韓春華，趙際成，段會(huì)娟，林 健，楊志遠(yuǎn)，謝 佳，潘 潔，王小蕾，劉立新，劉月煥

（1北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京100097；2北京市通州區(qū)農(nóng)業(yè)局，北京 101100）

鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗（HB株）母源抗體的消長(zhǎng)規(guī)律

韓春華1，趙際成1，段會(huì)娟1，林 健1，楊志遠(yuǎn)1，謝 佳2，潘 潔1，王小蕾1，劉立新1，劉月煥1

（1北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京100097；2北京市通州區(qū)農(nóng)業(yè)局，北京 101100）

【目的】評(píng)價(jià)鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗母源抗體的效力，制定疫苗的最小免疫日齡。【方法】隨機(jī)采集鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗（HB株）二免后135日櫻桃谷種鴨的種蛋孵化，隨機(jī)取5、7、10和15日齡免疫種鴨后裔雛鴨10只和相對(duì)應(yīng)日齡非免疫種鴨后裔雛鴨5只，采血，分離血清，測(cè)定母源抗體，并以0.1mL/羽（含100DID50）的劑量經(jīng)腿部肌肉攻毒。觀察雛鴨攻毒后的臨床表現(xiàn)（采食量、糞便、精神和死亡情況），觀察至攻毒后10d。攻毒后2d經(jīng)頸靜脈采血，分離血清進(jìn)行病毒分離。每份血清接種5枚6日齡SPF雞胚，0.1mL/枚，37℃孵化，24h以內(nèi)死亡雞胚視為非特異死亡，孵化至168h。只要有1枚及以上雞胚死亡則判該鴨感染。計(jì)算母源抗體雛鴨組的攻毒保護(hù)率和無(wú)母源抗體組的發(fā)病率。攻毒后5d，分別稱量雛鴨的體重，計(jì)算平均日增重。對(duì)成對(duì)樣本進(jìn)行T檢驗(yàn)，分析母源抗體對(duì)雛鴨增重的影響。通過(guò)試驗(yàn)鴨中和抗體、增重變化和病毒分離的方法評(píng)價(jià)母源抗體的效力?！窘Y(jié)果】（1）1日齡雛鴨的母源抗體陽(yáng)性率最高，1、5、7、10和15日齡雛鴨的母源抗體陽(yáng)性率分別為56.1% （37/66）、40%（4/10）、50%（5/10）、30%（3/10）和0%（0/10），5—7日齡抗體陽(yáng)性率處于平臺(tái)期，15日齡時(shí)母源抗體降低至全陰性；（2）攻毒后對(duì)照鴨表現(xiàn)精神沉郁（20/20）、仰翻和側(cè)翻等神經(jīng)癥狀（6/20）及死亡（2/20），有母源抗體的雛鴨臨床癥狀明顯輕于對(duì)照組。（3）5、7、10和15日齡免疫種蛋孵化雛鴨攻毒后5d平均增重115.5、142.8、177.8和162.2g。5、7、10和15日齡非免疫種蛋孵化雛鴨攻毒后5d平均增重54.5、91.0、165.0和118.8g。（4）5、7、10和15日齡免疫種蛋孵化雛鴨的攻毒保護(hù)率分別為50%（5/10）、60%（6/10）、20%（2/10）和0%（0/10）；5、7、10和15日齡非免疫種蛋孵化雛鴨的發(fā)病率均為100%。（5）5和7日齡雛鴨平均增重和攻毒保護(hù)率最高，分別為50%（5/10）和60%（6/10），10和15日齡雛鴨的母源抗體盡管低（20%和0%）或陰性，仍然有明顯的保護(hù)作用。【結(jié)論】（1）鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗母源抗體能夠保護(hù)10日齡內(nèi)雛鴨；（2）疫苗首次免疫的時(shí)間以7—10日齡為最佳。

鴨；坦布蘇病毒；母源抗體

0　引言

【研究意義】近幾年，中國(guó)養(yǎng)鴨規(guī)?？焖侔l(fā)展，存欄量約40億只。從2010年春季開始，中國(guó)浙江、江蘇、山東、河北和北京等地區(qū)相繼暴發(fā)了一種以鴨產(chǎn)蛋下降為主要特征的疫病［1-2］，雛鴨發(fā)病后期出現(xiàn)精神沉郁、體重減輕、仰翻、側(cè)翻和死亡等臨床癥狀，若細(xì)菌繼發(fā)感染，出現(xiàn)肝周炎、心包炎和氣囊炎等，死淘率增加。2010年，根據(jù)產(chǎn)蛋下降和卵泡出血，將該病命名鴨出血性卵巢炎［3］（duck hemorrhagic ovaritis，DHO），后經(jīng)病原學(xué)研究證實(shí)該病是由黃病毒科黃病毒屬中坦布蘇病毒（duck Tembusu virus，DTMUV）引起［1，4-5］。2011年首屆水禽疫病防控研討會(huì)將該病統(tǒng)一命名為“鴨坦布蘇病毒病”［6］。北京鴨、櫻桃谷鴨、金定鴨、麻鴨和康貝爾鴨等均可發(fā)病［7-9］，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。疫苗免疫是預(yù)防傳染病有效和經(jīng)濟(jì)的方法之一，研究母源抗體的效力和消長(zhǎng)規(guī)律，對(duì)合理制定首次免疫日齡具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】曹貞貞等報(bào)道引起鴨產(chǎn)蛋急劇下降的病原可能與黃病毒感染有關(guān)［3］，隨后國(guó)內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)報(bào)道該病是由于黃病毒或坦布蘇病毒感染導(dǎo)致［4-5，7］。國(guó)內(nèi)學(xué)者從雞、鵝和麻雀中分離到病毒，且與鴨坦布蘇病毒基因序列具有很高的同源性［10-11］。以色列學(xué)者DAVIDSON對(duì)70種黃病毒科的病毒進(jìn)行了基因型和抗原型分類，坦布蘇病毒屬于基因Ⅺ，Ntaya抗原型（或病毒群）［12］。林健等用北京鴨建立了鴨出血性卵巢炎的實(shí)驗(yàn)感染模型［13］。除利用雞胚、鴨胚或細(xì)胞的病毒分離技術(shù)外，萬(wàn)春和等建立了 RT-PCR［14-15］、套式RT-PCR［16］、熒光定量RT-PCR［17-18］技術(shù)。姬希文等進(jìn)行了ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的研究［2］。韓春華等在鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗、活疫苗和活載體疫苗研制方面做了大量的研究工作，試驗(yàn)結(jié)果均表明疫苗有效［19-24］。尚未見鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗母源抗體消長(zhǎng)規(guī)律和疫苗最早免疫日齡的研究報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】利用鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗免疫開產(chǎn)前種鴨，收集種蛋，孵化出雛，通過(guò)抗體檢測(cè)和攻毒保護(hù)試驗(yàn)研究雛鴨母源抗體的效力與消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗免疫種鴨，確定對(duì)后裔雛鴨的保護(hù)效果及雛鴨的最小免疫日齡。

1　材料與方法

試驗(yàn)于2014年3—4月北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所內(nèi)完成。

1.1材料

1.1.1鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗（HB株）由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所和瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司研制。

1.1.2櫻桃谷種鴨 3 400只，285日齡櫻桃谷種鴨來(lái)自廣西康旺禽業(yè)發(fā)展有限責(zé)任公司，以1mL/只的劑量經(jīng)胸部肌肉注射鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗（HB株），首次免疫后14 d以相同劑量進(jìn)行二次免疫。同時(shí)設(shè)3 300只相同日齡未經(jīng)免疫的種鴨作為非免疫對(duì)照組。

1.1.3種蛋收集 二次免疫后135 d免疫和非免疫櫻桃谷鴨所產(chǎn)種蛋，隨機(jī)取100枚免疫鴨種蛋和50枚非免疫組鴨種蛋，孵化至出雛。

1.1.4毒株 F4代鴨坦布蘇病毒（HB株），由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離、鑒定和保存，鴨半數(shù)感染量（DID50）為107.1/0.1mL。

1.1.56日齡SPF雞胚 購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.6SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物舍 由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào)為SYXK（京）2012—0005。

1.2方法

1.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)和攻毒 1日齡 66只免疫鴨種蛋孵化的雛鴨和34只非免疫鴨種蛋孵化雛鴨，腳環(huán)標(biāo)記，并采集血樣，分離血清，測(cè)定母源抗體，計(jì)算抗體陽(yáng)性率。隨機(jī)取出免疫種蛋孵化的5、7、10和

15日齡雛鴨10只和非免疫種蛋孵化的雛鴨5只，采血，分離血清，測(cè)定母源抗體，并以 0.1mL（含100DID50）/只的劑量經(jīng)腿部肌肉注射鴨坦布蘇病毒（HB株，F(xiàn)4代），隔離器里飼養(yǎng)。攻毒后觀察雛鴨的臨床癥狀，并于特定時(shí)間采集血清樣品進(jìn)行病毒分離和稱重。

1.2.2母源抗體測(cè)定 取每只雛鴨血清，56℃水浴滅活30 min，適宜倍數(shù)稀釋后備用。將F4代鴨坦布蘇病毒-HB病毒稀釋至200ELD50/0.1mL，與等量稀釋血清37℃水浴作用1 h，同時(shí)設(shè)100ELD50病毒對(duì)照組。每份樣品經(jīng)卵黃囊途徑接種5枚6日齡SPF雞胚，0.1 mL/枚，孵化至168 h，棄去24 h之內(nèi)死亡的雞胚，記錄雞胚存活數(shù)。將保護(hù)率不低于80%（4/5）的血清判為抗體陽(yáng)性，將保護(hù)率為20%（1/5）—60%（3/5）的血清判為抗體可疑，將保護(hù)率為 0%（0/5）的血清判為抗體陰性。計(jì)算雛鴨母源抗體的陽(yáng)性率，分析母源抗體下降趨勢(shì)。

1.2.3效力評(píng)價(jià)

1.2.3.1臨床癥狀觀察 觀察雛鴨攻毒后的臨床表現(xiàn)（采食量、糞便、精神和死亡情況），觀察至攻毒后10 d。

1.2.3.2病毒分離 攻毒后2 d經(jīng)頸靜脈采血，分離血清。每份血清接種5枚6日齡SPF雞胚，0.1 mL /枚，37℃孵化，24h以內(nèi)死亡雞胚視為非特異死亡，孵化至168 h。只要有1枚及以上雞胚死亡則判該鴨感染。計(jì)算母源抗體雛鴨組的攻毒保護(hù)率和無(wú)母源抗體組的發(fā)病率。

1.2.3.3增重比較 攻毒后5 d，分別稱量雛鴨的體重，計(jì)算平均日增重。對(duì)成對(duì)樣本進(jìn)行T檢驗(yàn)，分析母源抗體對(duì)雛鴨增重的影響。

2　結(jié)果

2.1雛鴨母源抗體

1日齡雛鴨的母源抗體陽(yáng)性率最高，為56.1% （37/66），達(dá)到最高檢測(cè)值；5、7、10和 15日齡雛鴨的母源抗體陽(yáng)性率分別為 40%（4/10）、50%（5/10）、30%（3/10）和 0%（0/10），5—7 d抗體陽(yáng)性率處于平臺(tái)期，隨著日齡的增長(zhǎng)，抗體陽(yáng)性率呈逐漸下降趨勢(shì)，10日齡時(shí)降至30%，15日齡時(shí)母源抗體降低至全陰性。鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗母源抗體效價(jià)及消長(zhǎng)規(guī)律（表1和圖1）。

圖1　母源抗體效價(jià)及消長(zhǎng)規(guī)律Fig.1 Maternal antibody titers and tendency of growth or decline

表1　雛鴨母源抗體陽(yáng)性率Table 1 Positive maternal antibody titers of ducklings

2.2母源抗體的效力

2.2.1臨床癥狀

2.2.1.1免疫種蛋孵化雛鴨 除個(gè)別鴨出現(xiàn)一過(guò)性精神沉郁和綠色糞便外，未見異常臨床表現(xiàn)。

2.2.1.2非免疫種蛋孵化雛鴨 各日齡組雛鴨攻毒后3 d開始，對(duì)照組雛鴨精神沉郁，綠色糞便，增重變緩。5日齡鴨有4只出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，2只鴨分別于攻毒后7 d和9 d死亡。7日齡雛鴨有2只出現(xiàn)仰翻和側(cè)翻的神經(jīng)癥狀。

2.2.2增重變化

2.2.2.1免疫種蛋孵化雛鴨 5、7、10和15日齡雛鴨攻毒后5 d平均增重115.5、142.8、177.8和 162.2g。

2.2.2.2非免疫種蛋孵化雛鴨 5、7、10和15日齡雛鴨攻毒后5 d平均增重54.5、91.0、165.0和118.8g （表2）。

表2　攻毒后5日雛鴨平均增重Table 2 Average weight gain of ducklings 5 days post infection

2.2.2.3增重差異性分析 P值為0.027，小于0.05，結(jié)果（表3）。

表3　增重T檢驗(yàn)Table 3 T test of average weight gain

2.2.3攻毒保護(hù)率

2.2.3.1免疫種蛋孵化雛鴨 5、7、10和15日齡雛鴨的攻毒保護(hù)率分別為50%（5/10）、60%（6/10）、20%（2/10）和0%（0/10）。

2.2.3.2非免疫種蛋孵化雛鴨 5、7、10和15日齡雛鴨的發(fā)病率均為100%（表4）。

表4　雛鴨攻毒保護(hù)率Table 4 Protection rate of ducklings against virus infection

3　討論

在禽類中，除鴿外，來(lái)自產(chǎn)蛋母禽的保護(hù)性抗體只能通過(guò)種蛋傳遞給子代雛禽，雛禽體內(nèi)母源抗體水平的高低與免疫接種的日齡密切相關(guān)。雛禽的母源抗體水平與首次免疫時(shí)間和效果密切相關(guān)，因此探究母源抗體消長(zhǎng)規(guī)律就顯得非常重要［25］。目前鴨和鵝方面鴨坦布蘇病毒病疫苗母源抗體變化情況尚未見報(bào)道，關(guān)于疫苗免疫家禽后，研究人員對(duì)雞、鴨和鵝新城疫母源抗體的消長(zhǎng)規(guī)律進(jìn)行了大量研究。王澤霖研究認(rèn)為，雛雞出殼后第7天母源抗體最高，此后逐漸下降，半衰期4.5 d［26］。蔡寶祥則認(rèn)為，雛雞出殼后3 d母源抗體最高，此后呈完全下降趨勢(shì)［27］。章懷云等認(rèn)為雛雞出殼后第1天母源抗體最高，此后呈完全下降趨勢(shì)［28］。鴨和鵝均在3—5日齡時(shí)出現(xiàn)高峰［29］。因禽類的母源抗體來(lái)源卵黃，母源抗體的高低與家禽品種和卵黃吸收有關(guān)，本次試驗(yàn)測(cè)定櫻桃谷肉鴨的母源抗體，麻鴨母源抗體的消長(zhǎng)規(guī)律是否存在差異，尚需要進(jìn)一步研究。

本次雛鴨母源抗體的測(cè)定結(jié)果表明，種鴨免疫鴨坦布蘇病毒病疫苗后，1日齡雛鴨的母源抗體陽(yáng)性率最高，這與章懷云等報(bào)道的一致。陽(yáng)性雛鴨的比例在7日齡前變動(dòng)范圍較小，7日齡后陽(yáng)性比例開始下降，15日齡時(shí)雛鴨母源抗體均為陰性。雛鴨母源抗體陽(yáng)性率與攻毒后雛鴨的平均增重和攻毒保護(hù)率的結(jié)果相一致，呈正相關(guān)。母源抗體雛鴨的平均增重顯著高于對(duì)照組鴨，其中5和7日齡雛鴨平均增重和攻毒保護(hù)率最高，10和15日齡雛鴨的母源抗體盡管低或陰性，與對(duì)照鴨相比，仍然有明顯的保護(hù)作用。種鴨產(chǎn)生的免疫抗體除保護(hù)自身外，可以通過(guò)卵黃傳遞給雛鴨，起到了良好的天然被動(dòng)免疫作用，能夠保護(hù)雛鴨抵抗鴨坦布蘇病毒的感染。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中，對(duì)免疫抗體較高的種鴨群，其后代疫苗首次免疫的時(shí)間以7—10日齡為最佳。

攻毒后，對(duì)照鴨表現(xiàn)精神沉郁、仰翻和側(cè)翻及死亡的發(fā)病癥狀，具有母源抗體的雛鴨臨床癥狀明顯輕于對(duì)照組，但從臨床癥狀的輕和重來(lái)判定母源抗體的保護(hù)作用存在難以操作的具體困難。由于是新發(fā)傳染病，如何評(píng)價(jià)母源抗體的被動(dòng)保護(hù)作用，尚未有統(tǒng)一的方法。本研究中采用病毒分離法對(duì)雛鴨母源抗體效力評(píng)價(jià)的結(jié)果與平均增重的數(shù)據(jù)相一致，這表明，鴨坦布蘇病毒感染的程度與鴨坦布蘇病毒病臨床癥狀嚴(yán)重程度相一致，可以采用病毒分離的方法進(jìn)行母源抗體保護(hù)和疫苗效力的評(píng)價(jià)。

后裔雛鴨的母源抗體水平與種鴨的抗體水平高低直接相關(guān)，本試驗(yàn)中收集的是二次免疫后4個(gè)月的種鴨所產(chǎn)種蛋（疫苗免疫持續(xù)期末的種蛋），雛鴨母源抗體陽(yáng)性率與此有關(guān)。此時(shí)是疫苗免疫后期，推測(cè)如果收集免疫后較早時(shí)期的種蛋進(jìn)行孵化，則后裔雛鴨的抗體水平、陽(yáng)性率和攻毒保護(hù)率應(yīng)該更高。

4　結(jié)論

4.1鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗母源抗體能夠保護(hù) 10日齡內(nèi)雛鴨。

4.2疫苗首次免疫的時(shí)間以7—10日齡為最佳。

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（責(zé)任編輯 林鑒非）

Dynamic Study on Maternal Antibody of Duck Tembusu Virus Disease Inactivated Vaccine （HB Strain）

HAN Chun-hua1，ZHAO Ji-cheng1，DUAN Hui-juan1，LIN Jian1，YANG Zhi-yuan1，XIE Jia2，PAN Jie1，WANG Xiao-lei1，LIU Li-xin1，LIU Yue-huan1
（1Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Beijing Municipal Academy of Agricultural and Forestry Sciences，Beijing 100097；2Beijing Tongzhou District Agricultural Bureau，Beijing 101100）

【Objective】The objective of this study is to evaluate the efficacy of maternal antibodies induced by Duck Tembusu Virus Disease Inactivated Vaccine and to determine the age of optimal initial immunity.【Method】Fertilized eggs were collected at random from the Cherry Valley Duck farm which was 135 days post-vaccination with Duck Tembusu Virus Disease Inactivated Vaccine （HB strain），ten progeny ducklings from the immunized breed ducks and 5 progeny ducklings from non-immunized breedducks were randomly selected when they were 5 ，7 ，10，and 15 days old. Serum samples were collected from all ducks for the detection of maternal antibody，then the ducks were challenged with Duck Tembusu virus （HB strain） at 0.1ml（100DID50）/duck intramuscularly. Clinical symptoms of the challenged ducks were observed within 10 days，such as food intake，feces，abnormal clinical sighs and death. Serum samples were collected from all ducks for virus isolation via jugular vein on 2 days post inoculation （DPI）. Each serum sample was inoculated into five 6-day-old SPF chicken embryos at the inoculum of 0.1 ml per embryo. Then they were hatched at 37℃ for 168h. The chicken embryos died within 24h were discarded. If more than one （including one） death chicken embryos were obsearved，then it was concluded that virus isolation was positive. The rate of protection of ducklings with maternal antibody and the morbidity of ducklings without maternal antibody were calculated. On 5 dpi，all ducklings were weighed respectively，and the average daily gain was calculated. The effect of maternal antibody on the weight gain of ducklings were analyzed by T test for paired samples. The efficacy of maternal antibodies was evaluated by neutralizing antibody titer，body weight changes and virus isolation.【Result】 （1） The number of positive maternal antibody titers peaked in 1 day old ducklings was 56.1%（37/66），then fell to 40% （4/10） in ducklings on day 5，50% （5/10） on day 7，30% （3/10） on day 10，and 0% （0/10） on day 15. （2） On viral challenge，the control group showed signs of depression （20/20），neurologic disturbances （6/20） and death （2/20）. Ducklings with positive maternal antibody titers showed mild depression. （3） On 5 dpi，the average daily gain of 5-，7-，10- and 15-day old ducklings with maternal antibody were 115.5，142.8，177.8 and 162.2g，respectively，and that of the ducklings without maternal antibody were 54.5，91，165 and 118.8g，respectively. （4） The rate of protection against challenge with DTMUV of 5-，7-，10- and 15-day old ducklings with maternal antibody were 50%（5/10），60%（6/10），20%（2/10） and 0%（0/10），respectively. The morbidity of 5-，7-，10- and 15-day old ducklings without maternal antibody were all 100%. （5） The average weight gain and efficacy reached a peak in 5-day old and 7-day old ducklings，which were 50% （5/10） and 60% （6/10），respectively. Although the maternal antibodies decreased between 10 days old and 15 days old ducklings （20% and 0%），it still has protective effect compared with the control group. 【Conclusion】（1） Duck Tembusu Virus Disease killed vaccine maternal antibodies，so it play an important role in the protection of 10-day-old ducklings against virus infection； （2） Vaccination age is optimized between 7 to 10 days of age.

ducks； Tembusu virus； maternal antibody

2015-10-05；接受日期：2016-06-01

國(guó)家自然科學(xué)基金（310721597）、北京市自然科學(xué)基金（6072011）、北京市農(nóng)林科學(xué)院青年基金（QNJJ201308）、北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項(xiàng)（KJCX201204008）

聯(lián)系方式：韓春華，010-51503475；E-mail：hchh1224@126.com。通信作者劉月煥，Tel：010-51503475；E-mail：liuyuehuan@sina.com