小白菜自交不親和性相關(guān)基因的分子標(biāo)記開發(fā)

賈永鵬，李霞，周國(guó)林，林處發(fā)，汪愛華

（1.武漢市農(nóng)科院蔬菜科學(xué)研究所，340065；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)；3.武漢市農(nóng)科院）

小白菜自交不親和性相關(guān)基因的分子標(biāo)記開發(fā)

賈永鵬1，2，李霞1，周國(guó)林1，林處發(fā)3，汪愛華1

（1.武漢市農(nóng)科院蔬菜科學(xué)研究所，340065；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)；3.武漢市農(nóng)科院）

以自交親和系WS-199和自交不親和系WS-85為親本雜交獲得的F2分離群體為供試材料，采用BSA法結(jié)合SNP芯片技術(shù)，篩選出與自交不親和性相關(guān)的SNP標(biāo)記，并將SNP差異位點(diǎn)序列信息與白菜基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析，并進(jìn)一步開發(fā)SSR標(biāo)記，共獲得了與自交不親和性相關(guān)的SSR分子標(biāo)記BrA1-2、BrA1-3和BrA1-14，為分子標(biāo)記輔助自交不親和性雜交種生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

小白菜；自交不親和性；SNP；分子標(biāo)記

小白菜（Brassica campestrisssp.chinensis Makino）又稱不結(jié)球白菜，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，生長(zhǎng)期短，在適宜環(huán)境條件下可進(jìn)行周年種植，為我國(guó)長(zhǎng)江中下游及南方地區(qū)種植的重要蔬菜種類之一。小白菜的自交不親和現(xiàn)象十分普遍，利用自交不親和系生產(chǎn)F1代雜交種成為小白菜雜種育種的重要方法之一［1］。但是，由于自交不親和的表型容易受到環(huán)境條件和植株生理狀況的影響，導(dǎo)致植株的親和性難以判斷，致使在配置雜交組合和種子生產(chǎn)時(shí)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，準(zhǔn)確性差［2］。利用分子標(biāo)記輔助選擇，可以大大提高育種的效率［3］。

小白菜自交不親和性主要由S位點(diǎn)復(fù)等位基因控制［4］。當(dāng)雄蕊花粉粒攜帶的S等位基因與雌蕊的基因相同時(shí)，花粉管生長(zhǎng)受到抑制，表現(xiàn)出自交不親和；當(dāng)花粉粒攜帶的S等位基因與雌蕊的基因不相同時(shí)，花粉管正常生長(zhǎng)，表現(xiàn)為自交親和。在育種實(shí)踐中，能夠快速鑒定自交不親和性的S單元型至關(guān)重要［5］。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用分子標(biāo)記鑒定S單元型已成為目前主要的方法之一。前人做了很多研究，Nasrallah等［6］利用SLG6的cDNA克隆作為探針，對(duì)多個(gè)不同S單元型的全基因組DNA進(jìn)行RFLP分析，獲得了多個(gè)與S單元型連鎖的RFLPs標(biāo)記，初步建立了一種利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)快速鑒定S單元型的方法，可以在苗期鑒定材料的S單元型，比田間更加可靠；Nishio等［7］利用PCR-RFLP對(duì)10個(gè)白菜和10個(gè)甘藍(lán)材料的SLG基因多態(tài)性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)這種方法可以在十字花科的蔬菜中鑒定S單元型以及F1雜種的純度?？苄∨啵?］以甘藍(lán)型油菜為材料，利用與自交不親和基因連鎖的分子標(biāo)記輔助選育油菜自交不親和系，最終得到了改良的甘藍(lán)型油菜自交不親和系。因此，分子標(biāo)記在自交不親和性中的利用越來越重要，而開發(fā)新的自交不親和性標(biāo)記成為當(dāng)前的重點(diǎn)。

本研究以自交親和系WS-199和自交不親和系WS-85為親本構(gòu)建的F2分離群體為材料，采用BSA法和油菜60K SNP芯片雜交技術(shù)，對(duì)小白菜自交不親和性相關(guān)基因的分子標(biāo)記進(jìn)行設(shè)計(jì)與開發(fā)，為后續(xù)利用自交不親和性進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種提供可靠的理論依據(jù)與技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試材料為自交親和系WS-199和自交不親和系WS-85（由武漢市蔬菜科學(xué)研究所栽培與采后室提供）為親本構(gòu)建的F2分離群體。于2014年9月底，將F2群體種子播于大田，2015年1月將幼苗移栽到大棚中 （武漢市黃陂區(qū)武湖基地），2015年3月進(jìn)行套袋自交。所有材料依照田間常規(guī)方法進(jìn)行種植和管理。

1.2試驗(yàn)方法

①F2群體親和性調(diào)查、DNA的提取及BSA混池構(gòu)建a.F2群體親和性調(diào)查。在2015年3月對(duì)F2群體中的開花植株進(jìn)行套袋自交，調(diào)查植株的角果生長(zhǎng)和膨大情況，以及植株的結(jié)實(shí)情況，最終判斷植株的親和性。

b.DNA提取。選取苗期的小白菜鮮嫩葉片，采用改良CTAB法提取DNA。用UV-1800 PC紫外分光光度計(jì)（上海譜達(dá)儀器有限公司）測(cè)定DNA濃度，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，取部分原液稀釋到50 ng/mL作模板，其他放于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

c.BSA混池構(gòu)建。從群體中選取性狀明顯的親和系植株和不親和系植株各17株，采用DNAsecure Plant Kit新型植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，產(chǎn)品編號(hào)DP320）提取DNA，且DNA樣品保存在-80℃。利用組群分離分析法（BSA）構(gòu)建不親和池與親和池，對(duì)DNA進(jìn)行等量混合，構(gòu)成4個(gè)不親和基因池與4個(gè)親和基因池，用于芯片分析及后續(xù)引物篩選。

②SNP芯片設(shè)計(jì)采用油菜60K SNP芯片進(jìn)行雜交。a.DNA定量、擴(kuò)增。放在0.1 mol/L NaOH中變性，加入MA2和MSM，放在37℃雜交爐中擴(kuò)增20～24 h。

b.DNA片段化。加入FMS，在37℃干浴鍋1 h。

c.DNA富集。加入155 μL異丙醇，在4℃冰箱中放置30 min，倒出液體，室溫下干燥1 h。

d.DNA片段回收。加入RA1，用銀箔紙封口，在48℃雜交鍋中培養(yǎng)1 h。

e.DNA變性。在干浴鍋于95℃下變性20 min。

f.DNA與芯片雜交。準(zhǔn)備雜交盒，在芯片的每個(gè)樣品孔點(diǎn)樣12 μL，放在48℃雜交爐中16～24 h，轉(zhuǎn)速調(diào)至5檔。

g.洗芯片與染色。

h.芯片掃描。采用BeadArray Reader激光共聚焦掃描系統(tǒng)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

③SSR引物設(shè)計(jì)及篩選通過芯片數(shù)據(jù)分析處理，將獲得的差異序列和白菜基因組進(jìn)行Blast對(duì)比分析，選取同源序列相似度高的基因序列區(qū)段，進(jìn)行下一步SSR引物的開發(fā)，并提交到http:// wsmartins.net/websat/數(shù)據(jù)庫(kù)。SSR引物由上海生工工程公司（武漢）合成。

PCR反應(yīng)體系：DNA模板1 μL，引物1 μL，10×PCR Buffer 1 μL，dNTPs 0.2 μL，Mg2+0.8 μL，Taq聚合酶0.2 μL，用ddH2O補(bǔ)充至 10 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃3 min；94℃30 s，55～56℃30 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min；25℃30 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物采用6%聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳檢測(cè)，在電壓200 V下70～80 min后，進(jìn)行銀染和顯影，用清水沖洗干凈。在室溫下自然晾干，統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增條帶，并拍照保存。

2　結(jié)果與分析

2.1SNP芯片分析

對(duì)不同混池間芯片分析后，將SNP數(shù)據(jù)經(jīng)Genome Studio軟件進(jìn)行基因分型處理，通過不親和與親和數(shù)據(jù)之間的比較分析，共獲得100個(gè)差異位點(diǎn)，然后從芯片對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載這100個(gè)差異位點(diǎn)序列，將下載的100個(gè)差異位點(diǎn)序列和白菜基因組進(jìn)行對(duì)比，選取同源序列相似度大于98%的位點(diǎn)數(shù)據(jù)。分析表明，這些位點(diǎn)主要集中分布在白菜基因組的第1連鎖群（2 517 659～24 006 839）和第10連鎖群（8 961 370～16 442 481）。

2.2SSR分子標(biāo)記開發(fā)

針對(duì)第1和第10連鎖群上包含的差異堿基序列區(qū)段，在線設(shè)計(jì)SSR引物32對(duì)，部分引物序列如表1。將32對(duì)引物在親和池與不親和池中進(jìn)行DNA擴(kuò)增，共有 3對(duì)引物 BrA1-2、BrA1-3和BrA1-14在混合池中表現(xiàn)出多態(tài)性（圖1）。

表1　部分引物序列

圖1　SSR引物在混合池中的篩選情況

2.3群體單株驗(yàn)證

利用引物BrA1-2對(duì)F2群體中的親和單株進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，90株親和單株中僅有2個(gè)交換單株，遺傳距離約2.2 cM（圖2）。

圖2　引物BrA1-2在F2親和性單株中的驗(yàn)證

3　討論與結(jié)論

Bateman［4］首次提出了關(guān)于自交不親和性受單位點(diǎn)復(fù)等位基因控制的遺傳模式，為自交不親和性研究奠定了重要基礎(chǔ)。在S復(fù)等位基因位點(diǎn)上包含有S位點(diǎn)特異性糖蛋白SLG［9］、S位點(diǎn)受體激酶SRK［10］、S位點(diǎn)富含半胱氨酸蛋白SCR［11］和SP11［12］。當(dāng)花粉中的SCR或SP11與柱頭中的SRK、SLG相互識(shí)別，引發(fā)了自交不親和反應(yīng)。葛婷婷［13］利用不結(jié)球白菜（矮腳黃）002和210為親本，構(gòu)建了F2分離群體，開發(fā)到了一個(gè)與自交不親和基因連鎖的分子標(biāo)記BrSS15。Katsunori等［14］利用Kal-22（Brasscia rapa subsp.rapa）和Hal-400（B.rapa subsp.pekinensis）構(gòu)建了F2群體，通過對(duì)群體進(jìn)行2 a的自交不親和性調(diào)查和統(tǒng)計(jì)，結(jié)合884對(duì)SSR標(biāo)記和55對(duì)SNP與indel標(biāo)記進(jìn)行了自交不親和性的QTL分析，定位到了5個(gè)高度不親和性QTL位點(diǎn)BrHLSI-1、BrHLSI-2、BrHLSI-3、BrHLSI-4和BrHLSI-5，它們分別分布在白菜第7、3、2、10、6連鎖群上，而BrPUB8在第1連鎖群。BrPUB8是PUB8的同源基因，而PUB8可能是調(diào)控假性自花授粉植物自交不親和性的關(guān)鍵基因［15，16］。

隨著全基因組序列鑒定技術(shù)的快速發(fā)展，SNP標(biāo)記作為最新分子標(biāo)記類型，具有密度高、分布范圍廣、分型簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在分子遺傳研究中逐漸興起，已成功應(yīng)用在油菜QTL定位和全基因組關(guān)聯(lián)分析的研究當(dāng)中［17，18］。而在白菜研究上，目前，利用油菜60K SNP芯片技術(shù)開發(fā)標(biāo)記非常少見。由于進(jìn)行傳統(tǒng)的雜交測(cè)試（親和指數(shù)法）時(shí)，植株結(jié)實(shí)會(huì)受到外界環(huán)境的影響，因此親和性難以判斷，耗費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間和較多的人力。本研究將BSA分析法和SNP芯片技術(shù)結(jié)合起來，對(duì)小白菜中普遍存在的自交不親和現(xiàn)象進(jìn)行快速標(biāo)記開發(fā)，并能較快應(yīng)用于自交不親和基因類型的鑒定，加快育種的進(jìn)程，為白菜雜交組合的配置和實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)育種與分子育種的結(jié)合提供參考。

［1］楊林棟.分子標(biāo)記技術(shù)及其在大白菜遺傳育種中的應(yīng)用［J］.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，3（4）：30-33.

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Molecular Marker Development of Self-incompatibility Related Genes in Chinese Cabbage

JIA Yongpeng1，2，LI Xia1，ZHOU Guolin1，LIN Chufa3，WANG Aihua1
（1.Vegetable Research Institute，Wuhan Academy of Agricultural Science and Technology，340065；2.Huazhong Agricultural University；3.Wuhan Academy of Agricultural Science and Technology）

Taking an F2segregating population obtained by hybridization between self-compatible line WS-199 and self-incompatible line WS-85 as materials，combining with the BSA method and SNP biochip technology，we screened SNP markers which related to self-incompatibility，and compared the sequence information of SNP different loci with cabbage genome sequences.Furtherly，we developed SSR markers，and got SSR molecular markers BrA1-2，BrA1-3 and BrA1-14 which were related to self-incompatibility，providing technical support for the production of self-incompatibility hybrid assisted by molecular markers.

Chinese cabbage；Self incompatibility；SNP；Molecular markers

S634.3

A

1001-3547（2016）08-0038-04

10.3865/j.issn.1001-3547.2016.08.017

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目資助（2012BAD02B01-17）；武漢市農(nóng)科院2013年英才計(jì)劃項(xiàng)目

賈永鵬（1988-），男，碩士，從事蔬菜遺傳育種研究，電話：13476867223，E-mail：372176882@qq.com

周國(guó)林（1971-），男，通信作者，碩士，推廣研究員，從事蔬菜育種、蔬菜安全生產(chǎn)技術(shù)研究和推廣工作，電話：13971269033，E-maill：glzhou@126.com

汪愛華（1979-），女，通信作者，博士，現(xiàn)從事蔬菜育種研究，E-mail：wangaihualt@163.com

2016-02-24