酶解法制備鰈魚骨蛋白胨及其細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)

欒君笑，劉志昌，佟長青，曲 敏，李 偉，金 橋

(遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連 116023)

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酶解法制備鰈魚骨蛋白胨及其細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)

欒君笑，劉志昌，佟長青，曲 敏，李 偉，金 橋*

(遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連 116023)

[目的] 研究鰈魚骨蛋白胨的制備工藝并對(duì)其在細(xì)菌培養(yǎng)中的應(yīng)用進(jìn)行了初步探討。[方法] 采用乙酸和胃蛋白酶提取鰈魚骨蛋白胨，以蛋白提取率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化制備工藝，并對(duì)鰈魚骨蛋白胨作為氮源在細(xì)菌培養(yǎng)中的應(yīng)用進(jìn)行了研究。[結(jié)果] 鰈魚骨蛋白胨提取的最佳工藝條件為：提取時(shí)間20 h、提取溫度40 ℃、料液比1∶50 g/mL、胃蛋白酶加酶量3 000 U/g，在此條件下鰈魚骨蛋白胨的提取率為55.62%。蛋白胨產(chǎn)品的氨基酸種類齊全。通過細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，鰈魚骨蛋白胨的培養(yǎng)效果與市售細(xì)菌學(xué)蛋白胨相似。[結(jié)論] 鰈魚骨蛋白胨能夠提供細(xì)菌生長所需要的氮源營養(yǎng)，可作為氮源應(yīng)用于細(xì)菌的培養(yǎng)。

鰈魚骨；蛋白胨；氨基酸組成；細(xì)菌培養(yǎng)

魚類在加工過程中，會(huì)產(chǎn)生大量下腳料(包括魚頭、魚骨、魚皮、魚鱗、魚鰭及內(nèi)臟等)，其質(zhì)量約占原料魚的40%～55%[1]，魚骨是魚的主要副產(chǎn)物，約占魚體重的15%[2]。目前，發(fā)達(dá)國家的水產(chǎn)品加工率在80%以上，而我國的水產(chǎn)品加工率距離這一水平仍有差距[3]。魚加工下腳料中含有豐富的蛋白質(zhì)、磷脂質(zhì)、軟骨素、維生素等[4]，這些營養(yǎng)物質(zhì)和有用成分是重要的生物資源，但目前這些下腳料主要用來生產(chǎn)魚貯飼料、魚粉等，對(duì)其中有價(jià)值的成分尚未充分利用。如何深度開發(fā)魚下腳料的利用途徑，對(duì)水產(chǎn)品加工綜合利用和保護(hù)環(huán)境有重要的意義，也能支持和促進(jìn)我國水產(chǎn)行業(yè)的健康發(fā)展。

魚類下腳料加工的綜合利用是近年的研究熱點(diǎn)，其中利用酶法水解下腳料提取蛋白物，是下腳料的高值化利用的主要途徑之一[5]。蛋白胨是可溶于水、具有加熱不凝固特性的蛋白水解物[6]，可為微生物的生命代謝提供氮源營養(yǎng)，是許多微生物培養(yǎng)基的重要組分。蛋白胨的生產(chǎn)常用酸水解、堿水解和酶水解等方法，其中酶解法因具有操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)而逐漸取代了酸堿等化學(xué)方法。但酶解法生產(chǎn)蛋白胨普遍存在產(chǎn)品提取率低、酶成本高等不足，因此，研究新的蛋白胨生產(chǎn)工藝對(duì)降低生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)品的提取率具有重要的意義。

自從1949年，Tarr等首次將魚蛋白胨用于細(xì)菌培養(yǎng)以來[7]，不少學(xué)者對(duì)水產(chǎn)蛋白質(zhì)的酶解產(chǎn)物(外源蛋白酶水解或內(nèi)源蛋白酶自溶)作為氮源營養(yǎng)應(yīng)用于微生物培養(yǎng)進(jìn)行了研究[8-12]，但目前少見利用酶解鰈魚魚骨制備蛋白胨的報(bào)道。筆者采用低濃度的乙酸與胃蛋白酶結(jié)合的方法，對(duì)影響酶解過程的各因素進(jìn)行了研究，確定了鰈魚骨酶解制備蛋白胨的最佳提取工藝條件，對(duì)蛋白胨產(chǎn)品的氨基酸組成進(jìn)行了檢測(cè)，并對(duì)其作為氮源營養(yǎng)在細(xì)菌培養(yǎng)上的應(yīng)用進(jìn)行了初步探討。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1原料。鰈魚骨，黃金鰈魚(LimandaAspera)中翅骨取自大連美漁坊食品有限公司，放置于冰柜中冷凍保存。

1.1.2主要試劑。胃蛋白酶(1∶3 000)，Amresco公司；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(A9781-5 mL)、PITC(P1034-1 mL)，西格瑪；市售細(xì)菌學(xué)蛋白胨及胰蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；乙酸、氯化鈉、碳酸鈉、氫氧化鈉、硫酸銅、酒石酸鉀、硫酸鋰、甲醇、乙腈、濃鹽酸、無水乙酸鈉、冰醋酸等，均為分析純。

1.1.3供試菌種及培養(yǎng)基。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，均由大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.4。

1.1.4主要儀器。BS110 S分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；UV-1750紫外分光光度計(jì)，島津儀器(蘇州)有限公司；HH-A數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；FW100干式粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；HG202-1A烘箱，南京實(shí)驗(yàn)儀器廠；SD-1500噴霧干燥機(jī)，上海沃迪自動(dòng)化裝備股份有限公司；LC-20A高效液相色譜儀，島津；HH.B11.420-BS恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.2方法凍魚骨經(jīng)解凍，蒸餾水清洗后烘箱50 ℃烘至恒重，干魚骨絞碎成小片，使用干式粉碎機(jī)研磨成粉末待用。

1.2.1胃蛋白酶添加量的選擇。稱取10 g鰈魚魚骨，加入30倍體積的0.5 mol/L乙酸溶液，在37 ℃條件下分別加入1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、3 500 U/g胃蛋白酶，水解24 h后在沸水浴滅酶。采用福林-酚法[13]測(cè)定蛋白提取率，確定最適酶添加量。

1.2.2酶解溫度的選擇。稱取10 g鰈魚魚骨，加入30倍體積的0.5 mol/L乙酸溶液及胃蛋白酶(2 500 U/g)，分別在25、30、35、40、45、50 ℃條件下水解24 h，滅酶，測(cè)定蛋白提取率，確定最適酶解溫度。

1.2.3酶解時(shí)間的選擇。稱取10 g鰈魚魚骨，加入30倍體積的0.5 mol/L乙酸溶液及胃蛋白酶(2 500 U/g)，40 ℃條件下分別水解4、8、12、16、20、24、28、32 h，滅酶，測(cè)定蛋白提取率，確定最適酶解時(shí)間。

1.2.4料液比的選擇。稱取10 g鰈魚魚骨，加入料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL的0.5 mol/L乙酸溶液及胃蛋白酶(2 500 U/g)，40 ℃條件下水解24 h，滅酶，測(cè)定蛋白提取率，確定最適料液比。

1.2.5乙酸濃度的選擇。稱取10 g鰈魚魚骨，加入30倍體積濃度為0.1～0.6 mol/L乙酸溶液及胃蛋白酶(2 500 U/g)，40 ℃條件下分別水解24 h，滅酶，測(cè)定蛋白提取率，確定最適乙酸濃度。

1.2.6酶解最優(yōu)工藝條件的確定。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用福林-酚法測(cè)定蛋白提取率作為考察指標(biāo)，對(duì)水解條件進(jìn)行優(yōu)化，以胃蛋白酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度、料液比進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)，確定酶解的最佳工藝，因素水平表見表1，按L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)。根據(jù)最優(yōu)工藝條件制備蛋白胨酶解液，然后噴霧干燥制備蛋白胨產(chǎn)品，噴霧干燥機(jī)進(jìn)風(fēng)設(shè)定為180 ℃，出風(fēng)設(shè)定90 ℃，風(fēng)機(jī)速度設(shè)定為50 Hz，蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速設(shè)定為800 mL/h，噴霧壓力設(shè)定為4.1×105Pa。

表1　正交試驗(yàn)因素水平

1.2.7蛋白胨產(chǎn)品氨基酸組成分析。利用異硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生化RP-HPLC法[14]測(cè)定鰈魚骨蛋白胨產(chǎn)品的氨基酸組成。

1.2.8細(xì)菌生長試驗(yàn)。將活化好的細(xì)菌接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，每隔一定時(shí)間測(cè)定OD600，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制微生物生長曲線[15]。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果由圖1可見，隨著胃蛋白酶添加量的增加，鰈魚骨蛋白的提取率呈上升趨勢(shì)，但當(dāng)胃蛋白酶用量超過2 500 U/g時(shí)，增加酶用量蛋白提取率增加緩慢，3 000 U/g為提取率最高的酶用量。因此，初步選定3 000 U/g為最佳酶量。

圖1　不同酶添加量對(duì)蛋白胨提取率的影響Fig.1　Effects of different pepsin concentrations on extraction of peptone

如圖2所示，蛋白提取率隨溫度上升緩慢增加，最高點(diǎn)為提取溫度45 ℃，超過該溫度后蛋白提取率下降。

圖2　不同酶解溫度對(duì)蛋白胨提取率的影響Fig.2　Effects of different hydrolysis temperature on extraction of peptone

如圖3可知，24 h以內(nèi)隨著提取時(shí)間的增加，蛋白提取率增長較快，超過24 h增長不明顯。因此，初步選定24 h為最佳提取時(shí)間。

圖3　不同酶解時(shí)間對(duì)蛋白胨提取率的影響Fig.3　Effects of different hydrolysis time on extraction of peptone

如圖4所示，料液比在1∶10～1∶60 g/mL時(shí)，隨著提取介質(zhì)的增加，提取率不斷增加，但當(dāng)料液比達(dá)到1∶40 g/mL后，提取率幾乎不變?？紤]到液體體積過大會(huì)給后期分離純化帶來不便，因此料液比定為1∶40 g/mL較為合適。

圖4　不同料液比對(duì)蛋白胨提取率的影響Fig.4　Effects of different solid-liquid ratio on extraction of peptone

如圖5所示，當(dāng)乙酸濃度為0.4 mol/L時(shí)，提取率最高。因此，初步選定0.4 mol/L乙酸為最適乙酸濃度。

圖5　不同乙酸濃度對(duì)蛋白胨提取率的影響Fig.5　Effects of different acetic acid concentration on extraction of peptone

2.2正交試驗(yàn)結(jié)果在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以蛋白提取率為指標(biāo)采用正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由極差分析(R值)可知，4個(gè)因素對(duì)鰈魚骨蛋白提取率的影響大小依次為D、C、A、B，即料液比、酶解溫度、加酶量、酶解時(shí)間；優(yōu)化所得條件為A2B1C1D3，即加酶量3 000 U/g、酶解時(shí)間20 h、酶解溫度40 ℃、料液比1∶50 g/mL，在此條件下鰈魚骨蛋白胨的提取率為55.62%。

2.3鰈魚骨蛋白胨的氨基酸組成鰈魚骨蛋白胨產(chǎn)品的氨基酸種類較為齊全，谷氨酸和甘氨酸含量較多，分別為13.48%和14.71%，其余氨基酸含量在1.21%～9.34%，其中組氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸含量較低。除色氨酸未測(cè)得外，其余7種必需氨基酸均含有，總含量占總氨基酸的28.17%。

表2　正交試驗(yàn)的結(jié)果與分析

2.4細(xì)菌生長試驗(yàn)結(jié)果金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)在3種測(cè)試培養(yǎng)基中的生長情況如圖6～8所示。

圖6　不同培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌的生長曲線Fig.6　The growth curve of Staphylococcus aureus by different medium

圖7　不同培養(yǎng)基中大腸桿菌的生長曲線Fig.7　The growth curve of Escherichia coli by different medium

圖8　不同培養(yǎng)基中枯草芽孢桿菌的生長曲線Fig.8　The growth curve of Bacillus subtilis by different medium

3種細(xì)菌在各測(cè)試培養(yǎng)基中的生長趨勢(shì)相似，在試驗(yàn)中沒有觀察到生長延滯期，細(xì)菌從接入培養(yǎng)基后即進(jìn)入指數(shù)生長期，隨后是生長穩(wěn)定期。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長最高點(diǎn)出現(xiàn)在培養(yǎng)24 h，而枯草芽孢桿菌的生長峰值出現(xiàn)在培養(yǎng)36 h左右。3種細(xì)菌均在含有市售細(xì)菌學(xué)蛋白胨的培養(yǎng)基中生長最佳，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌在含鰈魚骨蛋白胨培養(yǎng)基中的生長優(yōu)于含有市售胰蛋白胨的培養(yǎng)基，而枯草芽孢桿菌在市售胰蛋白胨培養(yǎng)基中的生長優(yōu)于含鰈魚骨蛋白胨培養(yǎng)基。3種細(xì)菌在含有市售細(xì)菌學(xué)蛋白胨或鰈魚骨蛋白胨的培養(yǎng)基中生長特征并沒有較大差異，這證明鰈魚骨蛋白胨能夠提供細(xì)菌生長所需要的氮源營養(yǎng)。

魚類加工產(chǎn)生的下腳料中，魚頭、魚骨等含有豐富的鈣質(zhì)，并且還黏連著不少魚肉，是較好的蛋白質(zhì)資源。Vecht-Lifishitz等報(bào)道了魚蛋白胨用于培養(yǎng)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，其生長速率優(yōu)于細(xì)菌蛋白胨(bactopeptone，Difco公司)[8]。Dufosse等將提取自鱈魚、鮭魚、雜魚的蛋白胨應(yīng)用于細(xì)菌、酵母菌、霉菌的培養(yǎng)，并與酪蛋白胨的培養(yǎng)效果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)魚蛋白胨的培養(yǎng)效果優(yōu)于酪蛋白胨[9]。Vieira等利用蛋白酶將水產(chǎn)加工副產(chǎn)物水解制備蛋白胨并用于大腸桿菌的培養(yǎng)，結(jié)果表明4種由魚蝦加工副產(chǎn)物制備得到的蛋白胨，其細(xì)菌生長速率和穩(wěn)定期OD550值均高于市售蛋白胨(Oxoid)[10]。Aspmo等的研究顯示，大西洋鱈魚內(nèi)臟經(jīng)過不同條件的蛋白酶水解后制備的蛋白胨可替換市售蛋白胨用于微生物的培養(yǎng)[11]。萬菡等利用蛋白酶水解草魚內(nèi)臟并用于微生物的培養(yǎng)，優(yōu)選出最適微生物培養(yǎng)基的草魚內(nèi)臟水解蛋白[12]。綜上所述，酶解魚類加工下腳料提取制備的蛋白胨產(chǎn)品，可作為細(xì)菌培養(yǎng)基中氮源營養(yǎng)的潛在來源。

3　結(jié)論

該試驗(yàn)結(jié)果表明，鰈魚魚骨中含有豐富的蛋白質(zhì)，最佳

提取條件加酶量3 000 U/g，酶解時(shí)間20 h，酶解溫度40 ℃，料液比1∶50 g/mL，此條件下鰈魚骨蛋白胨的最大提取率可達(dá)55.62%。鰈魚骨蛋白胨產(chǎn)品的氨基酸種類齊全，能夠滿足供試細(xì)菌的生長要求。利用低濃度的乙酸與胃蛋白酶結(jié)合的方法，酶解鰈魚魚骨提取蛋白胨，實(shí)現(xiàn)了下腳料的高值化利用，可變廢為寶，提高水產(chǎn)品的附加值，降低主導(dǎo)產(chǎn)品的生產(chǎn)成本，對(duì)水產(chǎn)品加工綜合利用和保護(hù)環(huán)境都有重要的意義。

[1] 龔鋼明，顧慧，蔡國寶.魚類加工下腳料的資源化與利用途徑[J].中國資源綜合利用，2003(7)：23-24.

[2] TOPPE J，ALBREKTSEN S，HOPE B，et al.Chemical composition，mineral content and amino acid and lipid profiles in bones from various fish species [J].Comparative biochemistry and physiology part B biochemistry and molecular biology，2007，146(3)：395-401.

[3] 李晨，姜洪銳.我國水產(chǎn)品加工業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)的路徑選擇：基于全球價(jià)值鏈的視角[J].海洋開發(fā)與管理，2012，29(9)：111-115.

[4] 苑艷輝，錢和，姚衛(wèi)榮.魚下腳料綜合利用之研究近況與發(fā)展趨勢(shì)[J].水產(chǎn)科學(xué)，2004，23(11)：40-42.

[5] 王龍，葉克難.水產(chǎn)蛋白資源酶解利用研究現(xiàn)狀與展望[J].食品科學(xué)，2006，27(12)：807-812.

[6] GREEN J H，PASKELL S L，GOLDMINTZ D.Fish peptones for microbial media developed from red hake and from a fishery by-product[J].Journal of food protection，1977，40：181-186.

[7] TARR H R A，DEAS C P.Bacteriological peptones from fish flesh [J].J Fisheries Res Board of Canada，1949，7(9)：552-560.

[8] VECHT-LIFISHITZ S E，ALMAS K A，ZOMER E.Microbial growth on peptones from fish indrustrial wastes [J].Letters in applied microbiology，1990，10：183-186.

[9] DUFOSSE L，BROISE D D L，GUERARD F.Evaluation of nitrogen substrates such as peptones from fish：A new method based on gompertz modeling of microbial growth [J].Current microbiology，2001，42：32-38.

[10] VIEIRA G H F，VIEIRA R H S F，MACRAE A，et al.Peptone preparation from fishing by-products [J].Journal of the science of food and agriculture，2005，85：1235-1237.

[11] ASPMO S I，HORN S J，EIJSINK V.Hydrolysates from Atlantic cod(GadusmorhuaL.)Viscera as components of microbial growth media [J].Process biochemistry,2005,40(12)：3714-3722.

[12] 萬菡，何麗萍，劉良忠，等.草魚內(nèi)臟水解蛋白功能性質(zhì)及對(duì)微生物的培養(yǎng)效果研究[J].武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，30(1)：9-14.

[13] 陳鈞輝，李俊，張?zhí)剑?生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].5版.北京：科學(xué)出版社，2008：60-61.

[14] 楊彬，阮長春，劉志，等.柱前衍生-反相高效液相色譜法測(cè)定柞蠶蛻中氨基酸[J].食品科學(xué)，2010，31(16)：213-216.

[15] KURBANOGLU E B，KURBANOGLU N I.A new process for the utilization as peptone of ram horn waste [J].Journal of bioscience and bioengineering，2002，94(3)：202-206.

Preparation of Peptone from Flatfish Bone Using Pepsin and Bacterial Culture Experiment

LUAN Jun-xiao, LIU Zhi-chang, TONG Chang-qing, JIN Qiao*et al

(Key and Open Laboratory of Aquatic Products Processing and Utilization of Liaoning Province, College of Food Science and Engineering, Dalian Ocean University, Dalian, Liaoning 116023)

[Objective] To optimize technique for extracting peptone from flatfish bone, and discuss its bacterial culture effect. [Method] Pepsin and acetic acid were used to extract peptone from flatfishLimandaaspera. With extraction yield as index, the optimal conditions were determined based on single factor experiment. The bacterial culture effect of peptone as nitrogen source was also studied. [Result] The optimal processing condition was: extraction time 20 hours, extraction temperature 40 ℃, solid to liquid ratio 1∶50 g/mL and 3 000 U/g pepsin, and the yield of peptone reached up to 55.62%. The amino acid composition of flatfish bone peptone was various and rich. Using three common and typical bacteriaStaphylococcusaureus,Escherichiacoli,Bacillussubtilis, the performances of flatfish bone peptone was compared to commercial peptone. Results showed that bacterial culture effect of flatfish bone peptone was similar to commercial peptone. [Conclusion] The study demonstrates that flatfish bone peptone could provide nitrogen nutrients needed for bacterial growth, and could be used as nitrogen source in the cultivation of the bacteria.

Flatfish bone; Peptone; Amino acid composition; Bacterial culture

大連海洋大學(xué)科研項(xiàng)目(017214)。

欒君笑(1992-)，男，遼寧大連人，碩士研究生，研究方向：海洋生物資源開發(fā)利用。*通訊作者，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事海洋生物資源利用研究。

2016-06-03

S 986

A

0517-6611(2016)22-084-04