CRISPR/Cas9在煙草遺傳育種中的應(yīng)用

張之礬，周紅江，馮厚平， 劉明競，侯 軍，芶劍渝

(1.貴州省煙草公司遵義市公司正安縣分公司，貴州正安 563400；2.貴州省煙草公司遵義市公司，貴州遵義 563000)

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CRISPR/Cas9在煙草遺傳育種中的應(yīng)用

張之礬1，周紅江1，馮厚平2， 劉明競1，侯 軍1，芶劍渝2

(1.貴州省煙草公司遵義市公司正安縣分公司，貴州正安 563400；2.貴州省煙草公司遵義市公司，貴州遵義 563000)

主要從CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基本原理、應(yīng)用及其存在的問題等方面進(jìn)行了綜述，并對該技術(shù)如何應(yīng)用于煙草遺傳育種以及分子改良研究進(jìn)行了展望。

CRISPR/Cas9；基因組；定點(diǎn)編輯；煙草

隨著分子生物學(xué)的進(jìn)步及大量生物基因組測序工作的完成，人類對生物特定基因的DNA序列進(jìn)行定點(diǎn)編輯得以實(shí)現(xiàn)。從最初應(yīng)用于酵母細(xì)胞DNA改造的同源重組技術(shù)，基因編輯經(jīng)歷了鋅指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFNs)和TALE核酸酶(Transcription activator like effector nucleases, TALENs)2個重要的發(fā)展時期，直到CRISPR/Cas9技術(shù)被大量報道，基因編輯技術(shù)迎來了新的發(fā)展契機(jī)。CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9是一種新型的基因組定點(diǎn)編輯工具，該技術(shù)已發(fā)展成為繼鋅指核酸酶(Zinc Finger Nucleases，ZFNs)及TALE核酸酶(Transcription Activator-like Effector Nucleases，TALENs)后對基因定點(diǎn)高效編輯的首選技術(shù)。

CRISPR/Cas系統(tǒng)最早被發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌中，屬于細(xì)菌在進(jìn)化過程中演化出的一種天然免疫方式。研究者已成功利用Type II型CRISPR/Cas9對多種生物的基因組進(jìn)行了定點(diǎn)編輯。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種高效、快速、簡單的基因組定點(diǎn)編輯新技術(shù)，該技術(shù)利用細(xì)菌人工核酸酶在DNA靶位點(diǎn)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，從而實(shí)現(xiàn)對基因組的定點(diǎn)編輯。CRISPR/Cas9技術(shù)目前已在多種模式生物(干細(xì)胞、斑馬魚、爪哇蟾、酵母、大腸桿菌、水稻及煙草等)中被成功應(yīng)用，相信未來該技術(shù)會成為每個生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室必備的基因定點(diǎn)編輯工具。對于農(nóng)業(yè)研究，該技術(shù)應(yīng)用于動植物新品種的培育會極大地提高創(chuàng)制動植物優(yōu)異新種質(zhì)的效率[1]。煙草育種是綜合運(yùn)用植物遺傳學(xué)、育種學(xué)以及其他相關(guān)學(xué)科的理論和技術(shù),對不同煙草栽培類型的遺傳組成進(jìn)行有效改良和創(chuàng)新,培育和創(chuàng)造煙草優(yōu)良新品種,不斷滿足煙草生產(chǎn)發(fā)展的需求[2]。煙草是我國最重要的經(jīng)濟(jì)作物，現(xiàn)行品種的抗病、產(chǎn)量、烘烤品質(zhì)等性狀均存在諸多問題。因此，培育新型煙草品種及創(chuàng)制煙草種質(zhì)資源對國民經(jīng)濟(jì)增長具有重要意義[3]。筆者CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基本原理應(yīng)用及存在的問題進(jìn)行了綜述，并對該技術(shù)如何應(yīng)用于煙草遺傳育種以及分子改良研究進(jìn)行了展望。

1　CRISPR/Cas9系統(tǒng)基本原理

1.1CRISPR/Cas9 作用原理CRISPR/Cas9來自細(xì)菌TypeⅡ型免疫系統(tǒng)，該蛋白為多結(jié)構(gòu)復(fù)合體，主要包含RuvC-like 結(jié)構(gòu)域及位于中間的HNH結(jié)構(gòu)域，HNH與sgRNA(single-strand guide RNA)結(jié)合形成Cas9-sgRNA復(fù)合體[4-5]。復(fù)合體中的sgRNA與靶向DNA特異性配對，配對完成后Cas9會對靶向DNA原型間隔序列毗鄰基序(Protospacer adjacent motif, PAM)上游3 nt處的堿基進(jìn)行剪切。Cas9蛋白中RuvC與HNH結(jié)構(gòu)域都具有核酸內(nèi)切酶活性，HNH識別PAM序列后對與sgRNA互補(bǔ)配對的DNA單鏈進(jìn)行切割并產(chǎn)生缺口(nick)，RuvC則剪切另一條單鏈[6]。Sternberg等[7]研究發(fā)現(xiàn)，Cas9攜帶sgRNA的復(fù)合體會在全基因組上快速地搜尋PAM序列，PAM序列作為觸發(fā)器催化Cas9行使剪切功能，即便sgRNA是與非目標(biāo)區(qū)段完全配對，若無PAM的存在Cas9蛋白直接忽略配對。如果基因組PAM序列呈現(xiàn)高密度串聯(lián)重復(fù)，Cas9蛋白可能會錯誤識別靶位點(diǎn)。由于Cas9剪切DNA雙鏈產(chǎn)生缺口(nick)，造成基因組堿基序列缺失、替換、插入等多種損傷，真核生物會通過非同源性末端重組(Non-homologous End Joining，NHEJ)修復(fù)機(jī)制，將缺口兩端的DNA序列直接相連，補(bǔ)平缺口。該修復(fù)機(jī)制完成后，靶向DNA的序列會發(fā)生改變，即通過sgRNA引導(dǎo)Cas9蛋白實(shí)現(xiàn)對基因組序列的定點(diǎn)編輯(圖1)?；撔枣溓蚓鶶treptococcuspyogenesCas9蛋白是目前使用最多的CRISPR核酸酶，Jinek等[8]利用單粒子顯微鏡重塑技術(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SpCas9晶體中的核酸酶部分(RuvC與HNH結(jié)構(gòu)域)在剪切DNA雙鏈時，與螺旋蜷曲結(jié)構(gòu)域之間產(chǎn)生一定的縫隙，該縫隙使Cas9蛋白能夠適應(yīng)不同sgRNA的引導(dǎo)。其他類型的Cas蛋白同樣具有較高的應(yīng)用價值，Luo等[9]用大腸桿菌TypeI-E型CRISPR/Cas系統(tǒng)抑制基因表達(dá)，通過刪除cas3基因，該免疫系統(tǒng)轉(zhuǎn)變?yōu)榭删幊痰幕蛘{(diào)節(jié)器。該系統(tǒng)靶向啟動子與編碼序列都會導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制，由此可見，CRISPR家族不同類型的蛋白具有許多特殊的研究用途。

圖1　Cas9蛋白剪切基因組序列機(jī)制Fig.1　The mechanism of Cas9 protein splices the genome sequence

2　CRISPR/Cas9的特點(diǎn)、問題及應(yīng)用

2.1CRISPR/Cas9特點(diǎn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建相對簡單，以常規(guī)轉(zhuǎn)基因過表達(dá)質(zhì)粒為骨架，克隆插入Cas9編碼基因，Cas9蛋白能夠在多種模式生物中穩(wěn)定表達(dá)，通常不會產(chǎn)生氨基酸突變。同時，設(shè)計擴(kuò)增sgRNA表達(dá)盒序列，sgRNA前導(dǎo)序列為編碼核內(nèi)小RNA的U3、U6a-c等基因的啟動子，sgRNA的查找只需要針對靶基因內(nèi)PAM序列前19～20堿基進(jìn)行選擇，將兩者連接后導(dǎo)入到受體細(xì)胞，sgRNA表達(dá)后即可引導(dǎo)Cas9蛋白剪切靶基因(圖2)。不同于RNA干涉，Cas9打靶成功后目標(biāo)基因的信使RNA及氨基酸序列會被同時改變，但RNA干涉有時不能夠?qū)⒛繕?biāo)基因完全沉默，轉(zhuǎn)基因表型不明顯。

鋅指核酸酶(Zinc Finger Nucleases，ZFNs)由鋅指蛋白(Zinc Finger Protein，ZFP)和FokI核酸內(nèi)切酶人工融合而成ZFN識別結(jié)合并剪切特定的 DNA 序列。ZFN 中的 ZFP 結(jié)構(gòu)域通常由 3～6 個C2H2類型的鋅指重復(fù)單位串聯(lián)而成。其中，每個鋅指模塊可直接特異識別 DNA 雙螺旋中某一條單鏈上 3 個連續(xù)的核苷酸(稱為一個三聯(lián)子，Triplet)，由多個鋅指串聯(lián)形成的 ZFP 結(jié)構(gòu)可識別更長的靶序列, 同時也增加了DNA靶向修飾的特異性[10]。植物致病菌黃單胞桿菌屬(Xanthomonas)中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄激活類似效應(yīng)物(Transcription Activator Like Effector, TALE)能夠識別特定的DNA序列。根據(jù)該特性，可將TALEN單元重復(fù)串聯(lián)起來(14～20個重復(fù)單元)與FokI核酸內(nèi)切酶融合形成TALE核酸酶，TALEN可識別剪切特定的DNA序列[11]。但ZFN與TALEN的共同特點(diǎn)是模塊化組裝非常繁瑣，耗時長，資金投入大，且受技術(shù)專利的限制，一般的小型實(shí)驗(yàn)室無法獨(dú)立開展模塊的構(gòu)建。但Cas9組裝過程即為簡單的載體構(gòu)建，構(gòu)建好的質(zhì)?？芍苯佑糜谵D(zhuǎn)化受體細(xì)胞。因此，相對于其他技術(shù)，Cas9高效、省時及成本低的特點(diǎn)尤為突出。

圖2　Cas9表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建過程Fig.2　Schematic diagram of Cas9 expression vector construction

2.2CRISPR/Cas9的主要問題ZFN 與TALEN 由于是模塊化組裝，每個模塊僅識別特定的堿基序列，重復(fù)串聯(lián)的模塊提高了其打靶的準(zhǔn)確性，但CRISPR/Cas9 技術(shù)最大的缺點(diǎn)即為容易脫靶。基因組序列非常龐大，sgRNA只與PAM序列前20個堿基進(jìn)行配對，在基因組中出現(xiàn)錯誤配對的概率就會很高，Cas9蛋白有時不能正確剪切與sgRNA配對的目標(biāo)DNA序列，而是錯誤地將一些相似序列進(jìn)行剪切。 Xie等[12]利用Cas9技術(shù)對水稻基因MAPK5進(jìn)行打靶，結(jié)果估算打靶效率在3%～8%；同時分析了水稻全基因組中約有3.89 × 107個PAM基序，只有2.09 × 107個能夠作為有效的sgRNA序列，其中，6.4 × 106個序列具有錯配性。為有效解決脫靶問題，Ran等[13]利用雙Cas9系統(tǒng)對小鼠卵細(xì)胞的Mecp2基因進(jìn)行打靶，設(shè)計常規(guī)的sgRNA基于基因組正鏈，同時在互補(bǔ)鏈上間隔的50 bp內(nèi)再次設(shè)計新的sgRNA，該系統(tǒng)對單基因的不同位點(diǎn)進(jìn)行雙打靶，有效提高了Cas9的打靶效率。

2.3CRISPR/Cas9的應(yīng)用Jinek等[14]構(gòu)建了含有Protospacer2的質(zhì)粒，設(shè)計配對的tracrRNA:crRNA作為外源sgRNA引導(dǎo)Cas9蛋白用2個不同的結(jié)構(gòu)域剪切雙鏈DNA，并證明Cas9剪切的識別位點(diǎn)即PAM序列存在2個保守的堿基GG，該研究首次人工模擬CRISPR免疫系統(tǒng)剪切DNA，為Cas9蛋白的后續(xù)成功運(yùn)用奠定基礎(chǔ)。Mali等[15]利用Cas9敲除人體細(xì)胞內(nèi)源基因AAVS1，在293T細(xì)胞中Cas9打靶效率為10%～25%，但在多能干細(xì)胞中相對較低為2%～4%。同時Cong等[16]將Cas9密碼子人源優(yōu)化，能夠精確剪切人體及小鼠細(xì)胞內(nèi)的EMX1，并認(rèn)為Cas9可作為缺口酶應(yīng)用于哺乳動物DNA同源重組修復(fù)，還可構(gòu)建CRISPR芯片同時進(jìn)行多重位點(diǎn)打靶。成功剪切哺乳動物的基因組序列表明，Cas9蛋白具有高效的通用性，該技術(shù)有望廣泛應(yīng)用于合成生物學(xué)、直接和多通路干擾基因網(wǎng)絡(luò)、體內(nèi)外靶向性基因治療等。Hwang等[17]利用Cas9系統(tǒng)與前期ZFN及TALEN敲除斑馬魚胚胎細(xì)胞基因tia11和gsk3b相比，Cas9將突變率從2%提高到6%～36%，但Cas9易產(chǎn)生瞬時的非嵌合敲除體，該研究結(jié)果顯示，除哺乳動物外，脊椎動物也可運(yùn)用Cas9系統(tǒng)。隨后在多種模式生物中，Cas9系統(tǒng)成功敲除了不同物種的多個基因。Ren等[18]創(chuàng)建了果蠅Cas9敲除系統(tǒng)：Drosophila germline specific Cas9(CGSC)system ，該系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)sgRNA與基因組序列，如果存在3個堿基內(nèi)的錯配不會增加脫靶效應(yīng)，通過優(yōu)化sgRNA內(nèi)的堿基以及改變GC含量，新的果蠅敲除系統(tǒng)大大提高打靶效率，且產(chǎn)生的突變數(shù)遠(yuǎn)高于未優(yōu)化系統(tǒng)。

植物由于特殊的組織結(jié)構(gòu)，難以離體培養(yǎng)的特性，導(dǎo)致許多生物技術(shù)的應(yīng)用受到限制，但經(jīng)過密碼子優(yōu)化的Cas9同樣能夠在植物中發(fā)揮作用。Li等[19]利用該系統(tǒng)成功敲除模式植物擬南芥及本生煙中的AtPDS3、AtFLS2、NbPDS3基因。多倍體植物由于染色體組的加倍導(dǎo)致許多性狀發(fā)生了明顯變化，二倍體的研究策略此時并不適用于多倍體植物。Wang等[20]利用Cas9技術(shù)將大麥抵御白粉病的3個同源等位基因MLO同時敲除，結(jié)果表明，Cas9系統(tǒng)不僅具有同時打靶的能力，而且適用于多倍體植物研究。Cas9 系統(tǒng)的高效利用為植物育種、遺傳改良、基礎(chǔ)研究帶來了巨大的改變，該技術(shù)使科學(xué)家更易于在基因組水平改良植物性狀。

CRISPR/Cas9基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)能夠?yàn)檠芯恐参锏纳L、發(fā)育和衰老提供新的方式。Cas9剪切基因組DNA依賴RuvC和HNH，這2個結(jié)構(gòu)域的同時作用使DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂，若具有單個結(jié)構(gòu)域的Cas9蛋白剪切DNA產(chǎn)生單鏈缺口，此時如果繼續(xù)導(dǎo)入一段外源DNA，有可能植物會利用同源重組酶將外源DNA整合插入到單鏈缺口處，若該方法成功將產(chǎn)生一種新的植物轉(zhuǎn)基因模式。另外，Cas9蛋白受sgRNA引導(dǎo)，到達(dá)目標(biāo)DNA處進(jìn)行剪切，如果將Cas9蛋白進(jìn)行改造，使其僅受sgRNA引導(dǎo)而不剪切DNA，則改造后的Cas9蛋白可應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄激活研究。轉(zhuǎn)錄因子與Cas9蛋白相融合，在sgRNA的引導(dǎo)下Cas9蛋白攜帶轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入到特定區(qū)域，激活下游基因表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子與Cas9蛋白的結(jié)合能夠?yàn)榈鞍踪|(zhì)-DNA互作鑒定提供新的方法，還可對染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation assay，Chip)數(shù)據(jù)進(jìn)行核內(nèi)有效驗(yàn)證。Cheng等[21]建立CRISPR-on系統(tǒng)，將Cas9蛋白與轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合，sgRNA特異靶向啟動子區(qū)，結(jié)果表明，該系統(tǒng)能夠激活小鼠卵細(xì)胞內(nèi)源基因IL1RN、SOX2及OCT4的表達(dá)。再者，可利用Cas9蛋白同時敲除對多個基因進(jìn)行敲除。研究蛋白質(zhì)相互作用時，很難獲得互作蛋白的雙突變體，若將針對單個基因產(chǎn)生雙缺口的sgRNA替換成同時引導(dǎo)2個基因打靶的sgRNA，在理論上完全能夠獲得雙突變體以及多突變體。

3　CRISPR/Cas9應(yīng)用于煙草遺傳育種的展望

3.1CRISPR/Cas9 技術(shù)應(yīng)用于煙草DH群體構(gòu)建Cas9能夠?qū)⒖刂谱魑锊涣夹誀畹幕蜻M(jìn)行有效敲除，敲除后的作物雖攜帶有Cas9基因，但通過回交及分子檢測的方法可逐步除去子代體內(nèi)的Cas9基因(圖3)，利用Cas9將煙草中的負(fù)調(diào)控基因進(jìn)行定點(diǎn)誘變即可產(chǎn)生新的轉(zhuǎn)基因煙草株系。F1代與優(yōu)良性狀的煙草輪回親本雜交后的F2代，分子檢測若不含Cas9基因，可利用花藥及組織培養(yǎng)技術(shù)快速獲得純合株系，并能夠有效節(jié)約育種時間。

植物育種中純合株系的獲得需要經(jīng)過很多年，單倍體加倍可有效解決該問題，煙草花藥培養(yǎng)法已成為作物中應(yīng)用最成熟的生物技術(shù), 從 DH 群體選育而來的煙草品種有 F211、NC744、TanYuh1、Yuh2、Yuh3 及 LMAFC34等[22]。正常煙草植株誘導(dǎo)出的愈傷組織經(jīng)過Cas9技術(shù)修飾后會出現(xiàn)大量的嵌合體，即DNA的一條單鏈被剪切，而另一條鏈處于正常狀態(tài)，轉(zhuǎn)基因后代會出現(xiàn)分離現(xiàn)象。若使用煙草花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)出的單倍體愈傷組織經(jīng)Cas9修飾去除負(fù)向調(diào)控基因，隨后再加倍形成的DH群體即為純合株系。該群體可直接應(yīng)用于培育新品種、構(gòu)建遺傳圖譜、基因定位等多項(xiàng)工作。

圖3　Cas9應(yīng)用于煙草育種Fig.3　Schematic diagram of Cas9 application in tobacco breeding research

3.2CRISPR/Cas9 技術(shù)應(yīng)用于煙草抗病育種煙草是研究植物與病原菌相互作用的模式植物，生產(chǎn)中主要使用化學(xué)藥劑防治煙草黑脛病、赤星病、花葉病等病害，但培育煙草抗病新品種才是最經(jīng)濟(jì)安全的策略。煙草基因組中包含400多個NBS-LRR類抗病基因，該家族基因在植物抗病反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[23]。其中，抗煙草花葉病單基因N屬于典型的TIR-NBS-LRR抗病基因[24]，該基因具有2種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物NS與NL，2種產(chǎn)物在抗病時間上具有不同的功能。若使用Cas9技術(shù)對N基因的外顯子序列進(jìn)行修飾，那么N基因只會轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一個可變剪切，具有單一轉(zhuǎn)錄剪切本的基因NL具有更持久的抗病性。但目前針對黑脛病與青枯病的抗性基因發(fā)掘相對緩慢，多數(shù)為已報道的QTL位點(diǎn)，隨著煙草基因組測序的完成及功能基因組的開展，將加快對抗性QTL的精細(xì)定位[25]。陳帥等[26]利用EMS誘變獲得了eIF4E的抗馬鈴薯Y病毒的突變體，若用Cas9創(chuàng)制一批eIF4E敲除的突變體材料能夠?yàn)榭柜R鈴薯Y病毒病提供許多中間型抗病株系。

3.3CRISPR/Cas9 技術(shù)應(yīng)用于煙草不育系選育育種中雜種優(yōu)勢的利用是培育新品種的重要手段，雜交種在生物產(chǎn)量、抗性方面都具有超親優(yōu)勢。但煙草中不育系的品種非常稀少，這限制了煙草雜交選育的進(jìn)度，生產(chǎn)上應(yīng)用較多的為 MS白肋21×Ky10 的后代[27]。煙草為葉用作物，其雜交種可為不育，只需雄性不育系和保持系即可。若將Cas9蛋白融合煙草線粒體蛋白定位信號，那么Cas9蛋白作用于線粒體蛋白敲除線粒體編碼基因Nad7則可獲得與林煙草細(xì)胞質(zhì)雄性不育CMSI功能相同的材料[28]，而敲除材料的遺傳背景多樣化，再與親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的父本雜交，F(xiàn)1的超親優(yōu)勢會更加顯著。針對細(xì)胞核雄性不育系材料的創(chuàng)制則更為簡單，但目前對控制煙草育性的核基因很少，NtCOI1的RNAi干涉植株表現(xiàn)為育性降低，該基因可作為一個潛在的細(xì)胞核不育基因使用[29]。

3.4CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于煙草突變體庫構(gòu)建煙草突變體庫的建立對煙草功能基因組研究具有重要意義。物理、化學(xué)、生物等多種方法已被應(yīng)用于創(chuàng)制煙草突變體材料，如化學(xué)誘變劑EMS與Tiling(Targeting induced local lesions in genomes)技術(shù)的結(jié)合，但該技術(shù)后續(xù)大規(guī)模測序花費(fèi)巨大[30]。隨著生物技術(shù)T-DNA插入的運(yùn)用，不同類型的材料易于獲得，但后期鑒定過程非常復(fù)雜。根據(jù)煙草基因組信息比對，首先合成Cas9-single guide RNA文庫，隨后構(gòu)建Cas9-sgRNA的質(zhì)粒文庫，利用土壤農(nóng)桿菌攜帶Cas9文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)入煙草愈傷細(xì)胞，可產(chǎn)生具有不同表型以及基因型的突變體，后續(xù)可用Tiling平臺及高通量測序篩選Cas9突變體。雖然構(gòu)建的sgRNA文庫不能覆蓋基因組全部的編碼基因，但通過人為定向選擇可快速獲得目標(biāo)突變體(圖4)。宗鵬等[31]利用定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù)(Targeting Induced Local Lesions In Genomes,TILLING)從經(jīng)EMS誘變的煙草突變體庫中篩選出13株NtPhyB突變體材料，NtPhyB 編碼光敏色素受體蛋白調(diào)控植株相應(yīng)光周期及光形態(tài)建成。若Cas9的突變體庫中篩選出單一基因的突變體材料，只需設(shè)計特異性引物對靶點(diǎn)DNA序列擴(kuò)增，通過測序的方法鑒定可節(jié)約大量時間。

圖4　Cas9煙草突變體庫構(gòu)建Fig.4　Construct the tobacco mutants library depend on Cas9 system

3.5CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于煙草特殊性狀改良煙草為葉用植物，又可作為良好的生物反應(yīng)器，煙草具有許多異于其他作物的特殊性狀，如煙草葉色是反映其生長發(fā)育、生理狀態(tài)的參考標(biāo)志。白肋煙是重要的混合型卷煙原料，相對于正常植株白肋煙屬于葉色突變體，其葉綠素含量為正常綠色型的1/3，由2對連鎖的隱性核基因控制[32]。若利用Cas9技術(shù)將正常高產(chǎn)煙草品種中控制葉綠素合成的基因進(jìn)行敲除，便可獲得與白肋煙具有相類似表型的突變體。目前，煙草原料的生產(chǎn)需符合降焦減害的指導(dǎo)思想。煙草中的尼古丁、煙堿、焦油等有害物質(zhì)的合成途徑已逐漸清晰，如果利用Cas9對煙草中調(diào)控焦油合成關(guān)鍵酶的基因進(jìn)行突變，焦油含量下降?？刹恍枰诠に嚮蛟耘噙^程中完成降焦工作。

煙草育種中尚有許多亟待解決的問題，許多調(diào)控?zé)煵葜匾誀畹幕蛏形幢豢寺?，這極大地限制了CRISPR/Cas9 技術(shù)在煙草育種研究中的應(yīng)用。伴隨著煙草基因組測序的完成以及功能基因研究的開展，將加快煙草重要基因在煙草分子育種中的應(yīng)用，也期待傳統(tǒng)的煙草育種與新的生物技術(shù)CRISPR/Cas9 的結(jié)晶成果。

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Application of CRISPR/Cas9 in Tobacco Genetic Breeding

ZHANG Zhi-fan1, ZHOU Hong-jiang1, FENG Hou-ping2et al

(1.Zhengan Branch of Zunyi Company, Guizhou Tobacco Company, Zhengan, Guizhou 563400;2.Zunyi Tobacco company of Guizhou Province,Zunyi Guizhou,563000)

We reviewed the fundamental principle, application and existing problems of CRISPR/Cas9. And the application of CRISPR/Cas9 in tobacco genetic breeding and molecular modified research were forecasted.

CRISPR/Cas9; Genome; Target editing; Tobacco

貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司資助項(xiàng)目(2013-3)。

張之礬(1988- )，男，山東聊城人，助理農(nóng)藝師，碩士，從事煙草生產(chǎn)技術(shù)推廣工作。

2016-05-31

S 503.2

A

0517-6611(2016)22-118-04