高曉霞，徐榮，陳君，于晶，楊成民，劉賽，張永清，彭艷麗*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

不同種質(zhì)黃芩中黃酮類成分測(cè)定及分析△

高曉霞1，2，徐榮2，陳君2，于晶2，楊成民2，劉賽2，張永清1，彭艷麗1*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

目的：對(duì)不同種質(zhì)黃芩中3種黃酮類成分和總黃酮進(jìn)行測(cè)定和綜合評(píng)價(jià)，為遴選黃酮類成分含量高的黃芩種質(zhì)提供依據(jù)。方法：采用改進(jìn)的高效液相色譜法測(cè)定不同種質(zhì)黃芩根中黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的含量，采用UV-可見分光光度法測(cè)定總黃酮含量，應(yīng)用主成分分析和灰色模式識(shí)別法驗(yàn)證并綜合評(píng)價(jià)不同種質(zhì)黃芩的化學(xué)質(zhì)量。結(jié)果：黃芩苷、漢黃芩素及總黃酮含量在不同種質(zhì)間差異顯著，其中13號(hào)黃芩種質(zhì)黃芩苷和總黃酮含量最高，1號(hào)、7號(hào)黃芩種質(zhì)黃芩苷、黃芩素與總黃酮含量均較高。主成分分析和灰色模式識(shí)別法分析結(jié)果驗(yàn)證了本次試驗(yàn)中1號(hào)、7號(hào)、13號(hào)為優(yōu)良種質(zhì)，可以作為黃芩新品種選育對(duì)象。結(jié)論：采用改進(jìn)后的HPLC法可較好地測(cè)定黃芩3種黃酮類成分，不同種質(zhì)黃芩中黃酮類成分含量均存在顯著差異；應(yīng)用主成分分析和灰色模式識(shí)別法均遴選出了目標(biāo)種質(zhì)，該方法適用于不同種質(zhì)藥材質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)。

黃芩；黃酮類成分；主成分分析；灰色模式識(shí)別法

黃芩為唇形科多年生草本植物，以根入藥，為我國(guó)常用中藥，歷代本草均有收載，主產(chǎn)于華北、東北、西北等地區(qū)。現(xiàn)代藥理研究證明，黃芩中有效成分主要為黃酮類成分，其中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素在抗氧化、抗炎、抗變態(tài)、抗菌、抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等方面具有顯著作用[1-2]。近年來(lái)以黃芩苷為主要原料的針劑、片劑、口服液等中成藥相繼投產(chǎn)，在國(guó)際、國(guó)內(nèi)市場(chǎng)熱銷，隨著黃芩應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，其需求量逐年增加，呈供不應(yīng)求之勢(shì)，據(jù)全國(guó)中藥資源普查統(tǒng)計(jì)，山東每年提取廠用量為2.2萬(wàn)t鮮藥材。

目前人工栽培的黃芩多來(lái)自野生種源，種質(zhì)類型多樣，針對(duì)其需求選育不同目標(biāo)的黃芩優(yōu)良品種對(duì)穩(wěn)定和保證藥材質(zhì)量具有積極意義。研究證明，中藥發(fā)揮藥效作用是通過(guò)多成分作用多個(gè)靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)的，對(duì)中藥某一“有效指標(biāo)成分”的定量分析并不能完全表現(xiàn)出藥材的內(nèi)在品質(zhì)。本文采用反高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定了14份不同種質(zhì)黃芩藥材的多個(gè)黃酮類成分[3]，并應(yīng)用主成分分析和灰色模式識(shí)別法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，為黃芩藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)及新品種選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

14份黃芩來(lái)自于早期課題組從山東、河北、寧夏、大連、北京等地收集的黃芩種質(zhì)(表1)，經(jīng)去雜純化、擴(kuò)繁后開展種質(zhì)評(píng)價(jià)和比較。本研究的14份黃芩樣品2013年6月扦插繁殖于藥用植物研究所栽培試驗(yàn)地，每份種質(zhì)分別移栽種植于3個(gè)小區(qū)，2014年11月3日黃芩枯葉后分別采挖其地下根部，每份種質(zhì)取樣15株，3個(gè)重復(fù)。60 ℃烘干后粉碎，過(guò)40目篩，待測(cè)。

表1 不同種質(zhì)黃芩收集信息

1.2 儀器與試劑

儀器：waters 2690高效液相色譜儀，Waters 996紫外檢測(cè)器，UV-2550型紫外-可見分光光度計(jì)，電子分析天平FA2004，精確到0.1 mg，DHG-9143BS-III型的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，KQ-250DE型數(shù)控超聲機(jī)，HH-S8數(shù)顯恒溫水浴鍋，臺(tái)式高速離心機(jī)TG16MW。

試劑：乙醇為分析純，甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純，水為超純水，黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 采用PUROSPHER? RP-18 endcapped(250 mm×4.6 mm，5μm)色譜柱，以甲醇(A)-乙腈(B)-0.1%磷酸水(C)為流動(dòng)相[4-8]，梯度洗脫程序?yàn)椋?-10 min，A-B-C(38∶12∶50)；10～30 min，A-B-C(38∶12∶50→80∶10∶10)；30～35 min，A-B-C(80∶10∶10)；35～40 min，A-B-C(80∶10∶10-38∶12∶50)；每針進(jìn)樣分析完畢后用初始流動(dòng)相組成平衡5 min后再進(jìn)行下一針?lè)治?。流速?.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為277 nm；進(jìn)樣體積為10 μL，用waters2690工作站采集數(shù)據(jù)并分析。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對(duì)照品各4.68、2.98、3.09 mg先配制成一定濃度的對(duì)照品儲(chǔ)備液，再分別各自取適量到10 mL的容量瓶?jī)?nèi)配制成混合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液。

1.3.3 供試品溶液的配制 稱取0.100 0～0.110 0 g黃芩干燥藥材(含水量均在4%左右)過(guò)40目篩的粉末，加50 mL 50%乙醇溶液，精密稱定，60 ℃、100 Hz超聲30 min，放至室溫，用50%乙醇補(bǔ)足差重，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，作為供試品溶液[4，9-10]。

1.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“1.3.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，以4、8、10、12、16、20 μL的體積按照“1.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積A為縱坐標(biāo)Y，以進(jìn)樣量M(μg)為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的回歸方程見表 2。

表2 黃芩藥材中3個(gè)化學(xué)成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

1.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在2、4、6、10、12、14、18、20 h進(jìn)樣10 μL，測(cè)得黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積的RSD分別為3.3%、3.4%、3.3%。結(jié)果表明供試品溶液中上述3個(gè)成分在20h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.3.6 精密度試驗(yàn) 按照“1.3.3”項(xiàng)制備供試品溶液，以10 μL連續(xù)進(jìn)樣6次。測(cè)得上述3個(gè)成分的峰面積RSD分別為1.4%、1.5%、1.4%，結(jié)果表明該儀器的精密度良好。

1.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一黃芩樣品5份，按照“1.3.3”項(xiàng)制備供試品溶液，以10 μL進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示上述3個(gè)成分的峰面積RSD分別為1.4%、4.3%、2.3%，符合規(guī)定。

1.3.8 回收率試驗(yàn) 取已知含量(黃芩苷14.93%、黃芩素1.159%、漢黃芩素0.334 7%)的黃芩粉末樣品6份，按照“1.3.3”項(xiàng)制備供試品溶液，分別精密吸取樣品提取液1 mL、混標(biāo)溶液1 mL于5 mL容量瓶中并定容[11-12]，以10 μL進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，以上3個(gè)成分的平均回收率分別為98.2、%、102.3%、96.5%，RSD分別為1.65%、3.19%、3.41%。

1.3.9 總黃酮的測(cè)定 采用紫外—可見分光光度法測(cè)定[13-14]，取“1.3.3”項(xiàng)的供試品溶液適量，4800 r/s的轉(zhuǎn)速離心8分鐘，取100 μL上清液于10 mL的容量瓶(經(jīng)濃度梯度考察樣品吸收度A值均在0.2～0.7范圍內(nèi))，用50%乙醇溶液定容后測(cè)定吸收度，全波長(zhǎng)掃描結(jié)果顯示在280 nm處有最大吸收，故確定紫外吸收波長(zhǎng)為280nm。

精密稱取黃芩苷對(duì)照品3.34 mg于10 mL容量瓶中用甲醇配制成標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別吸取85、240、400、540、700、850 μL的對(duì)照品儲(chǔ)備液于25 mL的容量瓶中配制成不同濃度梯度的對(duì)照品溶液，經(jīng)線性回歸分析得到吸收度Y(A)和濃度X(C，mg·mL-1)的回歸方程Y=71.568X-0.003，r=1.000，經(jīng)方法學(xué)考察結(jié)果均符合規(guī)定，表明此方法準(zhǔn)確可靠。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品含量的測(cè)定

按照上述高效液相色譜法和紫外-可見分光光度法分別測(cè)定不同種質(zhì)黃芩黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和總黃酮的含量，方差分析結(jié)果見表3、4。

表3 不同種質(zhì)黃芩藥材黃酮類成分的含量比較(n=3)及評(píng)價(jià)

注：采用Duncan s multiple range test方法分析，同一列不同字母表示顯著性差異(P<0.05)。

表4 不同種質(zhì)黃芩黃酮類成分方差分析及變異系數(shù)

注：表中*表示差異達(dá)顯著性(P<0.05)；**表示差異達(dá)極顯著性(P<0.01)。

從方差分析可知，黃芩苷、漢黃芩素、總黃酮在不同種質(zhì)間差異顯著，在區(qū)組間差異不顯著，遺傳比較穩(wěn)定，受環(huán)境影響?。黄渲?3號(hào)的黃芩苷和總黃酮含量均為最高，1號(hào)、7號(hào)種質(zhì)的黃芩苷、黃芩素及總黃酮含量均較高；黃芩素種間差異不顯著，但在區(qū)組間的差異達(dá)極顯著，表明黃芩素遺傳穩(wěn)定性差，受環(huán)境因素影響較大，不適宜作為選種依據(jù)。

從變異系數(shù)[15-18]來(lái)看，黃芩苷和總黃酮在區(qū)組間的變異系數(shù)較小(分別為6.61%和5.08%)，進(jìn)一步說(shuō)明黃芩苷和總黃酮含量穩(wěn)定，受環(huán)境因素影響小。而黃芩素和漢黃芩素在種源間和區(qū)組間變異系數(shù)均較大，說(shuō)明二者種質(zhì)間差異大，且遺傳穩(wěn)定性較差。

2.2 主成分分析

試驗(yàn)中不同種質(zhì)黃芩的4個(gè)化學(xué)成分含量指標(biāo)的主成分分析的特征值如表5所示。特征值≥1的主成分有2個(gè)，累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)80.4%(一般大于70%為宜[19])。由于主成分是原始性狀的線性組合函數(shù)，根據(jù)計(jì)算樣本相關(guān)矩陣的特征向量(表5)可給出主成分的函數(shù)式為：

F1=0.57X1-0.12X2-0.55X3+0.60X4

F2=-0.23X1+0.97X2+0.03X3-0.01X4

由函數(shù)式看出，在第一主成分Z1中，總黃酮含量X4的系數(shù)最大，其次是黃芩苷X1的系數(shù)也較大，表明第一主成分主要是反映黃酮總含量的綜合指標(biāo)，第二主成分Z2中，黃芩素含量X2的系數(shù)最大，表明第二主成分是反映黃芩素含量的綜合指標(biāo)。

表5 黃芩主要化學(xué)成分含量主成分分析的特征值和特征向量

比較不同種質(zhì)黃芩的各化學(xué)成分含量的主成分得分，見圖1可知，3號(hào)、6號(hào)、13號(hào)種質(zhì)的Z1值較大，結(jié)合表3中的標(biāo)準(zhǔn)偏差可知，3號(hào)的總黃酮含量和6號(hào)的黃芩苷含量個(gè)體間取樣偏差較大，即最終判定13號(hào)的黃芩苷(或總黃酮)含量較高，適合作為黃芩提取物原料來(lái)源的黃芩種質(zhì)；11號(hào)的Z2值較大，但表3中其黃芩素的標(biāo)準(zhǔn)偏差較大；位于第一象限對(duì)角線左右的1號(hào)、7號(hào)種質(zhì)的Z1和Z2均為正值，且Z2/Z1值較接近于1，表明黃芩素與黃芩苷(或總黃酮)不僅含量高，且貢獻(xiàn)比例相當(dāng)，這與臨床用藥安全規(guī)范中黃芩素與黃芩苷含量比值規(guī)定有一定的聯(lián)系，故推測(cè)這2份黃芩種質(zhì)適合用于臨床中藥飲片或中成藥原料；位于第一象限的8號(hào)種質(zhì)Z2得分稍較高，屬于黃芩素含量高的種質(zhì)類型，但Z1得分較低，即藥典規(guī)定質(zhì)量指標(biāo)黃芩苷含量不高；其余種黃芩源主成分得分值特征性不強(qiáng)。

2.4 灰色模式識(shí)別法驗(yàn)證——綜合評(píng)價(jià)黃芩藥材質(zhì)量

2.4.1 選擇參考序列 上述一共有14份樣品，每份樣品有4項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)，則組成的評(píng)價(jià)單元序列為{Xij}(i=1，2…14；j=1，2，3，4)。其中最佳參考序列{Xsj}為14份樣品對(duì)應(yīng)指標(biāo)的最大值，最差參考序列{Xtj}為14份樣品對(duì)應(yīng)指標(biāo)的最小值[20]。

2.4.3 計(jì)算關(guān)聯(lián)系數(shù) 相對(duì)于最優(yōu)參考序列關(guān)聯(lián)系數(shù)如下：

其中，Δmin=min|Yij-Ysj|，Δmax=max|Yij-Ysj|，ρ為分辨系數(shù)，取值為0.5[21]。

相對(duì)于最差參考序列關(guān)聯(lián)系數(shù)如下：

其中，Δ′min=min|Yij-Ytj|，Δ′max=max|Yij-Ytj|，ρ為分辨系數(shù)，取值為0.5。

2.4.4 計(jì)算關(guān)聯(lián)度

圖1 不同種質(zhì)黃芩化學(xué)成分主成分分析的得分值坐標(biāo)分布圖

相對(duì)于最優(yōu)參考序列關(guān)聯(lián)度：

相對(duì)于最差參考序列關(guān)聯(lián)度：

2.4.5 計(jì)算相對(duì)關(guān)聯(lián)度Ri(s)越大，表明評(píng)價(jià)單元序列相對(duì)于最優(yōu)參考序列的關(guān)聯(lián)度越大，評(píng)價(jià)單元越佳；反之，Ri(t)越小，評(píng)價(jià)單元越好。故定義評(píng)價(jià)單元序列{Xij}同時(shí)相對(duì)于最優(yōu)參考序列{Xis}和最差參考序列{Xit}的相對(duì)關(guān)聯(lián)度為

對(duì)于不同種質(zhì)黃芩各黃酮類成分含量數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)度分析，結(jié)果見表3中Ri值，以Ri值進(jìn)行種質(zhì)優(yōu)良排序可知，7號(hào)、1號(hào)、5號(hào)、13號(hào)和8號(hào)依次排在前五位，若選擇Ri值在0.535以上為優(yōu)良種質(zhì)[20]，則從化學(xué)質(zhì)量角度認(rèn)為1號(hào)、5號(hào)、7號(hào)和13號(hào)為化學(xué)質(zhì)量?jī)?yōu)良的黃芩種質(zhì)。此結(jié)果與上述主成分分析結(jié)果高度一致，驗(yàn)證了分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，5號(hào)種質(zhì)化學(xué)質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)排名靠前，但其總黃酮含量個(gè)體間偏差較高(見表3)，前期性狀調(diào)查結(jié)果也表明其外觀形態(tài)性狀層次不齊、產(chǎn)量性狀一般，所以即使化學(xué)質(zhì)量稍好，也不具備優(yōu)良種質(zhì)的條件。因此1號(hào)、7號(hào)、13號(hào)種質(zhì)在化學(xué)質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)之后結(jié)合前期性狀調(diào)查結(jié)果，可作為黃芩新品種選育對(duì)象。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)在已報(bào)道方法的基礎(chǔ)上略加改進(jìn)的色譜條件能使所需測(cè)定的化學(xué)成分很好地分離。通過(guò)種質(zhì)間和區(qū)組間方差分析及變異系數(shù)比較，發(fā)現(xiàn)不同種質(zhì)黃芩藥材中黃芩苷、漢黃芩素及總黃酮含量差異顯著；而黃芩素在區(qū)組間差異達(dá)極顯著性，表明其受環(huán)境因素影響較大；黃芩苷和總黃酮在區(qū)組間和種源間的變異系數(shù)均小于黃芩素和漢黃芩素，表明黃芩苷與總黃酮的遺傳穩(wěn)定性較好，提示在黃芩品種選育時(shí)，可以獨(dú)立選擇遺傳穩(wěn)定性好的黃芩苷(《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定黃芩苷為限定指標(biāo))或總黃酮作為化學(xué)質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。

化學(xué)成分灰色模式識(shí)別法不宜獨(dú)立評(píng)價(jià)中藥材質(zhì)量好壞，只能在標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)分析之后對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。以品質(zhì)為主要目標(biāo)的育種工作中，既要考察有效化學(xué)成分的含量，也要把握種質(zhì)的性狀特征。本研究通過(guò)測(cè)定黃芩中黃酮類成分的含量，綜合評(píng)價(jià)了不同黃芩種質(zhì)的藥材質(zhì)量，對(duì)指導(dǎo)黃芩優(yōu)良品種選育具有借鑒和參考作用。

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DeterminationandAnalysisofFlavonoidsIngredientsofDifferentScutellariaeRadixGermplasms

GAO Xiaoxia1，2，XURong2，CHENJun2，YUJing2，YANGChengmin2，LIUSai2ZHANGYongqin1，PENGYanli1*

(1.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250355，China；2.InstituteofMedicinalPlants，ChineseAcademyofMedicalSciences，Beijing100193，China)

Objective：To provide a basis for selecting high content of flavonoids ingredients of Scutellariae Radix germplasms by determination and analysis on three flavonoids ingredients and the total flavonoids of different Scutellariae Radix germplasms.Methods：The content of baicalin，baicalein and wogonin were determined by HPLC.And the total content of flavonoids of different ScutellariaeRadixgermplasm was determined byultraviolet-visible spectrophotometry.Principal component analysis and grey pattern recognition method was applied to comprehensive evaluation of different Scutellariae Radix germplasms quality.Results：Variance analysis results showed that the content of baicalin，wogonin and the total flavonoids were extremely significantly different among different germplasms.The baicalin and total flavonoids in germplasm 13 was higher than other germplasms.Germplasm 1 and 7，of which baicalin，baicalein and total flavonoids were all high.The analysis results of grey pattern recognition method verified that the Scutellariae Radix of germplasm 1，7 and 13 are optimal germplasms，which can be as selection objects ofScutellariabaicalensisnew varieties.Conclusion：The improved HPLC method is fit for determination for flavonoids ingredients of scutellariae Radix.There are significant difference between different Scutellariae Radix germplasms.Principal component analysis and the grey pattern recognition method is suitable for quality evaluation of different Scutellariae Radix germplasms.

Scutellariae Radix；flavonoids ingredients；principal component analysis；grey pattern recognition method

2015-12-17)

中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)(201107011)；工信部中藥材扶持資金(2011-340)

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彭艷麗，教授，研究方向：生藥及中藥的質(zhì)量控制與品質(zhì)評(píng)價(jià)；E-mail：pyl567@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.3.020