百蕊草愈傷組織培養(yǎng)影響因素研究

劉向陽(yáng)，黃燕芬，王自布，曹永高，羅查梅

(貴州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550018)

Note：Basic culture medium is MS.

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百蕊草愈傷組織培養(yǎng)影響因素研究

劉向陽(yáng)，黃燕芬*，王自布，曹永高，羅查梅

(貴州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550018)

[目的]對(duì)影響百蕊草愈傷組織培養(yǎng)的因素進(jìn)行研究。[方法]以百蕊草幼嫩枝條和葉片為外植體，研究不同濃度6-BA、NAA、2，4-D或其組合，碳源以及pH等因素對(duì)百蕊草愈傷組織生長(zhǎng)的影響。[結(jié)果]3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和碳源對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)都有促進(jìn)作用，對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)生長(zhǎng)的培養(yǎng)基最佳組合為MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.15 mg/L+2，4-D 0.1 mg/L，碳源中蔗糖顯著促進(jìn)了百蕊草愈傷組織的增長(zhǎng)，以30 g/L的蔗糖為最佳；pH 5.8～6.0有利于愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)。[結(jié)論]該研究為后續(xù)研究百蕊草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的建立提供材料。

百蕊草；愈傷組織；碳源；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

百蕊草(ThesiumchinenseTurcz.)為檀香科植物，具有重要的藥用價(jià)值，被稱(chēng)為“植物抗生素”[1]。百蕊草素是其主要成分，已被制成針劑用于治療多種感染性炎癥，具有較好療效[2]。百蕊草是一種半寄生植物，野生資源較少。近年來(lái)，掠奪式的采集使百蕊草資源銳減，已成為頻危珍稀種屬。為滿(mǎn)足市場(chǎng)需求，人工栽培雖然可以減輕供求壓力，但由于百蕊草植株較小，產(chǎn)量較低，廣種薄收，百蕊草素的生產(chǎn)嚴(yán)重受限。植物組織培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)植物次生代謝產(chǎn)物，已成為生產(chǎn)某些高價(jià)值產(chǎn)品的重要途徑。碳源作為細(xì)胞的主要能源來(lái)源，是組織培養(yǎng)不可缺少的成分，不同的培養(yǎng)細(xì)胞適合生長(zhǎng)的碳源不同[3]，由于植物組織培養(yǎng)的條件下往往缺乏合成生長(zhǎng)素和分裂素的能力，外源激素成為培養(yǎng)基中不可缺少的關(guān)鍵物質(zhì)[4]；細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是實(shí)現(xiàn)植物細(xì)胞工業(yè)化生產(chǎn)的途徑，相比于固體培養(yǎng)，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)能使細(xì)胞增殖速度加快，可以大規(guī)模培養(yǎng)，并能提供大量均勻一致的細(xì)胞培養(yǎng)物[5]。筆者通過(guò)對(duì)百芯草愈傷組織培養(yǎng)的影響因素進(jìn)行探討，以期為后續(xù)探索百蕊草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的建立提供材料。1材料與方法1.1材料野生百蕊草植株取自貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)。外植體為粗細(xì)均勻、健壯、無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)損傷的新生枝條和葉片。1.2方法

1.2.1愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)。外植體經(jīng)自來(lái)水沖洗干凈后用0.1%的氯化汞溶液消毒5～8 min，再用無(wú)菌水沖洗3次，最后將枝條和葉片剪成約1.0 cm長(zhǎng)的小段，接種于表1培養(yǎng)基中。30 d后統(tǒng)計(jì)各項(xiàng)數(shù)據(jù)，篩選最佳初代培養(yǎng)基配方。

表1　單激素愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方

注：基本培養(yǎng)基為MS。

Note：Basic culture medium is MS.

1.2.2不同激素配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。挑選長(zhǎng)勢(shì)較一致的初代誘導(dǎo)愈傷組織，按表2設(shè)置不同激素水平的正交試驗(yàn)處理，每處理接種10瓶，每瓶接種相似愈傷組織3塊。連續(xù)培養(yǎng)30 d后,用吸水紙吸取愈傷組織表面水分，晾干后稱(chēng)其鮮重，分析愈傷組織生長(zhǎng)情況。

表2　愈傷組織培養(yǎng)正交試驗(yàn)培養(yǎng)基配方

1.2.3不同碳源對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。在上述最佳激素濃度組合培養(yǎng)基中分別附加0、10、20、30、40、50、60 g/L的蔗糖、葡萄糖。每濃度設(shè)置10瓶，每瓶接種相似愈傷組織3塊，連續(xù)培養(yǎng)30 d后，用吸水紙吸取愈傷組織表面水分，晾干后稱(chēng)其鮮重，分析愈傷組織生長(zhǎng)情況。

1.2.4不同pH對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。挑選長(zhǎng)勢(shì)較一致的初代誘導(dǎo)愈傷組織，以MS為基本培養(yǎng)基，pH設(shè)置為5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2，每處理接種10瓶，每瓶接種相似愈傷組織3塊。連續(xù)培養(yǎng)30 d后，用吸水紙吸取愈傷組織表面水分，晾干后稱(chēng)其鮮重，分析愈傷組織生長(zhǎng)情況。

1.2.5愈傷組織繼代培養(yǎng)基的選擇。將初代培養(yǎng)得到的愈傷組織切成約0.5 cm×0.5 cm的小塊，接種至正交試驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)較好的C2、C5、C6 3個(gè)培養(yǎng)基中繼代增殖培養(yǎng)，每處理接種10瓶，每瓶接種3塊愈傷組織。連續(xù)培養(yǎng)30 d后，用吸水紙吸取愈傷組織表面水分，晾干后稱(chēng)其鮮重，分析愈傷組織增殖、生長(zhǎng)情況。

1.3培養(yǎng)條件 培養(yǎng)室溫度(24±3)℃，光照時(shí)間10～12 h/d，光照強(qiáng)度1 500～1 800 lx。

2　結(jié)果與分析

2.1不同激素對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的影響外植體接種14 d后腋芽開(kāi)始萌動(dòng)，切口處開(kāi)始膨大形成愈傷組織。培養(yǎng)30 d時(shí)的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表3。由表3可知，隨著激素濃度的增加，愈傷組織不斷增長(zhǎng)，生長(zhǎng)量和增殖率都有一定的提高，當(dāng)6-BA、NAA、2，4-D濃度分別添加至1.00、0.15，0.10 mg/L時(shí)，愈傷組織的生長(zhǎng)量、增殖率達(dá)到最大，愈傷組織呈深綠色。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，愈傷組織的顏色漸變?yōu)闇\綠色。當(dāng)6-BA、NAA、2，4-D濃度分別為3.00、2.00、0.25 mg/L時(shí)，愈傷組織生長(zhǎng)緩慢，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生褐變，顏色漸變?yōu)辄S色，最終導(dǎo)致愈傷組織死亡。

2.2激素配比對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的影響由表5可知，C2、C5和C6誘導(dǎo)出愈傷組織的數(shù)量比其他處理理想。三者中C2處理相比C5和C6處理誘導(dǎo)愈傷組織的效果好，C6有少量苗出現(xiàn)。

表3　不同激素對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的影響

注：基本培養(yǎng)基為MS。

Note：Basic culture medium is MS.

表4　不同激素配比對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的影響

注：基本培養(yǎng)基為MS。

Note：Basic culture medium is MS.

表5　碳源對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的影響

注：基本培養(yǎng)基為MS。

Note：Basic culture medium is MS.

2.3不同碳源對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的影響由表5可知，隨著碳源濃度的增加，愈傷組織生長(zhǎng)量都有不同程度的增加，碳源濃度從0提高到30 g/L時(shí)，愈傷組織生長(zhǎng)量也增加，30 g/L時(shí)達(dá)到最大，愈傷組織呈深綠色，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，愈傷組織的顏色漸變?yōu)榻】档臏\綠色。當(dāng)碳源濃度從30 g/L增加到60 g/L時(shí)，愈傷組織的生長(zhǎng)量隨著碳源濃度的增加而逐漸下降，生長(zhǎng)緩慢，并隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生褐變，最終導(dǎo)致愈傷組織死亡。蔗糖為碳源時(shí)，愈傷組織的生長(zhǎng)量、增殖率比葡萄糖均有一定的提高。綜上所述，蔗糖和葡萄糖作為碳源都能影響愈傷組織的生長(zhǎng)，隨著碳源濃度的增加，愈傷組織都有不同程度的增長(zhǎng)，蔗糖作用顯著優(yōu)于葡萄糖，且蔗糖價(jià)格低廉，有利于降低培養(yǎng)成本。

2.4不同pH對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的影響pH為5.8～6.0時(shí)愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)較好，增長(zhǎng)較快，顏色為健康的淺綠色，其他pH下愈傷組織生長(zhǎng)緩慢，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生褐變，顏色漸變?yōu)辄S色，最終導(dǎo)致愈傷組織死亡。說(shuō)明pH過(guò)低或過(guò)高不適合愈傷組織培養(yǎng)，pH 5.8～6.0最為適宜。

表6　愈傷組織繼代培養(yǎng)基的選擇

注：基本培養(yǎng)基為MS。

Note：Basic culture medium is MS.

2.5愈傷組織繼代培養(yǎng)基的選擇由表6可知，不同處理愈傷組織的增長(zhǎng)和分化程度不同。C2處理愈傷組織的分化較好，生長(zhǎng)量和增殖率比其他2個(gè)處理高，且愈傷組織隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)基本未發(fā)生褐變，顏色為淺綠色，較健康；C5處理愈傷組織褐化程度比C2和C6處理嚴(yán)重，生長(zhǎng)量和增殖率比C6處理理想，C6處理未出現(xiàn)嚴(yán)重的褐化，但愈傷組織分化生長(zhǎng)不理想，且易分化出苗。綜合各項(xiàng)指標(biāo)，以C2處理MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.15 mg/L+2，4-D 0.1 mg/L最佳。

3　結(jié)論

該試驗(yàn)結(jié)果表明，3種激素和碳源對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用，對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)生長(zhǎng)的培養(yǎng)基最佳組合為MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.15 mg/L+2，4-D 0.1 mg/L。碳源中蔗糖顯著促進(jìn)百蕊草愈傷組織的增長(zhǎng)，以30 m/L的蔗糖為最佳；pH 5.8～6.0有利于愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)。

[1] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì)．中華本草[M]．上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999：595-597.

[2] 安徽省百蕊草研究協(xié)作小組.百蕊草治療急性炎癥疾患的臨床觀察[J].新醫(yī)藥學(xué)雜志，1972(2)：38-39.

[3] SMITH M A L，MADHAVI D L，F(xiàn)ANG Y，et al.Continuous cell cultureand product recovery from wildVacciniumpahalaegemplasm[J].Journal of plant physiology，1997，150(4)：462-466.

[4] 李代麗.白刺愈傷組織培養(yǎng)中外源激素對(duì)內(nèi)源激素影響的研究[D]．北京：北京林業(yè)大學(xué)，2007

[5] 張韌，秦玉明，陳文慶，等．懸浮培養(yǎng)技術(shù)在生物制藥中的應(yīng)用和展望[J]．中國(guó)獸藥雜志， 2011，45(3)：56-60.

[6] 顏敬昌.植物組織培養(yǎng)手冊(cè)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：63-67.

Study on the Influencing Factors of Callus Culture ofThesiumchineseTurcz.

LIU Xiang-yang, HUANG Yan-fen*, WANG Zi-buet al

(School of Chemistry and Life Sciences,Guizhou Education University, Guiyang,Guizhou 550018)

[Objective]The aim was tostudy factors influencing callus culture ofThesiumchinense.[Method] Taking tender branches and leaves ofT.chinenseas explants, effects of different concentrations of 6-BA, NAA, 2,4-Dand their combinations,carbon soueces as well as pH on callus were investigatedby using the orthogonal experiments.[Result] The results showed that fitting concentration of plant growth regulators and carbon sources could all promote the growth of callus,the best medium for induction of callus is MS+mediumsupplemented with 6-BA 1 mg/L+NAA 0.15 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L, in the carbon sources,sucrose markedly increased callus, the adding of 30 m/L sucrose was the best choice.The pH value was 5.8-6.0.[Conclusion] The study can provide materials for study onT.chinensecell suspension culture.

ThesiumchinenseTurcz.; Callus; carbon sources; Plant growth regulators

貴州省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(黔教辦高〔2014〕321號(hào))；貴州省教育廳自然科學(xué)研究招標(biāo)項(xiàng)目(黔教合KY字[2015]358)。

劉向陽(yáng)(1993- )，男，貴州羅甸人，本科生，專(zhuān)業(yè)：生物科學(xué)。*通訊作者，教授，從事植物組織培養(yǎng)技術(shù)研究。

2016-06-12

S 188

A

0517-6611(2016)22-132-03