化合物萘對(duì)斑馬魚(yú)(Daniorerio)發(fā)育毒性及基因組DNA甲基化影響的研究

陳宏姍，盛連喜，邊紅楓

(東北師范大學(xué)國(guó)家環(huán)境保護(hù)濕地生態(tài)與植被恢復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130117)

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化合物萘對(duì)斑馬魚(yú)(Daniorerio)發(fā)育毒性及基因組DNA甲基化影響的研究

陳宏姍，盛連喜，邊紅楓

(東北師范大學(xué)國(guó)家環(huán)境保護(hù)濕地生態(tài)與植被恢復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130117)

萘作為最簡(jiǎn)單的多環(huán)芳烴化合物，對(duì)水生生物有致死致畸作用，并能破壞生物的抗氧化防御系統(tǒng).選用模式生物雌性斑馬魚(yú)成體和胚胎為受試對(duì)象進(jìn)行了萘暴露處理.斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育從受精后3 h開(kāi)始進(jìn)行萘溶液染毒處理，處理濃度分別為0(對(duì)照組)，1.5，2.5和7.5 μg/L(3個(gè)處理組)，至受精后96 h結(jié)束.染毒期間觀察胚胎發(fā)育的毒理學(xué)終點(diǎn).成年雌性斑馬魚(yú)暴露在0，84，840 μg/L的萘溶液中96 h.研究結(jié)果表明，萘對(duì)斑馬魚(yú)胚胎具有發(fā)育毒性，受精后24 h凝結(jié)率及中樞神經(jīng)發(fā)育異常，有明顯的濃度依賴(lài)性.甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(MSAP)方法檢測(cè)肝臟、腦和肌肉組織受萘脅迫后DNA甲基化水平變化的結(jié)果表明，肝臟和腦中DNA甲基化變化水平較肌肉組織高.在肝臟中，DNA甲基化變化水平較對(duì)照組分別高出12.88%(84 μg/L處理組)和8.16%(840 μg/L處理組).

多環(huán)芳烴；萘；斑馬魚(yú)；表觀遺傳；DNA甲基化；MSAP

隨著現(xiàn)代工業(yè)、農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，新型化合物的種類(lèi)正在不斷增加，一些殘留期長(zhǎng)、環(huán)境毒性大或毒性較低但難以分解的化合物，尤其是在環(huán)境中長(zhǎng)時(shí)間積累并對(duì)人類(lèi)健康和周邊生物構(gòu)成嚴(yán)重威脅的持久性化合物(POPs)，如PBDEs，PFOS，PEE以及PAHs等，都屬于此類(lèi)化學(xué)物質(zhì).多環(huán)芳烴化合物(polycyclic aromatic hydrocarbon，PAHs)是1976年美國(guó)環(huán)保署(EPA)列出的16項(xiàng)優(yōu)先控制污染物之一，我國(guó)1990年提出的68種水體優(yōu)先控制污染物中就有7種屬于PAHs.它們對(duì)生物具有致癌、致畸、致突變的作用，且物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在自然界中難于降解，也是最早被發(fā)現(xiàn)和研究的化學(xué)致癌物之一[1-2].據(jù)統(tǒng)計(jì)，到2013年其總排放量已達(dá)53萬(wàn)t[3].萘(naphthalene)是相對(duì)分子質(zhì)量最低的PAHs類(lèi)化合物，進(jìn)入水生生態(tài)系統(tǒng)的主要渠道是煤焦油生產(chǎn)和蒸餾過(guò)程的后續(xù)排放以及石油產(chǎn)品和副產(chǎn)品的泄漏[4].20世紀(jì)七八十年代，萘作為工業(yè)材料被用做家用殺蟲(chóng)藥(樟腦丸)[5].萘的毒性雖然較低，但分布較廣，對(duì)光氧化有較低的敏感性，在水體中有較長(zhǎng)的持久性[6]，故也屬于PAHs類(lèi)污染物，成為環(huán)境毒理學(xué)和生態(tài)毒理學(xué)研究中備受關(guān)注的化學(xué)物質(zhì)之一.

伴隨著環(huán)境問(wèn)題出現(xiàn)的新變化，研究環(huán)境中各種有毒、有害污染物的損害作用及其機(jī)理的一門(mén)新型交叉學(xué)科——生態(tài)毒理學(xué)發(fā)展快速，并成為環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)管理和環(huán)境決策的科學(xué)依據(jù)和重要基礎(chǔ)[7].這個(gè)新學(xué)科的形成與方法學(xué)的不斷完善密切相關(guān).生物標(biāo)記法、免疫組織化學(xué)法、組學(xué)技術(shù)(包括蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué))等研究方法不斷完善和發(fā)展，推動(dòng)了分子生態(tài)毒理學(xué)的形成和發(fā)展.其中，化合物對(duì)DNA損傷是分子生態(tài)學(xué)研究的重要內(nèi)容[8].DNA甲基化測(cè)定則是判斷其損傷程度的主要方法.

DNA甲基化是表觀遺傳過(guò)程的最重要特征之一，能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)，環(huán)境因子通過(guò)影響表觀遺傳方式可直接或間接地造成基因表達(dá)的改變.一定條件下，DNA甲基化具有可逆性，因而也被稱(chēng)為“生物進(jìn)化系統(tǒng)中抵抗環(huán)境改變的緩沖器”[9].近10 多年來(lái)，該技術(shù)因通用性強(qiáng)、操作相對(duì)簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)而在毒理學(xué)研究中得到了應(yīng)用[10].劉莉莉等[11]的研究證實(shí)，5-脫氧雜氮胞苷可造成DNA的低甲基化；楊建平等[9]對(duì)致癌化學(xué)污染物的研究發(fā)現(xiàn)，TCE，DCA，TCA可誘導(dǎo)小鼠原癌基因表達(dá)量上升，同時(shí)伴有DNA去甲基化的發(fā)生；而在重金屬對(duì)魚(yú)體內(nèi)DNA甲基化影響的研究中發(fā)現(xiàn)，Cu，Zn，Pb，Cd及其混合重金屬離子能明顯提高鯽魚(yú)肝臟DNA、泥鰍DNA的總甲基化水平，且影響程度與Cd，Pb的性質(zhì)、質(zhì)量濃度及其作用的靶器官具有相關(guān)性[12-13].許多研究證實(shí)，甲基敏感擴(kuò)增多態(tài)性實(shí)驗(yàn)(methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP)是檢測(cè)基因組甲基化水平的理想方法，并被廣泛地應(yīng)用于動(dòng)、植物基因組的甲基化檢測(cè)中[14].

由于魚(yú)類(lèi)可以從水環(huán)境中吸收親脂性的有機(jī)污染物，因此很多生理效應(yīng)的變化都可以作為魚(yú)類(lèi)攝入有毒物質(zhì)后的警示指標(biāo)，如膽汁代謝物、抗氧化防御系統(tǒng)酶類(lèi)、微粒體單加氧酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶水平等生理效應(yīng)的變化都能作為多環(huán)芳烴評(píng)價(jià)的生理指標(biāo)[15].此外，這些化合物經(jīng)過(guò)魚(yú)類(lèi)的生物轉(zhuǎn)化后，導(dǎo)致突變或其他類(lèi)型遺傳物質(zhì)的損害[16]；DNA加合物也可以作為損傷性生物標(biāo)志物來(lái)評(píng)價(jià)污染物的遺傳毒性[17].

斑馬魚(yú)(Daniorerio)作為研究對(duì)象用于毒理學(xué)研究開(kāi)始于20世紀(jì)50年代；90年代后，斑馬魚(yú)作為脊椎動(dòng)物模式生物開(kāi)始得到廣泛應(yīng)用，我國(guó)的斑馬魚(yú)研究也在此后開(kāi)始進(jìn)入快速發(fā)展期，涉及毒理學(xué)研究的文章比例也較高[18].但從表觀遺傳學(xué)視野開(kāi)展的毒理學(xué)研究，特別是有關(guān)環(huán)境污染物危害的表觀遺傳學(xué)研究還相對(duì)較少.本文以模式生物雌性斑馬魚(yú)成體及胚胎(幼魚(yú))為受試對(duì)象，探究了萘對(duì)成魚(yú)各器官基因組DNA甲基化修飾水平及幼魚(yú)發(fā)育的影響，探討了由此而產(chǎn)生的表觀遺傳學(xué)毒性發(fā)生機(jī)制及其與有毒重金屬所產(chǎn)生的表觀遺傳學(xué)改變的異同，以為生態(tài)毒性評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù).

1　材料與方法

1.1斑馬魚(yú)萘暴露處理實(shí)驗(yàn)

1.1.1成年斑馬魚(yú)萘暴露處理

選取體重、體長(zhǎng)均一的成年雌性斑馬魚(yú)(Tubingen品系)，體長(zhǎng)(4.0±0.04)cm、體重(0.5±0.02)g，每濃度處理組5尾，設(shè)3組重復(fù).實(shí)驗(yàn)容器為5 L燒杯，各組溶液由兩種母液添加海水鹽稀釋而成，總體積4 L，每24 h更換溶液.成年雌性斑馬魚(yú)暴露預(yù)實(shí)驗(yàn)步驟參照魚(yú)類(lèi)化學(xué)暴露標(biāo)準(zhǔn)方法實(shí)施[19]，以確定萘對(duì)斑馬魚(yú)96 h的LC50值.萘為分析純，CN NO.4151；二甲基亞砜(DMSO)，CN NO.82001.先分別配制成84和840 μg/mL萘-二甲基亞砜母液，室溫避光保存.依據(jù)毒性預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，處理濃度設(shè)為溶劑對(duì)照組(0.01%二甲基亞砜)，84 μg/L和840 μg/L萘溶液處理組.投入實(shí)驗(yàn)用魚(yú)，28℃培養(yǎng)96 h.實(shí)體解剖鏡下分別取每個(gè)處理組斑馬魚(yú)的肝臟、腦和肌肉組織的材料，保存于RNA Store溶液(天根生化科技(北京) 有限公司)中，置于-20℃冰箱，備用.

1.1.2胚胎萘暴露處理

胚胎毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)參照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)操作指南進(jìn)行[20].選用發(fā)育狀態(tài)良好，體長(zhǎng)(4.0±0.04)cm、體重(0.5±0.02)g的成年斑馬魚(yú)，交配后選出發(fā)育完好的受精卵，待發(fā)育穩(wěn)定至受精后3 h進(jìn)行胚胎的靜態(tài)染毒.選用6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入10 mL的對(duì)照溶液(0.01%)二甲基亞砜或萘溶液(含0.01%二甲基亞砜).萘暴露處理的濃度分別為 0，1.5，2.5，7.5 μg/L；每個(gè)孔內(nèi)放30枚受精卵，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行.然后，將受試胚胎置于27℃的光照培養(yǎng)箱中孵化，光暗比為14/10 h. 染毒后，在倒置顯微鏡下觀察發(fā)育至受精后24(24 h pf)，48，72，96 h后的胚胎和幼魚(yú)的發(fā)育毒理學(xué)終點(diǎn)，包括受精后24 h胚胎凝結(jié)率、48 h跳速率、72 h神經(jīng)反射能力和96 h幼魚(yú)存活率.

1.1.3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以3個(gè)平行組的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.對(duì)每種毒理學(xué)指標(biāo)，采用Origin Lab軟件在對(duì)照組和受試組之間進(jìn)行Oneway-ANOVA分析，P<0.05時(shí)認(rèn)定為存在顯著性差異.

1.2試劑盒法提取斑馬魚(yú)肝臟基因組總DNA

取0. 3 g斑馬魚(yú)肝臟樣品，按照試劑盒的使用說(shuō)明提取，最后離心收集得到基因組DNA樣本，-20℃ 凍存?zhèn)溆?DNA提取試劑盒購(gòu)買(mǎi)于天根生化科技(北京) 有限公司.

1.3甲基敏感擴(kuò)增多態(tài)性實(shí)驗(yàn)

MSAP實(shí)驗(yàn)參考趙娜[21]所采用的方法和實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行，包括基因組DNA限制性酶切及連接、預(yù)擴(kuò)增、選擇性擴(kuò)增、聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染檢測(cè)、條帶統(tǒng)計(jì)和數(shù)據(jù)整理等.

1.3.1限制性酶切及連接

酶切連接前一天將相應(yīng)接頭的兩互補(bǔ)鏈1∶1混合，并使EcoRI接頭和HpaII/MspI接頭的10倍母液，終濃度分別為25，250 pmol/μL.雙酶切及連接體系包括：5%接頭，1倍反應(yīng)緩沖液(reaction buffer)，500 ng模板基因組DNA，1 U的EcoRⅠ，1 U的HpaⅡ/MspⅠ，1 U的T4 DNA連接酶(ligase)，其余為PCR級(jí)別實(shí)驗(yàn)用水.37℃保溫5 h，8℃保溫4 h，4℃過(guò)夜.

1.3.2預(yù)擴(kuò)增

以酶切連接產(chǎn)物為模板進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，反應(yīng)體系25 μL.之后，94℃預(yù)變性5 min，按以下參數(shù)擴(kuò)增 30 個(gè)循環(huán)：94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s.擴(kuò)增后72℃再延伸 10 min.用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在200～1 000 bp范圍內(nèi)DNA呈彌散狀分布為最佳酶切連接結(jié)果.根據(jù)DNA彌散帶的亮度，用0.1×TE 緩沖液(buffer)稀釋預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物10倍至40倍，作為選擇性PCR擴(kuò)增的DNA模板.

1.3.3選擇性擴(kuò)增

混勻體系后，按下列參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸80 s；以后每輪循環(huán)溫度遞減0.7℃或1℃，擴(kuò)增12或10輪.而后馬上進(jìn)行94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸80 s，擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增后72℃延伸10 min.

1.3.4變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染

將以上體系PCR 擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行4%聚丙烯酰胺凝膠電泳及硝酸銀染色.

1.3.5條帶統(tǒng)計(jì)及分析

根據(jù)銀染結(jié)果統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增結(jié)果，比較暴露組和對(duì)照組在同一等位位點(diǎn)的擴(kuò)增情況，有條帶記為1，無(wú)條帶記為0.

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1萘對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性半致死濃度

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算出雌性斑馬魚(yú)在萘-二甲基亞砜溶液暴露下的半數(shù)致死濃度(LC50)值(見(jiàn)圖1A).從圖1可以看出，雌性成年斑馬魚(yú)的96 h LC50值為8.4 mg/L，而且萘對(duì)斑馬魚(yú)毒性作用存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系.暴露實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)照組未出現(xiàn)異常癥狀；而暴露組加入萘溶液染毒2 min后，斑馬魚(yú)表現(xiàn)出異常跳躍、游動(dòng)不平衡、死亡增高等現(xiàn)象，而且死亡的個(gè)體腮部均有明顯充血癥狀，這些中毒反應(yīng)癥狀的程度隨著萘濃度的升高而越發(fā)明顯.

圖1　成年斑馬魚(yú)及胚胎-幼魚(yú)暴露96 h的存活率

萘對(duì)斑馬魚(yú)胚胎及幼魚(yú)發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其96 h LC50為30.8 μg/L(見(jiàn)圖1B)，對(duì)受精后24 h 卵凝結(jié)率、48 h心臟功能水平、72 h神經(jīng)反射發(fā)育水平與96 h幼魚(yú)成活率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2.斑馬魚(yú)胚胎于受精后3 h暴露于萘-二甲基亞砜溶液和空白對(duì)照后，24 h卵凝結(jié)率與72 h神經(jīng)發(fā)育水平變化與處理濃度表現(xiàn)出明顯的濃度依賴(lài)性.空白對(duì)照及1.5 μg/L處理組對(duì)卵凝結(jié)率及神經(jīng)發(fā)育未產(chǎn)生明顯影響(<5%)；濃度增加至7.5 μg/L時(shí)，24 h卵凝結(jié)率達(dá)到42.5%；染毒至受精后72 h，2.5 μg/L和7.5 μg/L處理組只有32.5%和28.5%的幼魚(yú)有正常的神經(jīng)發(fā)育，這表明，兩個(gè)濃度組中萘對(duì)斑馬魚(yú)胚胎和幼魚(yú)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育均有一定影響.各處理組在受精后48 h心臟發(fā)育水平上均并未發(fā)現(xiàn)異常.受精后96 h成活率對(duì)照組為82.5%；7.5 μg/L 處理組的斑馬魚(yú)胚胎其存活率下降到65%，而1.5 μg/L 處理組則高達(dá)到90%.毒物的這種“低濃度刺激效應(yīng)”在許多毒理學(xué)研究中都有所發(fā)現(xiàn)[22-23].

A 24 h卵凝結(jié)率，B 48 h心臟發(fā)育水平，C 72 h神經(jīng)發(fā)育水平， D 96 h幼魚(yú)成活率.

2.2MSAP結(jié)果

利用MSAP檢測(cè)方法得到了雌性斑馬魚(yú)不同組織的甲基化圖譜，結(jié)果顯示出3種條帶類(lèi)型：Ⅰ型是條帶在H(HpaⅡ/ EcoR I)和M(MspⅠ/EcoR I)兩個(gè)泳道同時(shí)出現(xiàn)，表明CCGG位點(diǎn)沒(méi)有甲基化；Ⅱ型是條帶只在H泳道出現(xiàn)，在M泳道缺失，表明CCGG位點(diǎn)半甲基化；Ⅲ型則是條帶在H泳道缺失，而在M泳道出現(xiàn)，表明CCGG位點(diǎn)全甲基化.根據(jù)電泳顯示的結(jié)果，每個(gè)泳道有20～30個(gè)片段，長(zhǎng)度為50～1 500 bp.其中，條帶清晰的長(zhǎng)度為100～750 bp的片段，占總條帶數(shù)的90%以上，將這部分片段作為“有意義片段”， 統(tǒng)計(jì)雌性斑馬魚(yú)3個(gè)組織全基因組DNA在CCGG未甲基化的位點(diǎn)、全甲基化的位點(diǎn)和半甲基化的位點(diǎn)占總位點(diǎn)數(shù)的比率，結(jié)果見(jiàn)表1.

從表1可知，斑馬魚(yú)暴露于不同濃度的萘處理組后，各組織中基因組DNA甲基化水平均發(fā)生了不同程度的變化.在萘-二甲基亞砜染毒96 h后，斑馬魚(yú)肝臟中DNA甲基化水平顯著升高，低濃度處理組(84 μg/L)基因組總甲基化水平達(dá)到45.57%，高濃度(840 μg/L)處理組達(dá)到了40.85%，分別比對(duì)照組升高了12.88%與8.16%.其中，對(duì)照組CCGG位點(diǎn)全甲基化16.69%，半甲基化16%；低濃度處理組CCGG位點(diǎn)全甲基化20.8%，半甲基化24.77%；高濃度處理組CCGG位點(diǎn)全甲基化19.51%，半甲基化21.34%.

腦組織的DNA甲基化水平變化趨勢(shì)與肝臟較為一致，低濃度處理組(84 μg/L)基因組總甲基化水平達(dá)到42.94%，高濃度處理組(840 μg/L)達(dá)到39.25%，分別比對(duì)照組升高了11.16%與7.91%.其中，對(duì)照組CCGG位點(diǎn)全甲基化14.21%，半甲基化17.13%；低濃度處理組CCGG位點(diǎn)全甲基化26.69%，半甲基化16.26%；高濃度處理組CCGG位點(diǎn)全甲基化22.12%，半甲基化17.13%.

表1　雌性斑馬魚(yú)組織基因組DNA甲基化水平分析檢測(cè)結(jié)果

肌肉組織的兩個(gè)處理組及對(duì)照組之間甲基化水平基本沒(méi)有差別，全甲基化和半甲基化位點(diǎn)比例也無(wú)差別.但與肝臟和腦組織的甲基化水平相比，肌肉組織的甲基化水平相對(duì)較低.

3　討論

胞嘧啶甲基化是脊椎動(dòng)物重要的表達(dá)調(diào)控手段，可以抑制相關(guān)基因的表達(dá)，而且通常呈負(fù)調(diào)控[24].正常情況下，CpG二核苷酸占有人類(lèi)基因組的10%，其中70%～80%都為甲基化的CpG位點(diǎn).未甲基化的CpG二核苷酸僅占全部的2%～3%，通常定位于5末端的啟動(dòng)子區(qū)域，也可以延伸到基因的外顯子區(qū)域，以CpG島的形式存在[25].啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化與組蛋白去乙酰化之間具有協(xié)同抑制基因轉(zhuǎn)錄的作用，在功能上等同于遺傳改變，如堿基的突變和缺失[26].DNA甲基化修飾已被確認(rèn)為是動(dòng)物癌癥發(fā)生過(guò)程中的重要機(jī)制之一[27].研究表明，癌癥相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)都存在異常的DNA甲基化，說(shuō)明致病基因表達(dá)或關(guān)閉都與胞嘧啶甲基化有關(guān)[28].已有研究證實(shí)，斑馬魚(yú)P53基因是化學(xué)誘變物的主要攻擊位點(diǎn)，它的突變很可能是腫瘤產(chǎn)生的主要因素[29].本研究中，斑馬魚(yú)在遭受到萘急性暴露處理后，各組織CCGG位點(diǎn)甲基化變異水平在高低濃度之間并無(wú)顯著性差異.其肝臟及腦組織中甲基化水平明顯升高，可能是很多基因的表達(dá)已經(jīng)被表觀遺傳的這種調(diào)控方式關(guān)閉所致.這一結(jié)果表明，作為PAHs類(lèi)化合物的萘造成斑馬魚(yú)甲基化變異影響的主要是肝臟與腦，其對(duì)神經(jīng)發(fā)育及肝臟致癌作用的潛在危害是不容忽視的；但另一方面，胞嘧啶CCGG位點(diǎn)甲基化水平如何作為定量的生物標(biāo)記還有待于深入研究.

有毒重金屬也可以導(dǎo)致斑馬魚(yú)DNA甲基化，而且這方面的研究開(kāi)展得比較早.朱國(guó)念等[12]的研究認(rèn)為，有毒重金屬也是通過(guò)對(duì)DNA甲基化水平以及組蛋白的修飾發(fā)揮作用的，可能的調(diào)控機(jī)制是其離子的脅迫導(dǎo)致魚(yú)組織的脂質(zhì)產(chǎn)生過(guò)氧化作用，使活性氧自由基不能被清除導(dǎo)致代謝受阻，并引發(fā)了DNA鏈的斷裂損傷.因此，重金屬引起DNA的甲基化水平升高可能是細(xì)胞保護(hù)DNA鏈不被降解的一種自調(diào)節(jié)方式.相對(duì)于重金屬，PAHs污染物萘由于其辛醇-水分配系數(shù)較低，因而更容易在水生生物體內(nèi)富集，能夠引起穩(wěn)態(tài)失調(diào)，進(jìn)入細(xì)胞后可能與細(xì)胞質(zhì)中的芳香烴受體(AHR)結(jié)合并使之激活后發(fā)生構(gòu)象改變，從而產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[30].萘的脅迫可使許多酶如脂質(zhì)過(guò)氧化酶、過(guò)氧化氫酶、乙酰膽堿酯酶和谷胱甘肽等重要生化酶類(lèi)水平的降低[31]，這將導(dǎo)致更多的自由基產(chǎn)生.可見(jiàn)化學(xué)污染物的物理化學(xué)性質(zhì)使其參與體內(nèi)生化反應(yīng)更直接，影響可能更廣泛.王麗等[32]的研究結(jié)果也表明，甲醛參與DNA甲基化可能是通過(guò)參與體內(nèi)四氫葉酸循環(huán)實(shí)現(xiàn)的.所以，高甲基化水平也預(yù)示著DNA分子的過(guò)度修飾可能引起其結(jié)構(gòu)和活性受到損害.這雖然與有毒重金屬致毒作用的最終結(jié)果相似，但作用機(jī)制和路徑可能有所不同，這也是下一步需要研究證實(shí)的問(wèn)題.

以往的研究證明，大部分有機(jī)污染物都要經(jīng)過(guò)肝臟參與氧化還原代謝，因而肝臟被認(rèn)定為多種污染物侵害的靶器官.所以，在一定劑量-時(shí)間作用下，也可以根據(jù)不同組織器官表觀遺傳調(diào)控水平的差異來(lái)推斷毒物主要攻擊的靶器官.在本研究中，萘暴露后，斑馬魚(yú)肝臟中DNA甲基化水平相對(duì)于腦和肌肉組織的變化更為顯著，這可能與肝臟的器官功能有關(guān)，使其對(duì)污染物吸收富集的數(shù)量較其他兩個(gè)組織更多.有研究證實(shí)，成年雄性斑馬魚(yú)暴露于DBP(500 μg/L)7 d或15 d，其肝臟過(guò)氧化物酶體增殖[33].肝臟通過(guò)生物轉(zhuǎn)化作用，將有毒物質(zhì)降解并轉(zhuǎn)化為沒(méi)有活性的基團(tuán)，使其不能再參與其他的代謝反應(yīng)，這對(duì)于機(jī)體的生命活動(dòng)至關(guān)重要，也是保護(hù)其他組織和器官的一種有限的“利他”機(jī)制.本研究檢測(cè)到的變異水平是全基因組范圍DNA甲基化水平，在兩個(gè)處理濃度脅迫下，隨著濃度增加甲基化水平變異幅度減小，如再逐漸增加濃度最后可能導(dǎo)致甲基化水平趨于穩(wěn)定，表現(xiàn)出對(duì)污染物不再敏感.這可能是由于器官?lài)?yán)重?fù)p傷或壞死，因而檢測(cè)不到變異后表現(xiàn)出的所謂的一種對(duì)污染物的“適應(yīng)行為”.

由于表觀遺傳的調(diào)控方式對(duì)環(huán)境污染物的刺激更為敏感，這在一定程度上對(duì)基因組具有保護(hù)作用，使外界刺激不能直接作用于遺傳信息，并形成了一道可自動(dòng)調(diào)節(jié)與恢復(fù)的“屏障保護(hù)系統(tǒng)”.當(dāng)這種系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)制與功能無(wú)法發(fā)揮作用時(shí)，有機(jī)污染物就將對(duì)機(jī)體進(jìn)入更深層次的和不可逆轉(zhuǎn)的侵害過(guò)程.所以，有必要篩選表觀遺傳調(diào)控的生物標(biāo)記，而且DNA甲基化作為一種監(jiān)測(cè)環(huán)境污染物誘導(dǎo)疾病發(fā)生的新型分子生物學(xué)指標(biāo)，有可能被應(yīng)用于診斷、病情監(jiān)控和預(yù)后評(píng)價(jià)等方面[34].目前的研究已表明腫瘤作為一種基因病，是環(huán)境和遺傳的致癌因素所導(dǎo)致的細(xì)胞的非致命性損傷，因?yàn)樗鼈兛梢曰罨┗蚧蚴挂职┗蚴Щ?而DNA甲基化也是調(diào)控癌癥相關(guān)基因表達(dá)的重要方式，尤其是在CpG島甲基化水平的調(diào)控方面.

4　結(jié)論

本文的研究結(jié)果表明，斑馬魚(yú)不同組織DNA甲基化水平的變異與萘脅迫有直接關(guān)系，并可在短期內(nèi)做出迅速反應(yīng)，說(shuō)明用DNA甲基化水平變化來(lái)評(píng)價(jià)萘的毒性影響是可行的.依據(jù)“中心法則”DNA→mRNA→蛋白質(zhì)的信息傳遞路徑，DNA水平調(diào)節(jié)的評(píng)價(jià)指標(biāo)較基因表達(dá)水平、酶學(xué)水平上的調(diào)節(jié)將更早也更敏感.因此，以表觀遺傳學(xué)方法篩選更靈敏的生物標(biāo)示物，探測(cè)多環(huán)芳烴對(duì)機(jī)體健康傷害后的早期生物學(xué)變化將是毒理學(xué)研究的一個(gè)新方向.本文的研究結(jié)果證實(shí)，受到萘的脅迫后不同組織出現(xiàn)了各具特異性的甲基化變異，這些變異位點(diǎn)可能就是污染物對(duì)該組織器官損傷的甲基化調(diào)控?zé)狳c(diǎn)及癌癥發(fā)生的先前突破點(diǎn).這些位點(diǎn)的變異是否對(duì)同類(lèi)多環(huán)芳烴污染物都有相同的指示趨向性，它們參與了哪些基因表達(dá)的調(diào)控，將是今后需要關(guān)注的重要問(wèn)題.

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(責(zé)任編輯：方林)

Investigation of the effects of developmental toxicity and genomic DNA methylation upon naphthalene exposure in zebrafish(Daniorerio)

CHEN Hong-shan，SHENG Lian-xi，BIAN Hong-feng

(State Environmental Protection Key Laboratory of Wetland Ecology and Vegetation Restoration，Northeast Normal University，Changchun 130117，China)

The naphthalene as the simplest PAHs(polycyclic aromatic hydrocarbons)，is considered to be lethal and teratogenic effects on aquatic organism，also refers to the disruption of antioxidant defense system function. In the present study，adult female zebrafish(Daniorerio) and embryo(Tubingen line) were used to naphthalene exposure tests. Zebrafish embryos were exposed to different concentrations of naphthalene(0，1.5，2.5，7.5 μg/L) from 3 h post-fertilization(hpf) to 96 h pf. During the exposure period，embryo developmental endpoints were examined by microscope. The adult zebrafish were exposed to 0，84 μg/L and 840 μg/L of naphthalene for 96 h. Exposure to naphthalene caused a developmental toxicity，including reduced survival，increased coagulation rates and abnormal 72 h pf response ability in a dose-dependent manner. After the naphthalene exposure，used the MSAP(methylation sensitive amplification polymorphism) analysis to measure the DNA methylation level changes in adult female zebrafish liver，brain and muscle. Higher DNA-methylation level changes showed in the liver and brain than that in muscle. Especially in the liver，DNA methylation level changes in treatment groups are 12.88%(84 μg/L) and 8.16%(840 μg/L) higher than that in control groups respectively.

polycyclic aromatic hydrocarbon;naphthalene；MSAP;zebrafish；epigenetic;DNA methylation

1000-1832(2016)03-0167-07

2015-05-12

國(guó)家水體污染控制與治理科技重大專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目(2008ZX07207-009-03).

陳宏姍(1985—)，女，博士研究生；通訊作者：盛連喜(1961—)，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事于環(huán)境生態(tài)與濕地保護(hù)研究.

X 171.5[學(xué)科代碼]610·1040

A

[DOI]10.16163/j.cnki.22-1123/n.2016.03.030