于可響，馬秀麗，袁小遠，劉存霞，胡 峰，凌紅麗，李玉峰，黃 兵

（1山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所/山東省家禽疫病診斷與免疫重點實驗室，濟南 250023；2青島蔚藍生物股份有限公司，山東青島 266061）

鴨坦布蘇病毒雞胚弱化毒株的選育

于可響1，馬秀麗1，袁小遠1，劉存霞1，胡 峰1，凌紅麗2，李玉峰1，黃 兵1

（1山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所/山東省家禽疫病診斷與免疫重點實驗室，濟南 250023；2青島蔚藍生物股份有限公司，山東青島 266061）

【目的】將鴨坦布蘇病毒BZ_2010株在SPF雞胚上進行連續(xù)傳代致弱，旨在選育安全性高、免疫原性好的活疫苗候選毒株。【方法】以SPF雞胚為增殖宿主，將BZ_2010株連續(xù)傳代，直至第120代，以1日齡雛鴨和30周齡的產(chǎn)蛋種鴨為試驗對象，對第120代次毒株（命名為VC2）的安全性進行評價；以1d雛鴨為試驗對象，對VC2株的返強情況進行評價；以18周齡的種鴨為試驗對象，對VC2株免疫后的中和抗體進行監(jiān)測；以25周齡的種鴨為試驗對象，對VC2株免疫后的保護效果進行評價；利用RT-PCR方法分別擴增BZ_2010株和VC2株的E基因和NS4A基因，進行測序分析?！窘Y果】傳代病毒對雞胚的平均死亡時間逐漸縮短，而病毒毒價有逐漸提高的趨勢，ELD50由第20代的10-5.3/0.1mL提高到第120代的10-5.8/0.1mL，而且第80代之前提高較快，后期基本穩(wěn)定。將VC2株通過頸部皮下接種1d雛鴨和肌肉接種30周齡產(chǎn)蛋種鴨，接種后試驗鴨無異常臨床表現(xiàn)，肝臟也無明顯病理變化，這說明VC2株具有良好的安全性。將VC2在1d雛鴨進行連續(xù)5次傳代，未發(fā)現(xiàn)試驗鴨有任何異常癥狀，將第5代組織懸液接種1d雛鴨，采集肝臟進行病理切片觀察，發(fā)現(xiàn)無明顯病理變化，這說明VC2株具有良好的穩(wěn)定性?；驕y序分析結果顯示，VC2株 E蛋白的第86、157、189、301和312位氨基酸發(fā)生改變，而NS4A蛋白只有一個氨基酸發(fā)生突變，即第54位氨基酸由F變?yōu)長。VC2免疫種鴨后抗體水平上升很快，第4周即可達到高峰，并且維持較長時間；VC2免疫后于第2周和第50周利用強毒株進行攻毒試驗，結果VC2免疫組在攻毒后未出現(xiàn)異常癥狀，糞便正常，產(chǎn)蛋率保持正常，這說明VC2株免疫可對強毒株的攻擊產(chǎn)生完全保護?！窘Y論】通過雞胚連續(xù)傳代成功獲得了一株安全性高、免疫原性好的鴨坦布蘇病毒雞胚弱化毒株。VC2免疫種鴨后抗體水平上升很快，可維持較長時間。攻毒試驗結果表明，VC2株免疫可對強毒株的攻擊產(chǎn)生完全保護。

鴨坦布蘇病毒；雞胚；弱化；活疫苗

0　引言

【研究意義】鴨坦布蘇病毒?。╠uck Tembusu virus infection），又稱鴨黃病毒病，是2010年在中國首先暴發(fā)的一種新型傳染病。臨床上以種鴨、蛋鴨產(chǎn)蛋量驟減，育成鴨、商品肉鴨出現(xiàn)神經(jīng)癥狀為主要特征，該病來勢迅猛，傳播廣泛，給中國的種鴨養(yǎng)殖業(yè)造成的巨大經(jīng)濟損失［1-10］。目前，該病已經(jīng)成為一種常見病、多發(fā)病。本研究通過將鴨坦布蘇病毒在SPF雞胚上連續(xù)傳代，篩選出一株符合活疫苗標準的弱毒株，為鴨坦布蘇病毒活疫苗的研發(fā)奠定基礎?！厩叭搜芯窟M展】該病的病原為鴨坦布蘇病毒，屬于黃病毒科黃病毒屬。病毒基因組為不分節(jié)段的具有感染性的正鏈單股RNA，由10 990個核苷酸組成，只有一個長的開放閱讀框，其中5′端有帽狀結構，3′端無polyA尾［11-16］。編碼 3個結構蛋白基因：衣殼蛋白（C）、膜蛋白（PrM）、囊膜蛋白（E）和7個非結構蛋白，其中E蛋白與病毒致病力、組織親嗜性、宿主嗜性、免疫保護等密切相關［17-18］?！颈狙芯壳腥朦c】疫苗免疫是用于家禽疫病防控的主要措施，活疫苗的使用省時省力，適于在鴨群中批量免疫，但目前還沒有商品化的鴨坦布蘇病毒活疫苗，也沒有鴨坦布蘇病毒自然弱毒株的相關報道。【擬解決的關鍵問題】將鴨坦布蘇病毒BZ_2010株在SPF雞胚上進行傳代致弱，將120代次VC2毒株進行了安全性、遺傳穩(wěn)定性和免疫效力評價，旨在選育一株安全性高、免疫原性好的活疫苗毒株。

1　材料與方法

試驗于2011年1月至2015年5月在山東省家禽疫病診斷與免疫重點實驗室和山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所進行。

1.1病毒、雞胚、雛鴨、種鴨

鴨坦布蘇病毒BZ_2010株于2010年分自山東地區(qū) A種鴨場（在 10d SFP鴨胚上的 ELD50為10-6.2/0.1mL）；鴨坦布蘇病毒SX-12株于2012年分自山東地區(qū)B種鴨場（在10 d SFP鴨胚上的ELD50為10-5.9/0.1mL）；SPF雞胚由山東省昊泰動物繁育有限公司提供；鴨坦布蘇病毒抗體陰性的櫻桃谷雛鴨和種鴨由山東省德州市某種鴨場提供。

1.2病毒傳代與滴定

將鴨坦布蘇病毒 BZ_2010株用生理鹽水以 1:1 000倍稀釋，通過尿囊腔途徑接種9d SPF雞胚，棄掉接種24h內(nèi)死亡的雞胚，觀察并記錄雞胚死亡時間。收集接種24h后死亡雞胚的尿囊液，按照前面的接種方法繼續(xù)進行傳代，直至第120代（命名為VC2）。分別取第20、40、60、80、100和120代病毒在9 d SPF雞胚上測定雞胚半數(shù)致死量（ELD50）。方法如下：將病毒分別作10倍系列稀釋，即10-2、10-3…10-7、10-8共7個不同稀釋度，分別經(jīng)尿囊腔接種9 d雞胚，每個稀釋度接種5枚，0.1mL/枚，同時設生理鹽水對照組，觀察記錄接種后24—168 h內(nèi)雞胚死亡情況，并按Reed-Muench法計算ELD50。

1.3E蛋白與NS4A蛋白變異分析

參照BZ_2010株基因組序列（GenBank登錄號：KC990540）設計兩對引物，分別用于擴增VC2的E基因和NS4A基因，引物由上海立菲生物技術有限公司合成。按照RNAiso Reagent（TAKARA，JAPAN）試劑說明提取VC2病毒RNA，按照常規(guī)RT-PCR方法擴增E基因和NS4A基因并測序。將VC2的 E蛋白與NS4A蛋白序列同BZ_2010株進行比對分析。

1.4安全性試驗

將鴨坦布蘇病毒BZ_2010株和VC2株分別通過頸部皮下接種1 d雛鴨，接種劑量為104.0ELD50/只，每組試驗鴨接種20只。10只對照鴨用同樣體積的生理鹽水進行頸部皮下接種。接種后觀察試驗鴨的精神狀態(tài)與死亡情況。采集接種后發(fā)病或死亡試驗鴨的肝臟制備病理切片；若無發(fā)病或死亡的情況，則于接種后第7天剖殺試驗鴨取肝臟制備病理切片。

將鴨坦布蘇病毒BZ_2010株和VC2株分別通過腿肌注射30周齡的產(chǎn)蛋種鴨，接種劑量為106.0ELD50/只，每組試驗鴨接種30只。10只對照鴨用同樣體積的生理鹽水進行腿肌接種。接種后觀察試驗鴨的精神狀態(tài)與產(chǎn)蛋情況。

1.5病毒毒力返強試驗

將VC2以105.0ELD50/只的劑量通過腿肌注射的方式接種1 d雛鴨10只，5 d后剖殺取肝、脾、腦制成20%懸液，凍融3次后，取上清液再接種1 d雛鴨10只，連續(xù)傳代5次，觀察雛鴨的精神狀態(tài)。將第5代的組織懸液通過頸部皮下接種1 d雛鴨10只，接種劑量為104.0ELD50/只，觀察雛鴨的精神狀態(tài)。采集第5代組織接種后發(fā)病或死亡實驗鴨的肝臟制備病理切片；若無發(fā)病或死亡的情況，則于接種后第7天剖殺試驗鴨取肝臟制備病理切片。

1.6免疫后抗體中和效價的測定

將VC2以103.5ELD50/只的劑量通過胸肌注射的方式免疫18周齡種鴨200只，每隔4周隨機采集20份鴨血清通過雞胚中和試驗測定其中和抗體，直至免疫后56周，取中和抗體的平均值繪制抗體消長曲線。

1.7免疫后攻毒保護試驗

將VC2以103.5ELD50/只的劑量通過胸肌注射的方式免疫25周齡種鴨2 000只，分別于免疫后第2周和第50周利用鴨坦布蘇病毒SX-12株對試驗鴨進行攻毒，每組攻毒免疫鴨100只，陰性對照鴨100只，攻毒劑量為105ELD50/只。觀察并記錄試驗鴨發(fā)病情況及產(chǎn)蛋情況。

2　結果

2.1病毒傳代

將鴨坦布蘇病毒BZ_2010在SPF雞胚上進行連續(xù)傳代，結果發(fā)現(xiàn)雞胚的平均死亡時間有縮短的趨勢，而病毒毒價有逐漸提高的趨勢，ELD50由第 20代的10-5.3/0.1mL提高到第 120代的 10-5.8/0.1mL，而且第80代之前提高較快，后期基本穩(wěn)定（圖1）。

圖1　不同代次病毒的雞胚半數(shù)致死量Fig.1 ELD50of duck Tembusu virus VC2 strain at different passage times

2.2E蛋白與NS4A蛋白的變異分析

通過測序分析發(fā)現(xiàn)，VC2的E基因和NS4A基因與親本毒BZ_2010相比，分別有11個和3個堿基的差異，同源性分別為99.3%和99.2%。E基因的變異導致第86、157、189、301和312位氨基酸發(fā)生變化，而NS4A基因的變異導致第54位氨基酸由F變?yōu)長（表1）。

2.3安全性試驗

將BZ_2010和VC2分別通過頸部皮下接種1 d雛鴨20只，接種14 d內(nèi)BZ_2010接種組有7只死亡，大部分試驗鴨死亡前有神經(jīng)癥狀，而VC2接種組無死亡，且不表現(xiàn)神經(jīng)癥狀。肝臟的病理切片顯示，BZ_2010組試驗鴨的肝臟有明顯的脂肪變性，而VC2組與對照組相比無明顯變化（圖2）。

圖2　BZ_2010和VC2接種雛鴨后肝臟的病理變化Fig.2 Liver pathological changes of ducklings injected with BZ_2010 or VC2 （400×）

將BZ_2010和VC2分別通過腿肌注射30周齡的產(chǎn)蛋種鴨，結果發(fā)現(xiàn)，BZ_2010接種組從接種后第4天開始出現(xiàn)綠色糞便，產(chǎn)蛋同時下降，至第9天產(chǎn)蛋量由接種前的26枚降到5枚。VC2接種組的產(chǎn)蛋量保持穩(wěn)定，糞便也無變化。

2.4病毒毒力返強試驗

將VC2在1 d雛鴨進行連續(xù)5次傳代，未發(fā)現(xiàn)試驗鴨有任何異常癥狀。第5代組織懸液頸部皮下接種1 d雛鴨，也未發(fā)現(xiàn)任何異常癥狀。第5代組織接種后第7天剖殺實驗鴨取肝臟制備病理切片，結果顯示，VC2組與對照組相比，肝臟無明顯病理變化（圖3）。

圖3　第5代組織接種雛鴨后肝臟的病理變化Fig.3 Liver pathological changes of ducklings injected by fifth tissue （400×）

2.5免疫后抗體中和效價的測定

VC2免疫18周齡種鴨后定期采集血清，利用雞胚中和試驗測定其中和抗體，繪制抗體消長曲線（圖4）。結果顯示，VC2免疫后前4周中和抗體上升很快，到第4周時基本達到高峰，高峰期維持20周，然后緩慢下降，到56周時中和抗體效價仍能達到1∶22。

表1　第120代次病毒株的核苷酸與氨基酸突變情況Table 1 Change of nucleotide and amino acid of Tembusu virus at passage 120

圖4　VC2免疫種鴨抗體消長曲線Fig.4 Neutralization antibodies change curve of adult duck after VC2 immunization

2.6免疫后攻毒保護試驗

VC2免疫25周齡種鴨，分別于免疫后第2周和第40周對試驗鴨進行攻毒，結果顯示：免疫后第2周攻毒的對照組從攻毒后第4天開始出現(xiàn)綠色糞便，產(chǎn)蛋率從第3天開始下降，到第15天降至20%，VC2免疫組在攻毒后未出現(xiàn)異常癥狀，糞便正常，產(chǎn)蛋率保持正常的上升趨勢（圖5）。免疫后第50周攻毒的對照組從攻毒后第5天開始出現(xiàn)綠色糞便，產(chǎn)蛋率從第5天開始出現(xiàn)明顯下降，到第15天降至33%，VC2免疫組在攻毒后未出現(xiàn)異常癥狀，糞便正常，產(chǎn)蛋率保持穩(wěn)定（圖6）。

圖5　VC2免疫后第2周攻毒種鴨產(chǎn)蛋率的變化Fig.5 Laying rate change of ducks with SX-12 challenging at weeks 2 post-vaccination

圖6　VC2免疫后第50周攻毒種鴨產(chǎn)蛋率的變化Fig.6 Laying rate change of ducks with SX-12 challenging at weeks 50 post-vaccination

3　討論

鴨坦布蘇病毒病自從2010年在中國暴發(fā)以來，一直困擾著種鴨業(yè)的發(fā)展，生產(chǎn)中急需高效疫苗來預防該病。本研究將鴨坦布蘇病毒山東分離株BZ_2010在SPF雞胚進行連續(xù)傳代，直至第120代，獲得的第120代次毒株VC2的ELD50由親本毒的10-5.3/0.1mL提高到10-5.8/0.1mL，說明病毒在傳代過程中毒價在逐步上升。為了確定VC2株是否已經(jīng)致弱，筆者分別通過頸部皮下接種1d雛鴨和肌肉接種30周齡產(chǎn)蛋種鴨，結果顯示，VC2接種后試驗鴨無異常癥狀和死亡，糞便和產(chǎn)蛋率也保持正常。這些都說明VC2毒株已完全喪失了對鴨的致病力。進而又將該致弱株在1 d雛鴨體內(nèi)進行了毒力返強試驗，連續(xù)傳5代未出現(xiàn)任何返強跡象，這些數(shù)據(jù)表明，VC2候選疫苗株具有良好的安全性。

鴨坦布蘇病毒的E蛋白與病毒致病力、宿主嗜性等密切相關，而有報道非結構蛋白NS4A影響日本乙型腦炎對小鼠的致病力［19-25］。因此，選擇了E和NS4A這兩個蛋白進行測序分析，試圖在基因水平上找到VC2喪失對鴨的致病力原因。通過與親本毒BZ_2010比對分析發(fā)現(xiàn)，E蛋白的第86、157、189、301和312位氨基酸發(fā)生變化，其中第157、189位氨基酸位于結構域I區(qū)，這一區(qū)域內(nèi)發(fā)生的很多突變都與黃病毒毒力相關而NS4A蛋白只有一個氨基酸的突變，即第54位氨基酸由F變?yōu)長。這些突變或者突變組合（包括其他蛋白）可能是導致VC2致病力減弱的關鍵因素［26-30］。

為了評價弱毒株VC2的免疫效果，筆者進行中和抗體追蹤和攻毒保護試驗。結果顯示，VC2免疫種鴨后抗體水平上升很快，并且維持時間較長，衰減緩慢；VC2免疫后第2周和第50周都可產(chǎn)生完全保護，這說明VC2的免疫期很長，基本可以持續(xù)整個產(chǎn)蛋期。

4　結論

通過將鴨坦布蘇病毒在 SPF雞胚上進行連續(xù)傳代，獲得了安全性高、免疫原性好的弱毒株VC2，為鴨坦布蘇病活疫苗的研發(fā)奠定了基礎。

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［30］ AIHARA S，RAO C M，YU Y X，LEE T，WATANABE K，KOMIYA T，SUMIYOSHI H，HASHIMOTO H，NOMOTO A. Identification of mutations that occurred on the genome of Japanese encephalitis virus during the attenuation process. Virus Genes，1991，5（2）: 95-109.

（責任編輯 林鑒非）

Selection of a Live Chicken Embryo Attenuated Duck Tembusu Virus Vaccine

YU Ke-xiang1，MA Xiu-li1，YUAN Xiao-yuan1，LIU Cun-xia1，HU Feng1，LING Hong-li2，LI Yu-feng1，HUANG Bing1
（1Key Laboratory of Poultry Disease Diagnose and Immune of Shandong Province/Institute of Poultry，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan 250023；2Qingdao Vland Biotech Inc.，Qingdao 266061，Shandong）

【Objective】 Tembusu virus BZ-2010 strain was continuously passaged in specific-pathogen-free embryonic （SPF）eggs in order to select a live attenuated vaccine candidate of good safety and immunogenicity properties. 【Method】 Tembusu virus BZ-2010 strain was cultured for 120 passages in SPF eggs. The safety of the 120th passage viral strain was evaluated with 1-day-old SPF ducklings and 30-week-old egg-laying ducks. The property of virulent return of VC2 viral strain was evaluated with 1-day-old SPFducklings. The neutralizing antibodies were detected after the 18-week-old breeding ducks were immunized with VC2 strain. The protective effects were evaluated after the 25-week-old breeding ducks were immunized with VC2 strain. E gene and NS4A gene of BZ_2010 and VC2 strains were amplified by RT-PCR and sequenced. 【Result】 The average death time of SPF eggs was shortened by passage virus and viral titer was increased with the escalation of passage times in SPF chicken embryonic eggs. ELD50of the 20th virus was 10-5.3/0.1mL and ELD50of the 120th virus was 10-5.8/0.1mL.The viral titer reached the plateau at passage 80 and remained unchanged further passages. The experimental ducks showed no clinical symptoms after 1-day-old ducklings and 30-week-old breeding ducks were immunized with VC2 strain by subcutaneous injection and by intramuscular injection，respectively. The results showed that VC2 strain had a good safety. No symptoms appeared in 1-day-old ducklings in which VC2 strain were cultured for 5 passages. 1-day-old ducklings were infected with the 5th tissue suspension and no symptoms were observed in liver pathological section by microscope. The results showed that VC2 strain had a good stability. Sequence analysis revealed that the E protein of Tembusu VC2 evolved amino acid changes in positions 86，157，189，301，and 302，respectively. The NS4A protein of Tembusu VC2 only had one amino acid change in position 54 in that phenylalanine was replaced by Leucine. The level of antibodies rose very quickly，reached the plateau at the 4th week and remained a long time. Ducks were challenged by TMUV virulent strain at 2 and 50 weeks after immunization with VC2 strain in the experimental group. There was no symptom，normal stool，and regular egg production in the vaccinated group after challenge of virulent strain. The results showed that VC2 strain could provide complete protection for the challenge of TMUV virulent strain.【Conclusions】 An attenuated strain of TMUV with good immunogenicity and high safety was acquired through serial passages of SPF chicken embryos. The level of antibodies rose very quickly and remained a long time after immunization of the VC2 attenuated strain. The toxicity attack experiments showed that VC2 could provide complete protection for the challenge of TMUV virulent strain.

duck Tembusu virus； chicken embryo； attenuation； live vaccine

2015-12-21；接受日期：2016-05-04

山東省自然科學基金面上項目（ZR2013CM037）、山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系家禽創(chuàng)新團隊計劃（SDAIT-13-011-01）、山東省海外高層次人才（泰山學者）引進計劃

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