB3的可靠、快捷檢測方法，可為促進(jìn)啤酒安全提供必要的技術(shù)支撐。

伏馬毒素的檢測方法主要有薄層色譜法、近紅外光譜法、酶聯(lián)免疫吸附法［9-11］、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等［12-15］。其中薄層色譜法和近紅外光譜法靈敏度和重現(xiàn)性較差，而酶聯(lián)免疫吸附法假陽性率高，不能滿足實(shí)驗(yàn)室定量分析要求。以氣相色譜技術(shù)為基礎(chǔ)對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行檢測時(shí)需要通過水解產(chǎn)生丙三羧酸和利用氨基衍生增強(qiáng)揮發(fā)度等步驟［16-17］。由于FB沒有紫外吸收也不含熒光基團(tuán)，用HPLC法需要柱前衍生。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有較高的選擇性和靈敏度，無需水解和衍生，避免了樣品基質(zhì)的干擾、衍生產(chǎn)物的不穩(wěn)定性和反應(yīng)不完全等問題，因此本研究建立了免疫親和層析柱（immnuoaffinity chromatography columns，IAC）凈化-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chrom atography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法測定啤酒中伏馬毒素FB1、FB2和FB3的含量，為了解啤酒中伏馬毒素污染水平提供技術(shù)方法。

1　材料與方法

1.1料與試劑

樣品啤酒：購于超市；質(zhì)量濃度50μg/m L伏馬毒素（FB1、FB2、FB3）：Romer國際貿(mào)易（北京）有限公司；超純水：實(shí)驗(yàn)室自制；甲醇、甲酸、乙酸（均為色譜純）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

吐溫-20/磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer solution，PBS）的配制：稱取8.0 g氯化鈉，0.2 g氯化鉀，1.2 g磷酸氫二鈉和0.2 g磷酸二氫鉀溶于990m L水中，用鹽酸∶水=50∶50（V/V）調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.0，加入1.0m L吐溫-20，用超純水定容至1.0 L，混勻。

1.2器與設(shè)備

Ultimate 3000超高壓液相色譜儀、TSQ Quantum ultra三重四極桿質(zhì)譜儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)：Sigma中國有限公司；TTL-DCⅡ型氮吹儀：北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；艾科浦Aquaplus超純水機(jī)：上海百特科技有限公司；伏馬毒素免疫親和柱：美國維康公司。

1.3法

1.3.1品提取與凈化

樣品提?。悍Q取10 g（精確至0.001 g）樣品于50m L聚丙烯刻度離心管中，超聲脫氣15min，用吐溫-20/PBS緩沖溶液稀釋至40m L，混勻，稀釋液待凈化。

樣品凈化：待伏馬毒素免疫親和柱中的液體流至篩板時(shí)，將上述樣品稀釋液過伏馬毒素免疫親和柱，用10 m L吐溫20/PBS緩沖溶液淋洗免疫親和柱，棄去全部流出液，排干免疫親和柱中的水，用3m L 2%乙酸甲醇溶液分3次洗脫免疫親和柱，收集的洗脫液于60℃氮吹至干，加入1.0m L，甲醇∶0.1%甲酸水=10∶90（V/V）溶解殘留物，渦旋混勻10 s，過0.22μm的濾膜，上機(jī)測定。

1.3.2譜條件

超高效液相色譜條件：HypersilGold-C18色譜柱（150mm× 2.1mm×1.9μm），柱溫：30℃，進(jìn)樣體積：10μL，流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液-甲醇，流速0.3m L/m in，梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Conditions of gradient elution

質(zhì)譜條件：電噴霧（electronic spray ion，ESI）離子源，噴霧電壓3 200 V，毛細(xì)管溫度300℃，蒸發(fā)溫度240℃，鞘氣270 kPa，輔助氣104 kPa，碰撞氣0.2 Pa，多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reactionmonitoring，MRM）優(yōu)化參數(shù)見表2。

表2質(zhì)譜參數(shù)Table 2 The param eters ofmass spectrum

1.3.3準(zhǔn)曲線的繪制及樣品中伏馬毒素的檢測

用空白基質(zhì)將伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)貯備液稀釋成2.5 ng/m L、5.0 ng/m L、10.0 ng/m L、20.0 ng/m L、40.0 ng/m L、60.0 ng/m L、80.0 ng/m L、100.0 ng/m L標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，在1.3.2色譜條件下進(jìn)行分析，以伏馬毒素質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

將樣品的峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算樣品中伏馬毒素的含量。

1.3.4密度及準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

取質(zhì)量濃度為10.0 ng/m L的伏馬毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.3.2色譜條件下進(jìn)行分析，連續(xù)測定6次，計(jì)算儀器精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

在10 g空白啤酒樣品中添加伏馬毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使添加水平分別為1μg/kg、8μg/kg，按照1.3.1樣品提取與凈化方法進(jìn)行樣品前處理，在1.3.2色譜條件下進(jìn)行分析，每個(gè)添加水平平行測定6份，計(jì)算方法平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2　結(jié)果與分析

2.1準(zhǔn)曲線與定量限

按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法，以伏馬毒素質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 伏馬毒素FB1（A）、FB2（B）和FB3（C）標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig．1 Standard curve of FB1（A），F(xiàn)B2（B）and FB3（C）

由圖1可知，F(xiàn)B1、FB2和FB3標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程分別為y=4462.4x+478.6（R2=0.9998）、y=13 465.6x+3036.3（R2=0.999 4）、y=7982.2x-2 709.4（R2=0.999 1）。結(jié)果表明，二者線性關(guān)系良好。以10 S/N計(jì)算方法的定量限分別為FB1（0.3μg/kg）、FB2（0.3μg/kg）和FB3（0.6μg/kg）。

2.2標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

在空白啤酒樣品中加入1μg/kg、8μg/kg的伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)添加量做3次平行樣，方法的加標(biāo)回收率結(jié)果見表3。

表3　加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of the recovery rate tests

由表3可知，方法的平均回收率在88.3%～95.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relativestandard deviation，RSD）在4.5%～8.1%，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度較高。

2.3密度實(shí)驗(yàn)

取質(zhì)量濃度為10.0 ng/m L的伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.3.2色譜條件下進(jìn)行分析，連續(xù)測定6次，F(xiàn)B1、FB2和FB3測定結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.9%、1.4%、1.7%，結(jié)果表明該方法精密度較好。

2.4UPLC-MS/MS檢測樣品中伏馬毒素

本研究選擇甲醇-含0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相，進(jìn)行二元梯度洗脫，F(xiàn)B2和FB3兩種同分異構(gòu)體能達(dá)到基線分離（分離度為2.2），出峰順序依次為FB1、FB3和FB2，獲得標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的MRM分別見圖2及圖3。

圖2 伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)品的MRM圖譜Fig．2 MRM chromatogram s of fumonisin standard

圖3伏馬毒素樣品的MRM圖譜Fig.3 MRM chromatogram s of fumonisin samples

隨機(jī)抽取14種不同品牌的16份啤酒樣品，測定其FB1、FB2和FB3的含量，其中有3份檢測出伏馬毒素，有1份均檢出FB1、FB2和FB3，含量分別為36.5μg/kg、4.73μg/kg、1.79μg/kg；有2份檢出FB1和FB2，F(xiàn)B1含量分別為15.5μg/kg、13.7μg/kg，F(xiàn)B2的含量分別為2.41μg/kg、2.24μg/kg，其余13份啤酒樣品均未檢出伏馬毒素，但檢出伏馬毒素的3份樣品都含有玉米原料，這可能與玉米最易受伏馬毒素的污染有關(guān)。

3　結(jié)論

本研究采用了免疫親和柱凈化-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定啤酒中FB1、FB2和FB3含量。使用超高液相檢測靈敏度比普通高效液相色譜法高，消耗的有機(jī)溶劑少，檢測速度快，適用于大批量樣品的監(jiān)測。使用高靈敏度的質(zhì)譜檢測器，有效的減少基質(zhì)對(duì)伏馬毒素FB1、FB2和FB3測定的干擾，無需液相測方法的衍生化。該方法專屬性強(qiáng)、線性范圍寬、平均回收率為88.3%～95.1%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.5%～8.1%，精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～1.7%，該方法準(zhǔn)確度高、精密度好，可為啤酒中伏馬毒素的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供快速、靈敏、準(zhǔn)確的分析方法。

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Determ ination of fumonisin contents in beerby UPLC-MS/MS

ZHOU Yibing1，WU Kun2，LILei1，LIN Ye1，LIU Liya1*
（1.Guizhou Provincial CenterforDiseases Controland Prevention，Guiyang 550004，China；2.SchoolofChemistry and Life Sciences，Guizhou NormalCollege，Guiyang 550018，China）

Amethod for FB1，F(xiàn)B2and FB3determ ination in beerwasestablished by immuneaffinity column purification-ultraperformance liquid chromatography tandem mass spectrometry.Compared w ith liquid chromatogram，themethod avoided the effects of derivative efficiency（including derivatives instability，derivating agent concentration，temperature，reaction time，etc.）on chem ical derivatization.By multiple reactionmonitoring mode for detection，three kindsof substanceshad a good linear relationship in 2.5-100 ng/m l range，and the correlation coefficient R2were allmore than 0.999.Adding fumonisin 1.0μg/kg and 8.0μg/kg into theblank samples，resultsshowed that theaverage recovery ratewas88.3%-95.1%，RSD was4.5%-8.1%，lim itofquantitation were allbelow 0.6μg/kg.RSD of precision experimentswas0.9%-1.7%.Themethod wasw ith high accuracy and good precision，and itwas suitable for fumonisin contents determ ination in beer，which could provide a reference basis for risk assessmentdata sourcesof fumonisin in beer.

UPLC-MS/MS；fumonisin；determ ination；beer

O657．63

0254-5071（2016）01-0152-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．034

2015-11-08

貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目（黔科合J字［2009］2240）

周貽兵（1985-），男，副主任技師，碩士，研究方向?yàn)槭称贩治觥?/p>

劉利亞（1978-），男，副主任技師，本科，研究方向?yàn)槭称贩治觥?/p>