彭亞瓊，陳光輝，李懿星，李 莉*

(1.衡陽市農(nóng)業(yè)科學研究所，湖南衡陽 421101； 2.湖南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，湖南長沙 410128；3.湖南省雜交水稻研究中心，湖南長沙 410125)

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CRISPR/Cas9系統(tǒng)的研究進展及其在水稻上的應用

彭亞瓊1，陳光輝2，李懿星3，李 莉3*

(1.衡陽市農(nóng)業(yè)科學研究所，湖南衡陽 421101； 2.湖南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，湖南長沙 410128；3.湖南省雜交水稻研究中心，湖南長沙 410125)

綜述了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、定點突變原理、載體構(gòu)建類型及介導突變的可遺傳性，著重分析了影響突變效率的因素，介紹該系統(tǒng)目前在水稻上的研究，并展望其應用前景。

CRISPR/Cas9；基因組編輯；基因打靶；水稻

在自然選擇的壓力下，水稻個體優(yōu)勝劣汰，適應環(huán)境且性狀優(yōu)良的野生水稻品種相對較少，難以滿足人們對水稻多樣性的需求。對水稻誘變材料進行精細定位，獲得控制優(yōu)良性狀的突變基因，為實際運用奠定理論基礎；同時將性狀優(yōu)良的突變材料大量繁殖，以作為優(yōu)良親本推廣運用。然而誘變突變的產(chǎn)生是隨機性的、無方向性的，突變概率較低，且難以集中多個理想性狀。因此，育種家常為獲得一個理想單株/個體需經(jīng)過多次突變、多次選擇，存在浪費人力和物力的風險，如突變體的表型可能由環(huán)境引起，其優(yōu)良性狀無法遺傳等。隨著近年來各國的交流和探索，嘗試利用定點編輯基因序列反向研究基因的功能。鋅指核酸酶(zinc finger nucleases，ZFn)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)和規(guī)律性重復短回文序列簇(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPRs)等可靠、高效且準確的基因組編輯技術(shù)相繼出現(xiàn)，縮短了獲得突變體的時間，加快了基因功能研究的步伐。

目前，ZFn技術(shù)的運用具有明顯的局限性，對編輯的目的序列有嚴格要求，識別的結(jié)構(gòu)域存在很強的上下文依賴效應，難以實現(xiàn)對任意序列設計出滿足要求的打靶位點。即使設計出打靶位點，若無高特異性、高親和性的鋅指蛋白與其結(jié)合，也易出現(xiàn)脫靶現(xiàn)象[1]。篩選合適的鋅指蛋白也需要龐大的鋅指蛋白表達文庫做支撐。因此，ZFn技術(shù)存在操作繁瑣、工作量大、花費高昂等一系列問題。ZFn的脫靶切割對細胞有一定毒性，導致ZFn技術(shù)無法滿足人們準確且快速編輯基因的要求，因此，選擇合適的調(diào)控方式來降低脫靶切割是ZFn技術(shù)亟待解決的一個難題。與ZFn技術(shù)相比，TALENs技術(shù)靶點設計要求低，打靶位點選擇較多，但TALENs技術(shù)也存在弊端，如載體構(gòu)建繁瑣，難度大，重組率低，周期長，成本高，且一旦脫靶，易對受體細胞產(chǎn)生毒性，這 限制了7ALENS技術(shù)進一步運用。

相較于人工核酸酶技術(shù)ZFn和TALEN，CRISPR/Cas9系統(tǒng)是天然存在的原核生物RNA干擾系統(tǒng)，對物種及序列無選擇性，對打靶位點序列要求低，打靶效率較高，操作簡單，周期短，成本低。通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得突變體，多為單個堿基插入類型的突變體或幾個堿基缺失類型的突變體，也存在小概率的6～100 bp的片段缺失突變體。CRISPR/Cas9系統(tǒng)能較快、準確地產(chǎn)生理想突變體，大大加快基因功能研究的進程。2013年，CRISPR/Cas9系統(tǒng)被Science雜志評為排名第一的十大突破技術(shù)[2]，現(xiàn)已成為近年來基因編輯的首選手段。筆者綜述了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、定點突變原理、載體構(gòu)建類型及介導突變的可遺傳性，分析了影響突變效率的因素，并展望了其應用前景。

1　CRISPR/Cas9系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)由切割域和結(jié)合域2部分組成。切割域位于結(jié)合域上游，主要原件為Cas基因，編碼的蛋白具核酸相關(guān)功能，與Folk酶功能相似，即通過識別特異性位點切斷入侵DNA，從而降解外來基因序列。Cas基因也參與CRISPR的轉(zhuǎn)錄、加工等過程。結(jié)合域主要包括位于上游的前導序列和位于下游的CRISPR位點。前導序列一般有300～500 bp，富含AT結(jié)構(gòu)，可作為啟動子，啟動CRISPR序列的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生非編碼RNA(crRNA)。CRISPR位點主要由重復序列和間隔序列組成，以重復序列開始，以重復序列結(jié)束，且以2個重復序列之間穿插一個間隔序列的模式排列，因此，間隔序列的數(shù)量始終比重復序列少1個。不同物種擁有的重復序列個數(shù)不同，一般而言，重復序列的堿基個數(shù)為21～48個，具5～7 bp的回文序列，高度保守，間隔序列的堿基個數(shù)為2 672個。在已測序的細菌中，有40%的細菌其基因組存在CRISPR位點，進一步觀察發(fā)現(xiàn)，CRISPR位點存在于細胞染色體上，極少部分存在于質(zhì)粒中[3]。

2　CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點突變的原理

1987年，研究者對大腸桿菌12K的iap基因進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在iap基因側(cè)翼以成群的短回文重復序列存在，經(jīng)試驗證明，這些簡單重復序列與很多病毒或質(zhì)粒的DNA序列互補，2年，推斷細菌中的CRISPR/Cas9系統(tǒng)是抵抗病毒入侵的一種免疫機制[4]。

CRISPR系統(tǒng)有I、II及III 3種類型，其中，I型和III型需要crRNA和多種Cas蛋白共同發(fā)揮作用才能順利剪切外源DNA，而II型僅需要crRNA、tracrRNA和Cas9相互協(xié)作即可降解外源DNA，總體上，II型相對于I型和III型要求較低。截至目前，II型研究最透徹，運用最廣泛[5]。

圖1　II型CRISPR/Cas9結(jié)構(gòu)示意Fig.1　Type II CRISPR/Cas9 structure diagram

根據(jù)細菌免疫抵抗外界病毒侵染的原理，構(gòu)建了具CRISPR/Cas9系統(tǒng)的空載體。當需要定點編輯基因組序列時，將設計的目的片段連入空載體，形成最終打靶載體后，通過轉(zhuǎn)化整合到受體基因組上發(fā)揮編輯作用。為簡化實際操作，即用幾個堿基將crRNA與tracrRNA連接起來，形成具發(fā)卡結(jié)構(gòu)的回文序列，稱之為SgRNA。改良的SgRNA-Cas9系統(tǒng)更容易完成基因靶向修飾。將連有目的片段的SgRNA-Cas9載體轉(zhuǎn)入并整合到小鼠[7]、斑馬魚[8]、果蠅[9]、擬南芥[10]、煙草[11]、水稻[12]等物種的基因組上，利用轉(zhuǎn)錄的crRNA和tracrRNA進行互補配對形成雙鏈，再與Cas蛋白組成復合體，通過復合體識別并剪切基因組，導致雙鏈斷裂。在雙鏈修復過程中將產(chǎn)生突變，有如下2種突變類型：一是無同源片段存在，雙鏈末端自身連接。與正?；蛐蛄邢啾龋粌H缺少被剪切的基因序列，且連接處也易發(fā)生堿基突變，導致編碼的蛋白發(fā)生變化，最終可能引起基因功能發(fā)生變化；二是同源片段存在，堿基互補配對修復。若人為干擾加入同源片段，斷裂處能根據(jù)同源片段序列通過堿基配對來修復，最終達到插入基因的目的。

通常CRISPR/Cas9系統(tǒng)只切割PAM(即NGG)前的3 bp，在無同源片段進行修復的情況下，產(chǎn)生突變的位置在切口附近[11]。研究表明，靠近5′端且處于目標序列一半的位置，發(fā)生單堿基突變的頻率較高[13-14]。

3　CRISPR/Cas9系統(tǒng)的構(gòu)建類型

相比TALENs載體構(gòu)建，CRISPR/Cas9載體的構(gòu)建方法簡單較易，只需將設計的靶位點序列進行退火，再連入載體即可。根據(jù)最終打靶載體的不同，載體構(gòu)建有細微的差別。

常見的最終打靶載體有3種類型：第一種是2個最終打靶載體，一個含有目的基因序列，行使識別功能，一個含有Cas9，行使切割功能。此類型需要2個載體均發(fā)揮其應有的功能才能打靶成功。構(gòu)建時，需將目的靶位點序列進行退火，再連入識別目的基因的載體，含Cas9的載體無需改變；第二種是一個最終打靶載體，載體既包含識別目的基因序列的原件，又包括行使切割功能的Cas9原件。且識別目的基因的原件由一個啟動子啟動，可連接一個目的打靶位點序列。打靶時類似于單酶切，能導致某一處DNA雙鏈發(fā)生斷裂。第三種也是一個最終打靶載體，與第二種類似，但識別目的基因序列的原件包含2個啟動子，每個啟動子都可以連接一個目的打靶位點序列。打靶時類似于雙酶切，能造成2處DNA雙鏈的斷裂，在DNA修復過程中，2切口之間的小片段可能被自身降解，最終造成一段序列的缺失，突變幾率大大提高。若采用第三種打靶載體來編輯基因，其目的基因的序列應為5′-CCN-N20-N(若干個)-N20-NGG-3′，其中N為任意堿基，若士個n處于-2 ～30，其打靶效率較高[15]。

各CRISPR/Cas9打靶載體不同，其打靶效率也不同。第一種需2個載體共同作用才能產(chǎn)生突變，而第二、三種僅一個載體發(fā)揮作用即可，因此，理論上第一種效率較低，在植物方面的應用已逐漸被淘汰。第二種常產(chǎn)生1 bp突變，可能導致編碼的蛋白不變，相應的功能也未發(fā)生變化。而與第二種相比，第三種更易產(chǎn)生大片段的缺失，導致移碼突變，獲得突變體，且表型突變的可能性較大。但第三種對打靶序列要求相對較高，因此，應用具有局限性。

4　影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)突變效率的因素

4.1CRISPR/Cas9空載體的影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)在發(fā)展與進步，空載體在運用過程中得到改良，不同人改造的原件不同，改造的序列不同，改造前與改造后，載體進入植物體內(nèi)，能整合到基因組上并發(fā)揮作用的效率不同，最終對植物基因的打靶效率也不同[16]。且改造后的不同載體對目的序列的設計要求也不同，如水稻打靶載體的啟動子有U3、U6、T7及CaMV35[17]。打靶載體若是以U6作為啟動子，要想獲得較高的打靶效率，則打靶目的片段5′端的第一個堿基必須為G[18-19]，即5′-GN19NGG-3′。若以T7作為啟動子，則打靶目的片段5′端的前2個堿基必須為(G/A)(G/A)，即5′-(G/A)(G/A)N18NGG-3′[19]。

4.2打靶位點的影響

目前各院校推行的“現(xiàn)代學徒制”不僅限于訂單式培養(yǎng)，工學結(jié)合頂崗實習等模式內(nèi)容，但基本都在強調(diào)“在做中學”“在學中做”。“學徒”部分時間在實際生產(chǎn)服務一線崗位上，以“師傅帶徒弟”的方式接受訓練，部分時間學習必要的文化和專業(yè)理論知識，以期迅速成長為職業(yè)資格證書、職業(yè)教育學歷證書雙手握的高技能應用型人才，并在一定程度上解決企業(yè)招工難，成長難等問題。為企業(yè)穩(wěn)定了職工隊伍，創(chuàng)造了利潤，同時培養(yǎng)年輕人對職業(yè)與企業(yè)的認同與歸屬感。

4.2.1相似。CRISPR/Cas9系統(tǒng)識別序列僅由20 bp組成，而在龐大的基因組序列中，存在較多與20 bp相似的序列。在CRISPR/Cas9系統(tǒng)識別目的基因序列過程中，可能發(fā)生錯配現(xiàn)象，導致復合體與目標位置外的基因序列結(jié)合。與遠離PAM端發(fā)生錯配的情況相比，臨近PAM端的堿基發(fā)生錯配時對Cas9蛋白的切割能力影響較大，易發(fā)生脫靶現(xiàn)象[20]。因此，為降低脫靶率，設計的目的靶位點最好是唯一的，若找不到唯一，設計的目的序列應盡量避免植物基因組中存在與近PAM端同源的序列。

4.2.2長度。 目標打靶序列的長短對目標切割效應和低脫靶效應有影響。研究表明，縮短目標序列的長度能提高靶位點的識別準確度，從而減弱脫靶效應，但在一定程度上降低了對目的基因的切割能力[21]。因此，找到目標切割效應和低脫靶效應的平衡點，設置最佳目標序列長度，才能產(chǎn)生最佳的打靶突變效果。目前廣泛應用的是將PAM(即NGG)前20個堿基做為目標序列。在這20 bp中，位于PAM上游的12個堿基對打靶突變起決定性作用[20]。

4.2.3位置。 大小為20 bp的目標序列，其位置不同，能被切割產(chǎn)生突變的概率也不同。如目的打靶位點設在非編碼區(qū)，即使發(fā)生突變，也不能引起植物編碼蛋白質(zhì)的變化，自然植物的功能未發(fā)生改變，使試驗無研究意義，只有目的打靶位點設在CDS區(qū)域，才能產(chǎn)生有意義的表型突變；如打靶位點處于第一個外顯子，較第二個外顯子更能引起蛋白的變化，產(chǎn)生較理想的突變[22]；如靶位點靠近C′端，打靶效率低，即使靶位點有個別堿基發(fā)生變化，但處于編碼蛋白將要結(jié)束的位置，較難打亂蛋白正常表達，最終不能引起表型及功能的變化[22]。

4.2.4序列。 有些序列易被CRISPR/Cas9系統(tǒng)打靶成功，而有些卻很難被切割產(chǎn)生雙鏈斷裂。如打靶序列的重復序列高、GC含量太高或太低，其打靶效率均偏低[23]，為得到理想的打靶效率，目標序列的GC含量應控制在20%～80%[24]。

目的打靶序列常設為5′-N20NGG-3′(N為任意堿基)。在組成NGG前的20 bp中，四類堿基排列順序不同，其打靶效率相差較大。研究發(fā)現(xiàn)，最影響打靶效率的是5′端第16、20位的堿基，第16位為A或C堿基，能大大提高打靶效率，特別是C堿基，若為G堿基則打靶效率大大降低；第20位若為A或G堿基，能大大提高打靶效率，特別是C堿基，若為G堿基則打靶效率大大降低；PAM(即NGG)中的N適合選擇G或C堿基，不宜選T堿基，且處于NGG下游，緊鄰NGG的第一個堿基對打靶效果影響大，若為堿基G，易造成脫靶，因此，打靶最佳組合為CGG加T堿基，最不適宜組合為TGG加G堿基[22]。

4.3載體濃度在菌液轉(zhuǎn)化受體材料的過程中，菌液體積一定，菌液所含打靶載體濃度大，最終導入植物中的打靶載體多，可成功打靶的概率高；相反，菌液所含打靶載體濃度小，成功打靶的概率較低。但打靶載體的濃度太高，也易起反作用，導致打靶位點在目標序列之外，常出現(xiàn)目標序列附近被Cas9切開。至目前為止，暫時尚未有明確的打靶載體適宜濃度[25]。

4.4愈傷時期愈傷組織將經(jīng)歷一個從對數(shù)生長到穩(wěn)定再到衰亡的過程。對處于衰亡期的愈傷組織進行打靶，其能吸收營養(yǎng)并加以利用的能力差，分裂速度慢，經(jīng)篩選、分化后，大部分走向死亡，可獲得的幼苗少，自然獲得陽性植株數(shù)量少，打靶成功的幾率更小。相反，對處于對數(shù)增長期的愈傷組織進行打靶，恢復活力快，長成幼苗的較多，獲得陽性植株數(shù)量較多，打靶成功的幾率相對較高。而對處于穩(wěn)定期愈傷組織的打靶成功率介于衰亡期和對數(shù)期之間。

5　CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導突變的可遺傳性

CRISPR/Cas9系統(tǒng)在動物上的應用非常廣泛，常以動物胚胎干細胞作為受體細胞，以致在當代獲得突變純合子相對較高。然而植物不同于動物，經(jīng)CRISPR/Cas9系統(tǒng)打靶產(chǎn)生的突變自然不同[10]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的突變常發(fā)生在T0代植株的體細胞中，因此，T0代植株中存在突變純合子的概率較低，主要出現(xiàn)的是野生型植株、突變雜合子植株、嵌合體植株(即在一植株的打靶位點處，PCR檢測發(fā)現(xiàn)有3條或3條以上不同的序列，含野生型序列)及雙等位基因植株4種類型，但在突變率較高的情況下，在T0代有可能出現(xiàn)純合子突變[10，26-27]。

T1代植株除T0代的4種類型外，還存在突變純合子植株。T0代純合子遺傳穩(wěn)定，即使突變植株較野生型植株僅發(fā)生1 bp的變化，CRISPR/Cas9系統(tǒng)中具核酸內(nèi)切酶作用的Cas9也不能在突變植株已發(fā)生突變的位置再次切割其基因雙鏈序列，因此，在正常栽培條件下不會發(fā)生突變；T1代雜合子突變體的后代其分離比基本遵循孟德爾遺傳定律1∶2∶1，但也存在發(fā)生新突變植株的情況，如以嵌合體形式出現(xiàn)的突變植株，嵌合體植株再將已產(chǎn)生的1個、2個或者0個突變傳遞到后代；T0代野生型傳至T1代時，因被自身攜帶的CRISPR/Cas9系統(tǒng)切割其雙鏈DNA，最終能產(chǎn)生T0代沒有的新突變，但傳至T2代，大部分植株不再產(chǎn)生新突變，即CRISPR/Cas9系統(tǒng)很難對其已產(chǎn)生突變的植株再次產(chǎn)生突變[10，26-27]。

6　CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻中的應用

CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有精度性高、系統(tǒng)構(gòu)建簡便和多靶位點切割等優(yōu)勢，常用于小鼠[7]、斑馬魚[8]、果蠅[9]等模式動物。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的日趨成熟，該系統(tǒng)在植物方面的應用也相繼出現(xiàn)，為提高模式植物研究的效率，逐漸將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應用到水稻的理論研究和育種研究。

Miao等[28]在CAO1基因的第二個外顯子里設計打靶位點，將CRISPR/Cas9系統(tǒng)轉(zhuǎn)入水稻，產(chǎn)生的突變體因缺少葉綠素b的合成，表現(xiàn)為早期葉片呈淡綠色。Feng等[29]轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體突變YSA基因，發(fā)現(xiàn)10%的轉(zhuǎn)基因植株在苗期表現(xiàn)葉片白化。在水稻相關(guān)的報道中，經(jīng)打靶產(chǎn)生的植株突變率不高，Xie 等[30]推測CRISPR-Cas系統(tǒng)能對植物產(chǎn)生突變的概率在3%～8%。Shan等[31]用CRISPR/Cas9系統(tǒng)轉(zhuǎn)化水稻愈傷，發(fā)現(xiàn)OsPDS-SP1和OsBADH2基因的突變率分別為9.4%和7.1%，轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)小麥基因TaMLO和3個水稻基因OsBADH2、Os02g23823、OsMPK2的突變率在26.5%～38%。Shan等[31]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點突變水稻OsPDS基因，產(chǎn)生的突變效率在10%以下，但在當代獲得了純合突變體，與野生型相比，純合突變體表現(xiàn)出植株變矮和葉片轉(zhuǎn)為白化的特點，與預期的表型一致。Zhang等[26]用CRISPR/Cas9系統(tǒng)突變不同功能的10個水稻基因，分別是OsMYB1、OsYSA、OsROC5、OsDERF1、OsPDS、OsMSH1、OsMYB5、OsSPP、OsPMS3和OsEPSPS，獲得的突變率分別為66.7%、66.7%、65.1%、50.9%、41.9%、37%、31.9%、28.9%、26.3%、21.1%和44.4%，平均突變率達44.4%，其中，OsEPSPS基因是合成芳香族氨基酸過程中的一個關(guān)鍵酶，OsEPSPS的突變體因不能合成芳香族氨基酸，無法正常生長發(fā)育，最終死亡。Zhou等[27]用CRISPR/Cas9系統(tǒng)打靶了水稻中4個控制糖運輸?shù)幕?，在T0代獲得的突變率最高達87%，且突變植株大多為雙等位基因類型。Feng等[10]研究發(fā)現(xiàn)，因CRISPR/Cas9系統(tǒng)的剪切，產(chǎn)生的突變率在T0代有71.2%，T2代有58.3%，T2代有79.4%。T1代中，突變純合子的純合率為22%，雜合子和嵌合體的突變率為58.3%。其中，將T1代所有突變植株的基因型與T0代突變植株基因型相比，與T0代相一致的突變植株僅占T1代總突變的50%[10]。

研究發(fā)現(xiàn)，CRSPR/Cas9系統(tǒng)能夠?qū)λ净蚪M進行編輯，且編輯的序列無選擇性，大大提高了研究基因功能的效率，使快速、準確編輯基因序列獲得優(yōu)良性狀的植株成為可能。然而CRSPR/Cas9系統(tǒng)在水稻中打靶效率較低，因此，通過改良載體體系、轉(zhuǎn)化體系等提高打靶效率成為亟待解決的一個重要的問題，有待進一步摸索。

7　展望

隨著不同物種基因組測序的完成，探明基因組的功能顯得尤為重要?；蚪M定點編輯技術(shù)是進行基因組定向改造與基因功能研究的一個新興而重要的研究手段。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠靶向性地編輯基因組，系統(tǒng)構(gòu)建簡便、精度高、周期短、成本低。相較于ZFn和TALENs人工核酸酶技術(shù)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)更具優(yōu)勢，能夠更加高效地獲得遺傳穩(wěn)定的突變體，為基因功能研究提供技術(shù)和材料保障。同時，可利用CRISPR/Cas9技術(shù)在基因組水平上插入或敲除基因，篩選獲得更多環(huán)境適應性強、性狀更加優(yōu)良的育種材料。然而CRISPR/Cas9系統(tǒng)目前尚處于運用和探索階段，存在目標序列PAM鄰近基序缺失、靶向序列切割特異性、不同物種打靶效率差異等問題，成為未來需要解決的一些關(guān)鍵問題。但其在高效便捷的基因操作中已表現(xiàn)出巨大優(yōu)勢，在水稻功能基因組研究中表現(xiàn)出巨大潛力，在創(chuàng)制優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的水稻品種中表現(xiàn)出廣闊的應用前景，必將產(chǎn)生深遠影響。

[1] MAEDER M L，THIBODEAU-BEGANNY S，OSIAK A，et al.Rapid“open-source engineering of customized zinc-finger nucleases for highly efficient gene modification[J].Molecular cell，2008，31(2)：294-301.

[2] Breakthrough of the Year 2013[EB/OL].[2016-04-07].http：//news.sciencemag.

[3] WEI C X，LIU J Y，YU Z S，et al.TALEN or Cas-rapid，efficient and specific choices for genome modifications[J].Genet genomics，2013，40(6)：281-289.

[4] ISHINO Y，SHINAQAWA H，MAKINO K，et al.Nucleotide sequence of the iap gene，responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion inEscherichiacoli，and identification of the gene product[J].Bacteriol，1987，169(12)：5429-5433.

[5] CHYLINSKI K，LE RHUN A，CHARPENTIER E.The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems[J].RNA Biology，2013，10(5)：726-737.

[6] 左其生，李東，張亞妮，等.CRISPR-Cas介導的基因編輯工具[J].生物技術(shù)通報，2014(7)：37-43.

[7] WANG H Y，YANG H，SHIVALLIA C S，et al.One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering[J].Cell，2013，153(4)：910-918.

[8] AUER T O，DEL BENE F.CRISPR/Cas9 and TALEN-mediated knock-in approaches in zebrafish[J].Methods，2014，69(2)：142-150.

[9] GRATZ S J，WILDONGER J，HARRISON M M，et al.CRISPR/Cas9-mediated genome engineering and the promise of designer flies on demand[J].Fly，2013，7(4)：249-255.

[10] FENG Z Y，MAO Y F，XU N F，et al.Multigeneration analysis reveals the inheritance，specificity，and patterns of CRISPR/Cas-induced gene modifications inArabidopsis[J].PNAS，2014，34(25)：632-637.

[11] JIANG W Z，ZHOU H B，BI H H，et al.Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification inArabidopsis，tobacco，sorghum and rice[J].Nucleic acids research，2013，41(20)：188.

[12] CHEN K L，SHAN Q W，GAO C X.An efficient TALEN mutagenesis system in rice[J].Methods，2014，69(1)：2-8.

[13] WU X，SCOTT D A，KRIZ A J，et al.Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells[J].Nature biotechnol，2014，32(7)：670-676.

[14] HSU P D，SCOTT D A，WEINSTEIN J A，et al.DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases[J].Nature Biotechnol，2013，31(9)：827-832.

[15] RAN F A，HSU P D，LIN C Y，et al.Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity[J].Cell，2013，154(6)：1380-1389.

[16] WANG T，WEI J J，SABATINI D M，et al.Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system[J].Science，2014，343(6166)：80-84.

[17] BORTESI L，F(xiàn)ISCHER R.The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond[J].Biotechnology advances，2015，33(1)：41-45.

[18] XIE S S，SHEN B，ZHANG C B，et al.sgRNAcas9：A software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites[J].PLoS ONE，2014，9(6)：100448.

[19] 劉思也，夏海濱.一種新的由CRISPR/Cas系統(tǒng)介導的基因組靶向修飾技術(shù)[J].中國生物工程雜志，2013，33(10)：117-123.

[20] MARRAFFINI L A，SONTHEIMER E J.CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA[J].Science，2008，322(5909)：1843-1845.

[21] 顏雯，李海濤，向華，等.CRISPR-Cas基因組改造技術(shù)研究進展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2014(2)：149-152.

[22] DOENCH J G，HARTENIAN E，GRAHAM D B，et al.Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR/Cas9-mediated gene inactivation[J].Nature Biotechnol，2014，32(12)：1262-1267.

[23] GAGNON J A，VALEN E，THYME S B，et al.Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs[J].PLoS ONE，2014，9(5)：98186.

[24] WANG T，WEI J J，SABATINI D M，et al.Genetic screens in human cells using the CRISPR/Cas9 system[J].Science，2014，343(3)：80-84.

[25] PATTANAYAK V，LIN S，GUILINGER J P，et al.High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity[J].Nat Biotechnol，2013，31：839-843.

[26] ZHANG H，ZHANG J，WEI P，et al.The CRISPR/Cas9 system produces specific and homozygous targeted gene editing in rice in one generation[J].Plant biotechnology journal，2014，12(6)：797-807.

[27] ZHOU H，LIU B，WEEKS D P，et al.Large chromosomal deletions and heritable small genetic changes induced by CRISPR/Cas9 in rice[J].Nucleic acids research，2014，42(17)：10903.

[28] MIAO J，GUO D S，ZHANG J Z，et al.Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cas system[J].Cell research，2013，23(10)：1233-1236.

[29] FENG Z Y，ZHANG B T，DING W，et al.Efficient genome editing in plants using a CRISPR-Cas system[J].Cell research，2013，23(10)：1229-1232.

[30] XIE K B，YANG Y N.RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system[J].Molecular plant，2013，6(6)：1975-1983.

[31] SHAN Q W，WANG Y，LI J，et al.Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system[J].Nat Biotechnol，2013，31(8)：686-688.

Research Progress of CRISPR/Cas9 System and Its Application on Rice

PENG Ya-qiong1, CHEN Guang-hui2, LI Yi-xing3, LI Li3*

(1. Hengyang Agricultural Science Research Institute, Hengyang, Hunan 421101; 2 College of Agronomy, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128; 3. Hybrid Rice Research Center of Hunan Province, Changsha, Hunan 410125)

The structure of CRISPR/Cas9 system, the principle of fixed-point mutation, the type of building vectors and the heritability of mutation were reviewed. The factors that influence efficiency of mutations were emphatically analyzed, the current existing research on rice was introduced, and its application in the future was forecasted.

CRISPR/Cas9; Genome editing; Gene targeting; Rice

彭亞瓊(1990- )，女，湖南衡山人，碩士研究生，研究方向：轉(zhuǎn)基因水稻。*通訊作者，副研究員，博士，碩士生導師，從事水稻分子育種研究。

2016-06-06

S 188

A

0517-6611(2016)22-128-04