劉星云，王慧玲，彭麗華，成金樂(lè)*

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源科學(xué)與工程研究中心，嶺南中藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006；2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局 中藥破壁飲片技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)研究室，廣東 中山 528437；3.中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司，廣東 中山 528437)

菊花破壁飲片的HPLC指紋圖譜研究△

劉星云1，2，3，王慧玲2，3，彭麗華2，3，成金樂(lè)1，2，3*

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源科學(xué)與工程研究中心，嶺南中藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006；2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局 中藥破壁飲片技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)研究室，廣東 中山 528437；3.中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司，廣東 中山 528437)

目的：建立菊花破壁飲片HPLC指紋圖譜，并分析破壁飲片成品與其中間品、原料的化學(xué)成分相關(guān)性，為菊花破壁飲片整體質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。方法：采用高效液相色譜法，十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-0.5%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)：348 nm，柱溫：35 ℃。結(jié)果：建立了菊花破壁飲片的HPLC指紋圖譜，得到了15個(gè)共有特征峰，11批樣品的相似度達(dá)0.98以上，方法學(xué)考察結(jié)果符合指紋圖譜技術(shù)要求。結(jié)論：所建立的方法穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好，可用于菊花破壁飲片質(zhì)量控制和綜合評(píng)價(jià)。

菊花；破壁飲片；指紋圖譜；HPLC

菊花來(lái)源于菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥頭狀花序，具有散風(fēng)清熱、平肝明目、清熱解毒的功能。該藥材按產(chǎn)地和加工方法不同，分為“滁菊”、“亳菊”、“貢菊”、“杭菊”等品種[1]。菊花破壁飲片是將符合《中華人民共和國(guó)藥典》要求的杭白菊粉碎至D90<45 μm的粉體，不添加成型劑制成的30～100目的干燥顆粒狀飲片，可直接沖泡服用。與傳統(tǒng)飲片相比，菊花破壁飲片具有全成分保留，成分利用率高，質(zhì)量均一，應(yīng)用方式簡(jiǎn)單、快捷和靈活等特點(diǎn)[2]。由于外觀性狀及顯微特征均被破壞，傳統(tǒng)飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)已不能滿足菊花破壁飲片質(zhì)量控制要求，而基于整體化學(xué)表征基礎(chǔ)上的中藥HPLC指紋圖譜能反映中藥組分全貌，能對(duì)破壁飲片的內(nèi)在質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[3]，所以課題組對(duì)菊花破壁飲片首次開(kāi)展HPLC指紋圖譜研究。為進(jìn)一步考察破壁飲片制備過(guò)程對(duì)菊花傳統(tǒng)飲片中化學(xué)成分的影響，本課題組還比較、分析了菊花破壁飲片(成品)-菊花破壁粉體(中間品)-菊花傳統(tǒng)飲片(原料)三者的相關(guān)性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫1200RRLC快速液相色譜儀(配有G1315C型號(hào)DAD檢測(cè)器、G4218A的ELSD檢測(cè)器、G1312B二元泵、G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器、G1322A脫氣機(jī)、G1316B柱溫箱，Agilent ChemStation色譜工作站)；明澈TM-D24UV純水系統(tǒng)，KQ-400KOE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；電熱恒溫水浴鍋DK-S24(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；萬(wàn)分之一電子天平AB204-S(METTLER TOLEOD)、十萬(wàn)分之一電子天平AUW220D(島津公司)。

1.2 試藥和試劑

菊花破壁飲片共10批(批號(hào)分別為S1：021311501；S2：0212092701；S3：20131002；S4：20130903；S5：20130902；S6：20130901；S7：20130802；S8：20130801；S9：20120902；S10：20120901；S11：20120701)；杭白菊3批(批號(hào)分別為Ⅰ：0212092701；Ⅱ：0213011501；Ⅲ：20131201)，均由中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供，經(jīng)中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司賈世清中藥師鑒定為ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥頭狀花序，憑證標(biāo)本保存于廣州中醫(yī)藥大學(xué)。將3批杭白菊(批號(hào)：0212092701，0213011501，20131201)分別按照法定炮制工藝制成相對(duì)應(yīng)批次的菊花傳統(tǒng)飲片、菊花破壁粉體和菊花破壁飲片(均由中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司制備)。

綠原酸對(duì)照品(批號(hào)：110753-201314)、異綠原酸A對(duì)照品(批號(hào)：111782-201204)，木犀草苷對(duì)照品(批號(hào)：111720-200905)，均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；色譜甲醇(瑞典Oceanpak公司)，色譜乙腈(安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑有限公司)，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱(250 mm×4.6mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.5%磷酸溶液(B)，梯度洗脫程序見(jiàn)表1；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：348 nm；流速：0.6 mL·min-1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2 供試品溶液的制備

取菊花破壁飲片約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定重量，超聲提取40 min(功率320 W，頻率4200 Hz)，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3對(duì)照品溶液的制備

精密稱取綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A對(duì)照品適量，加70%甲醇溶解配成質(zhì)量濃度分別為0.173、0.152、0.249 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn) 精密吸取空白溶劑(甲醇)10 μL注入液相色譜儀，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，在相應(yīng)保留時(shí)間處無(wú)色譜峰，表明甲醇對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取菊花破壁飲片(批號(hào)：20131002)樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄圖譜。經(jīng)計(jì)算，6次進(jìn)樣譜圖的相似度達(dá)0.999以上，共有峰相對(duì)峰面積的RSD<3.4%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次菊花破壁飲片(批號(hào)：20131002)樣品6份，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液6份，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄圖譜。6份樣品所得指紋圖譜的相似度均高于0.999；各主要色譜峰的峰面積RSD<2.0%，表明本方法的重復(fù)性符合指紋圖譜控制技術(shù)的要求。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取菊花破壁飲片(批號(hào)：20131002)樣品，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液。分別于0、3、6、9、12、16、24 h測(cè)定，計(jì)算24 h內(nèi)各主要色譜峰峰面積RSD及所得圖譜的相似度。結(jié)果7張譜圖的相似度達(dá)0.999以上，主要色譜峰峰面積RSD<3.0%，說(shuō)明該樣品在24 h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 指紋圖譜采集 取11批次菊花破壁飲片，分別按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取供試品溶液20 μL及對(duì)照品溶液5 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，以6號(hào)峰(異綠原酸A)為參照峰，計(jì)算各批菊花破壁飲片指紋圖譜中的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

表2 11批菊花破壁飲片共有指紋圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間(n=11)

表3 11批菊花破壁飲片共有指紋圖譜共有峰的相對(duì)峰面積(n=11)

2.5.2 共有模式的建立及相似度的測(cè)定 將11批菊花破壁飲片樣品的指紋圖譜導(dǎo)入 《中智藥業(yè)集團(tuán)中藥指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)軟件》(中智藥業(yè)集團(tuán)與中南大學(xué)合作開(kāi)發(fā))，結(jié)果見(jiàn)圖1，以中位數(shù)法生成菊花破壁飲片指紋圖譜共有模式，共標(biāo)定15個(gè)共有峰，并將共有模式的保留時(shí)間與對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)，指認(rèn)出1號(hào)峰為綠原酸，3號(hào)峰為木犀草苷，6號(hào)峰為異綠原酸A，結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3。6號(hào)峰高度適中，分離度好，保留時(shí)間適中，可作為參照峰。以共有模式為對(duì)照?qǐng)D譜，測(cè)得樣品與對(duì)照指紋圖譜之間的相似度，結(jié)果見(jiàn)表4。由表可知相似度均在0.984以上，說(shuō)明各批次間菊花破壁飲片質(zhì)量均一、穩(wěn)定。

圖1 11批菊花破壁飲片指紋圖譜圖

圖2 菊花破壁飲片指紋圖譜共有模式

圖3 菊花破壁飲片混合對(duì)照品溶液(a)和共有模式(b)的HPLC對(duì)比圖

表4 11批菊花破壁飲片指紋圖譜的相似度

3 菊花破壁飲片(成品)-破壁粉體(中間體)-傳統(tǒng)飲片(原料)的相關(guān)性分析

本研究收集3批菊花傳統(tǒng)飲片及其對(duì)應(yīng)批次的破壁粉體和破壁飲片，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄圖譜中樣品的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，菊花傳統(tǒng)飲片、破壁粉體和破壁飲片的指紋圖譜見(jiàn)圖4。分別分析各批次的原料-中間品-成品之間的相似度，結(jié)果見(jiàn)表5。分析可知，同批次樣品的原料、破壁粉體及破壁飲片之間相似度在0.990以上，表明菊花傳統(tǒng)飲片經(jīng)超微粉碎再制成破壁飲片的工藝流程中有效成分基本沒(méi)有改變，各主要成分相關(guān)性良好。

注：Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅰ3依次表示批號(hào)為20131201的傳統(tǒng)飲片、破壁粉體、破壁飲片；Ⅱ1、Ⅱ2、Ⅱ3依次表示批號(hào)為0213011501的傳統(tǒng)飲片、破壁粉體、破壁飲片；Ⅲ1、Ⅲ2、Ⅲ3依次表示批號(hào)為0212092701的傳統(tǒng)飲片、破壁粉體、破壁飲片。圖4 菊花破壁飲片原料-中間品-成品的指紋圖譜

表5 各批次菊花破壁飲片的原料-中間品-成品間相關(guān)性分析(n=3)

4 討論

在選擇檢測(cè)波長(zhǎng)過(guò)程中，采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)菊花樣品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，由三維譜圖得出，在348 nm處樣品出峰數(shù)量多，峰分布均勻且基線平穩(wěn)，反應(yīng)信息量較大，故選取348 nm作為指紋圖譜最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。同時(shí)在有關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[4-8]，考察不同流動(dòng)相(乙腈-水，乙腈-0.5%磷酸溶液，乙腈-0.3%磷酸溶液，乙腈-0.1%磷酸溶液)，選擇乙腈-0.5%磷酸溶液作為流動(dòng)相并對(duì)洗脫梯度進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到較好的峰形及分離效果。同時(shí)比較了不同流速(0.6、0.8、1.0、1.2 mL·min-1)、不同柱溫(25、30、35 ℃)、不同色譜柱[Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Waters Symmetry C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)，Phenomenex Synergi 4u Fusion-RP 80A(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Thermo ODS HPERSIL C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)]的效果，最終確定了該方法的色譜條件。

本研究同時(shí)對(duì)同來(lái)源的菊花破壁飲片-中間體-傳統(tǒng)飲片進(jìn)行指紋圖譜研究并分析三者之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示三者之間全譜相似度均大于0.99，各色譜峰的保留時(shí)間幾乎一致，但存在一定的含量差異。結(jié)果表明菊花傳統(tǒng)飲片經(jīng)破壁粉碎并制成破壁飲片的過(guò)程中，化學(xué)成分組成無(wú)明顯的變化，破壁技術(shù)未造成主成分流失以及新化學(xué)成分的轉(zhuǎn)化或生成。圖4中，保留時(shí)間20 min和80 min處，由批號(hào)為20131201杭白菊制備的樣品Ⅰ1～Ⅰ3相對(duì)應(yīng)的色譜峰遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于其他兩批制成的樣品(Ⅱ1～Ⅱ3、Ⅲ1～Ⅲ3)。參考相關(guān)文獻(xiàn)[9-10]，推測(cè)：由于菊花采收時(shí)間及開(kāi)放狀態(tài)的不同，故3批菊花本身所含的化學(xué)成分和含量存在差異，故其制成的相應(yīng)破壁粉體和破壁飲片的組成成分和含量也存在相應(yīng)差異，因此可以體現(xiàn)該指紋圖譜對(duì)菊花破壁飲片能起到源頭的控制，確保菊花破壁飲片的質(zhì)量穩(wěn)定、均一，也提示了選材時(shí)應(yīng)采用同產(chǎn)地、同采收時(shí)間、同開(kāi)放狀態(tài)的杭白菊。

本研究建立的指紋圖譜方法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，可為菊花破壁飲片質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的制定、品質(zhì)評(píng)價(jià)、活性成分的藥理藥效學(xué)提供科學(xué)依據(jù)和指導(dǎo)作用。為更全面、科學(xué)地評(píng)價(jià)菊花破壁飲片的內(nèi)在質(zhì)量，后續(xù)仍需在本指紋圖譜研究的基礎(chǔ)上結(jié)合氣相色譜和液相色譜等多手段對(duì)菊花中綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A等重要指標(biāo)成分進(jìn)行含量差異分析，為菊花破壁飲片和傳統(tǒng)飲片之間的劑量換算和服用方式提供參考。

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StudyonHPLCFingerprintofCellWall-BrokenDecoctionPiecesofChrysanthemiFlos

LIU Xingyun1，2，3，WANGHuiling2，3，PENGLihua2，3，CHENGJinle1，2，3*

(1.ResearchCenterofChineseHerbalResourceScienceandEngineering，GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine，KeyLaboratoryofChineseMedicinalResourcefromLingnan，MinistryofEducation，Guangzhou510006，China；2.KeyLaboratoryofCell-brokenDecoctionPiecestechnologyandApplicationofstateAdministrationofTraditionalChineseMedicine，Zhongshan528437，China；3.ZEUSPharmaceuticalgroup，Zhongshan528437，China)

Objective：To establish the HPLC fingerprint of Cell Wall-Broken Decoction Pieces of Chrysanthemi Flos，and analyze the relativity between its decoction pieces，broken powder and broken particle，helping to evaluate its quality comprehensively.Methods：RP-HPLC method was performed on an Agilent C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)column with a gradient elution composed of acetonitrile-aqueous solution containing 0.5% phosphoric acid.The column temperature was set at 35 ℃，while the detective wavelength was set at 348 nm.Results：The chromatographic fingerprint common pattern was established.Fifteen mutual peaks were obtained from the chromatograms of eleven batches of samples.Conclusion：The method with good reproducibility is reliable and stable，which is feasible for quality control of cell wall-broken decoction pieces of Chrysanthemi Flos.

Chrysanthemi Flos；fingerprint；cell wall-broken decoction pieces；HPLC

2015-09-25)

中山市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013A3FC0253)

*

成金樂(lè)，教授，研究方向：破壁飲片及產(chǎn)業(yè)化，創(chuàng)新中藥研究與開(kāi)發(fā)；Tel：(0760)85312928，E-mail： gdcjl9@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.3.025