盧慧麗，林東強，姚善涇

?

親和仿生層析及在抗體純化中的應(yīng)用

盧慧麗，林東強，姚善涇

（浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，生物質(zhì)化工教育部重點實驗室，浙江 杭州 310027)

親和仿生層析是一種新型的生物分離技術(shù)，可用于生物活性物質(zhì)分離，尤其在抗體純化中表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，具有價格低廉、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、特異性較高等優(yōu)點。親和仿生層析的核心是具有特定結(jié)構(gòu)的仿生配基，主要包括化學(xué)合成配基和短肽配基兩種，通常通過合理的手段進行篩選和設(shè)計。理性設(shè)計是一種行之有效的方法，針對一個特定的目標(biāo)蛋白，隨機地去選擇配基是不可能的，必須采用理性設(shè)計構(gòu)建一個合理的配基庫，并通過高通量的篩選技術(shù)，才能得到合適的仿生配基。本文根據(jù)近年來國內(nèi)外親和仿生層析的研究進展，著重介紹了親和仿生配基的篩選和設(shè)計以及在抗體純化中的應(yīng)用。

親和仿生層析；化學(xué)合成配基；短肽配基；抗體；純化；分子模擬

引 言

所謂親和仿生層析就是模擬親和層析的分離原理，即基于抗原-抗體、酶-底物或激素-受體間的高度特異性相互作用來進行層析分離，并對配基進行特別設(shè)計的一種新型的生物分離技術(shù)，可用于生物活性物質(zhì)尤其是蛋白的分離純化。與親和層析類似，親和仿生層析是利用目標(biāo)蛋白與仿生配基間特異且可逆性結(jié)合的特性，從復(fù)雜的生物樣品中分離目標(biāo)蛋白，具有選擇性強、純化效率高等特點。親和層析介質(zhì)一般以固定化生物來源的蛋白基團作為功能配基，親和力和特異性較強，是生物分離中效率和選擇性最高的分離方法。然而生物親和配基通常成本高、不穩(wěn)定、洗脫條件苛刻等，這些缺點一定程度上限制了親和層析的應(yīng)用。因此，尋求一類與生物親和配基具有相似活性、通過人工合成的小分子化合物，并取而代之，已成為克服生物親和配基缺憾的重要途徑。親和仿生層析就由此而產(chǎn)生。

親和仿生層析研究的初期階段主要是利用常見的基團特異性化合物作為仿生配基，其中最具代表性的是金屬螯合類[1-2]、活性染料類[3-4]，這些配基結(jié)構(gòu)較為簡單，研究者對配基的選擇和利用僅建立在一般的經(jīng)驗之上，并未有針對性地進行篩選和設(shè)計，因此得到有價值的配基并不多，對目標(biāo)蛋白的選擇性也不如生物親和配基。直到20世紀(jì)80年代中后期，隨著組合化學(xué)和高通量篩選技術(shù)的發(fā)展，親和仿生配基的研究進入了快速發(fā)展的階段。研究者們開始針對目標(biāo)蛋白進行理性設(shè)計，采用不同的方式建立仿生配基庫，通過高通量篩選得到熱點配基，再利用這些熱點配基制備親和仿生介質(zhì)，通過目的明確的層析實驗，最終篩選得到適用于目標(biāo)蛋白的親和仿生配基。蛋白晶體解析技術(shù)的快速發(fā)展和計算機分子模擬技術(shù)的不斷進步，也為設(shè)計新型的親和仿生配基提供了強有力的技術(shù)支撐。通過分子模擬對蛋白結(jié)構(gòu)和潛在的配基結(jié)合位點進行分析，采用分子對接和分子動力學(xué)模擬等手段設(shè)計和篩選出潛在的配基，可以對實驗研究進行合理指導(dǎo)，有效降低實驗篩選的盲目性，節(jié)省研發(fā)時間和成本[5]。

抗體是一類重要的生物技術(shù)藥物，具有特異性高、靶向性強和毒副作用小等優(yōu)點，應(yīng)用前景廣闊[6]。目前蛋白A親和層析是抗體分離的平臺技術(shù)，特異性高，但由于采用蛋白類的生物親和配基，存在介質(zhì)成本高、洗脫條件苛刻、配基易脫落等問題[7-8]，因此尋求經(jīng)濟高效的抗體分離新方法具有重要的意義。研究者發(fā)現(xiàn)，通過對配基進行理性的設(shè)計和篩選，基于小分子化合物的親和仿生層析在保證高親和力的同時，可以很好地彌補蛋白A蛋白配基的不足，應(yīng)用于抗體分離純化中，可以得到很好的效果。本文將根據(jù)近年來國內(nèi)外親和仿生配基的研究進展，著重介紹親和仿生配基的設(shè)計、篩選以及在抗體純化中的應(yīng)用。

1 親和仿生配基

生物體內(nèi)存在一些大分子具有與某些分子產(chǎn)生特異性結(jié)合的能力，例如抗原-抗體、酶-底物、激素-受體等。親和層析正是利用這種特異性結(jié)合的能力即親和性，從復(fù)雜的生物樣品中純化目標(biāo)分子，優(yōu)缺點都非常明顯，專一性強、分離效率高是主要的優(yōu)點，但由于一般以固定化生物來源的蛋白基團作為功能配基，成本高、不穩(wěn)定、洗脫條件苛刻。親和仿生層析就是要在保持親和層析優(yōu)點的基礎(chǔ)上，改善其缺點。主要特點在于利用一些與目標(biāo)分子具有一定特異性和親和力的小分子功能基團作為配基，模擬生物親和作用，以達到純化目標(biāo)分子的目的。親和仿生層析的作用模式與親和層析類似[9]，可以分為上樣、親和吸附、洗脫和再生幾個過程，但條件控制尤其是洗脫條件相對簡單。以抗體的分離為例，理想情況下，親和仿生配基只能夠特異性識別目標(biāo)抗體，而對其他組分的非特異性吸附很小，因此經(jīng)過一次層析分離即可從復(fù)雜料液中獲得高純度的抗體產(chǎn)品。

親和仿生層析的關(guān)鍵在于合適的配基，理想的親和仿生配基應(yīng)該具備以下幾個特點：配基能夠與目標(biāo)蛋白可逆結(jié)合，具有足夠的親和力和選擇性；配基易于獲得，并易于固定化于層析基質(zhì)成為親和仿生層析介質(zhì)；配基對層析操作條件具有足夠的生物和化學(xué)穩(wěn)定性，不易被降解，也不易脫落而造成產(chǎn)品的污染；配基與目標(biāo)蛋白的結(jié)合常數(shù)不能太高以保證目標(biāo)蛋白和配基能夠在相對溫和的條件下解離。以上這些特點僅是對親和仿生配基的一般性要求，而實際應(yīng)用過程中由于目標(biāo)蛋白的種類繁多，立體結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)不盡相同，因此針對某種特定的目標(biāo)蛋白，必須開發(fā)相適應(yīng)的仿生配基。

根據(jù)仿生配基的組成，目前主要有化學(xué)合成配基和短肽仿生配基兩種。

1.1 化學(xué)合成仿生配基

通過化學(xué)方法合成親和仿生配基，要求分子量相對較小，與目標(biāo)蛋白具有一定的親和性，并能夠以共價鍵的方式偶聯(lián)到基質(zhì)上。目前適用于蛋白層析分離的化學(xué)合成配基并不多，主要分為兩類：基于三嗪結(jié)構(gòu)的配基[10-13]，多組分反應(yīng)合成的配基[14-15]。

三嗪類仿生配基可以通過三氯代三嗪與3種不同的化學(xué)取代基的反應(yīng)獲得，這種取代反應(yīng)受到溫度的調(diào)控。其中3種取代基可以直接從基本胺類物質(zhì)中選擇，也可以通過分子模擬做初步篩選[16]。通常在低溫下將三氯代三嗪偶聯(lián)到氨基活化的層析基質(zhì)上，保留兩個取代位點；進一步與具有目標(biāo)蛋白具有親和性的另外兩個取代基進行反應(yīng)，見圖1。

三嗪類化合物的合成路徑需要多步，反應(yīng)溫度在0～90℃變化，苛刻的反應(yīng)條件限制了配基合成過程的放大。Ugi等[17]提出了四組分合成反應(yīng)的概念，通過一步化學(xué)合成法就可以得到仿生配基。四組分包括乙醛（作為活化基質(zhì)的一部分）、羧基化合物、伯胺以及異腈結(jié)構(gòu)，如圖2所示[18]。配基以乙醛功能化的基質(zhì)為中心，羧基化合物、伯胺和異腈結(jié)構(gòu)則具有多樣性，針對特定目標(biāo)蛋白可以篩選特異性的取代基，從而實現(xiàn)親和結(jié)合。

與傳統(tǒng)反應(yīng)相比，多組分反應(yīng)具有一些突出的優(yōu)點[17, 19-20]。首先，多種組分共同參與反應(yīng)，每種組分的結(jié)構(gòu)變化將形成配基結(jié)構(gòu)的多樣性；其次，快速的化學(xué)取代過程可以在相對較短的時間內(nèi)提高仿生配基的設(shè)計空間；最后，多組分反應(yīng)通過“一步法”完成，可以有效節(jié)省時間和試劑用量，簡化中間產(chǎn)物的分離操作，可以考察多種化合物，也給過程放大帶來便利。

1.2 短肽仿生配基

短肽化合物以氨基酸作為原料，通過設(shè)計、篩選和優(yōu)化可以保證與目標(biāo)蛋白的親和性，又具有一定穩(wěn)定性和很好的生物相容性，非常適合作為仿生配基應(yīng)用于高附加值生物活性物質(zhì)的分離純化。以短肽化合物作為新型的親和仿生配基，可以突破一些傳統(tǒng)配基的局限性，成為近年來的研究熱點[21-24]。

1986年，Geysen等[25]指出：含關(guān)鍵氨基酸殘基的短肽可以模擬蛋白上的決定簇；多數(shù)情況下，短肽與目標(biāo)蛋白結(jié)合的相互作用力主要由關(guān)鍵殘基的非共價作用提供，這兩個觀點奠定了短肽配基的理論基礎(chǔ)。短肽配基通常由8～10個氨基酸殘基組成，一方面可以避免分子內(nèi)部折疊，降低短肽合成的難度；另一方面即使配基從固定相上脫落滲入產(chǎn)品中，也不會引起免疫中毒反應(yīng)，且很容易從最終產(chǎn)品中除去。此外短肽配基與蛋白的作用條件溫和，有利于洗脫條件的控制，避免目標(biāo)蛋白的變性；具有與生物親和配基類似的親和力，同時構(gòu)象和理化性質(zhì)則更為穩(wěn)定，能夠耐受層析分離中較強的再生條件。

短肽固相合成技術(shù)的建立和短肽合成方法的成熟極大地提高了人工合成多肽的效率，推動了組合肽庫和短肽仿生配基篩選的發(fā)展。圖3是組合肽庫的構(gòu)建方法[18]，短肽合成的循環(huán)次數(shù)是由構(gòu)成短肽的氨基酸數(shù)量所決定，肽庫中的短肽配基數(shù)目取決于短肽的長度以及所用氨基酸的數(shù)目。若以天然氨基酸作為原料，構(gòu)建的組合肽庫中短肽配基數(shù)目可達百萬，若引入非天然氨基酸，則短肽配基庫又會得到進一步的擴大，從而顯著增加了配基篩選的難度。因此，最好的方法就是在構(gòu)建組合肽庫時，對氨基酸的種類有所選擇，實現(xiàn)仿生配基的理性設(shè)計，限制待篩選配基庫的大小。

2 仿生配基的理性設(shè)計

無論是化學(xué)合成配基還是短肽配基，構(gòu)成配基的功能基團或者氨基酸殘基的種類都很多，理論上可能出現(xiàn)上億種組合，隨機選擇的效率很低，因而采用理性設(shè)計方法，構(gòu)建一個合理的配基庫是十分必要的。基于蛋白結(jié)構(gòu)解析技術(shù)的快速發(fā)展，研究者可以獲得高精度的蛋白空間結(jié)構(gòu)信息，為計算機輔助配基設(shè)計提供了基礎(chǔ)。計算機分子模擬技術(shù)也在不斷進步，可以從蛋白的高級結(jié)構(gòu)入手，研究蛋白和配基之間的相互作用，為設(shè)計新型的仿生親和配基提供了有效的技術(shù)支持。通過分子模擬對蛋白結(jié)構(gòu)和潛在的配基結(jié)合位點進行分析，采用分子對接和分子動力學(xué)模擬等手段優(yōu)化配基結(jié)構(gòu)，可以有效降低實驗的盲目性，節(jié)省實驗成本，提高研發(fā)效率[5]。計算機輔助配基設(shè)計，一般可以從兩個方面入手：一是分析已有天然配基和目標(biāo)蛋白的結(jié)合模式，以天然配基活性位點的關(guān)鍵殘基作為模板進行理性設(shè)計；二是針對目標(biāo)蛋白表面潛在的活性部位，設(shè)計與其結(jié)構(gòu)互補的化合物作為仿生配基[26]。

2.1 模擬天然配基結(jié)構(gòu)的理性設(shè)計

蛋白的生物學(xué)功能依賴于其與其他分子的相互識別和相互作用，從而形成具有特殊功能的復(fù)合物。因此，可以通過分析蛋白和天然配基間的結(jié)合模式，確定天然配基的關(guān)鍵殘基，并以此作為模板設(shè)計仿生親和配基。

Lowe教授課題組借助計算機分離模擬開發(fā)了基于三嗪結(jié)構(gòu)和Ugi反應(yīng)的仿生親和配基，用于純化IgG。模擬蛋白A的關(guān)鍵殘基Phe132-Tyr133，將三嗪取代基確定為苯丙氨酸和酪氨酸，得到仿生配基ligand22/8[10, 13]，用于單克隆抗體和Fc融合蛋白的分離純化，取得蛋白A親和層析相媲美的純化效果。模擬蛋白L，以苯甲酰胺和丁酸作為取代基，得到仿生配基ligand8/7[11]，用于純化抗體以及Fab和scFV片段。Platis等[27]也采用類似的方法，模擬包膜蛋白gp41的關(guān)鍵殘基，設(shè)計并合成了仿生配基4E10lig，用于從轉(zhuǎn)基因煙草中分離HIV單克隆抗體4E10。Maltezos等[28]設(shè)計并合成了三嗪類仿生配基4ABS-trz-4ABS，一步層析從轉(zhuǎn)基因玉米中分離單抗2G12。Qian等[29]以蛋白G與IgG的Fc片段特異性結(jié)合的熱點殘基Asn35和Trp43作為模板，設(shè)計并合成了以對氨基苯甲酰胺和乙酸作為功能化取代基的親和仿生配基A2C11l1，該配基與Fc片段的結(jié)合模式與蛋白G基本吻合，可以作為純化抗體的有效手段。Khoury等[30]則模擬蛋白G與IgG的Fab片段結(jié)合的熱點殘基，通過理性設(shè)計合成了以氨基苯甲酰胺和羥苯基乙酸作為取代基的親和仿生配基A2C7l1，計算機模擬結(jié)果顯示該配基能夠與Fab分子的CH1結(jié)構(gòu)域結(jié)合，進一步通過電離質(zhì)譜以及核磁共振得到驗證。Khoury等[14]通過模擬促紅細胞生成素受體（EPOR）的關(guān)鍵殘基Phe93、His114和Glu117，設(shè)計得到以組氨酸和琥珀酸作為取代基的仿生配基A9C10I8，一步層析從細胞培養(yǎng)液中分離得到高純度的重組紅細胞生成素。

對于多肽仿生配基，同樣可以采用天然配基作為模板進行理性設(shè)計，進一步利用分子模擬研究蛋白與配基間的相互作用，優(yōu)化配基結(jié)構(gòu)和空間分布，得到性能更加優(yōu)良的多肽配基。Salvalaglio等[31]利用分子動力學(xué)模擬詳細考察了蛋白A片段B與IgG的Fc片段復(fù)合物的作用機制，為蛋白A仿生配基的理性設(shè)計提供指導(dǎo)。結(jié)果表明，蛋白A和IgG之間主要是通過靜電相互作用和范德華相互作用結(jié)合；蛋白A上的Gln129、Phe132和Lys154是關(guān)鍵氨基酸殘基，對結(jié)合起主導(dǎo)作用，同時Tyr133、Leu136、Glu143和Gln151對結(jié)合的貢獻也比較大。Huang等[32]考察了蛋白A與IgG的結(jié)合模式，發(fā)現(xiàn)疏水作用占據(jù)主導(dǎo)地位，進一步分析表明，蛋白A的關(guān)鍵殘基為Phe132、Tyr133、His137、Glu143、Arg146和Lys154，而IgG的關(guān)鍵殘基為Ile253、His310、Gln311、Asp315、Lys317、Glu430和Asn434。基于上述結(jié)果，Zhao等[33]考慮到6個熱點殘基的空間分布，通過理性設(shè)計構(gòu)建了一個包含2173個短肽的仿生配基庫；利用分子對接篩選得到15個待選配基；通過分子動力學(xué)模擬分析15個配基與IgG的作用機制，并將親和性最高的配基FYWHCLDE成功應(yīng)用于IgG純化分離。Tong等[34]采用分子動力學(xué)模擬方法，考察了7種結(jié)合在抗體保守區(qū)域的天然配基與Fc片段的相互作用，發(fā)現(xiàn)疏水相互作用是主要驅(qū)動力，分析發(fā)現(xiàn)天然配基的熱點殘基均包括色氨酸或酪氨酸，提出了兩種不同的結(jié)合模式，以及仿生配基選擇和空間分布的建議?；谏彼峤Y(jié)合模式，Tong等[35]設(shè)計了色氨酸-氨基苯并咪唑的雜合配基W-ABI，并制備親和仿生層析介質(zhì)，對抗體具有高度親和性，且在溫和的條件下可實現(xiàn)有效洗脫，取得理想的收率和純度。另外，Wang等[36]結(jié)合分子對接和分子動力學(xué)模擬，研究了新型短肽配基 DAAG 與抗體Fc片段之間的相互作用機制，指出 DAAG 配基以類似三腳架的結(jié)合方式作用于 Fc 片段保守結(jié)合區(qū)域附近，其中靜電相互作用與范德華相互作用貢獻相當(dāng)，提出了短肽配基設(shè)計時應(yīng)考慮含疏水芳香環(huán)的氨基酸和帶正電的精氨酸。

通過模擬天然配基結(jié)構(gòu)來理性設(shè)計親和仿生配基，也存在一定的局限性。分析原因，其一在于蛋白與天然配基的晶體結(jié)構(gòu)有限，且在很多情況下，與目標(biāo)蛋白存在特異性結(jié)合的天然配基未被發(fā)現(xiàn)，或是蛋白-配基復(fù)合物結(jié)構(gòu)未被解析。其二在于仿生配基的設(shè)計往往只考慮模仿天然配基的熱點殘基，忽視了配基與蛋白之間的空間匹配性，在一定程度上可能造成仿生配基與天然配基的作用位點不一致。

2.2 基于目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)的理性設(shè)計

在無法得到蛋白-天然配基復(fù)合物結(jié)構(gòu)的情況下，可以直接從目標(biāo)蛋白的高級結(jié)構(gòu)出發(fā)，分析潛在的結(jié)合位點，設(shè)計出與目標(biāo)蛋白活性位點或暴露于蛋白表面的氨基酸殘基互補的親和配基。

Sproule等[37]通過同源建模的方法構(gòu)建出重組人胰島素前體（MI13）的三維結(jié)構(gòu)，以其表面的疏水特征區(qū)域作為目標(biāo)結(jié)合位點，設(shè)計仿生親和配基，構(gòu)建了含66個基于三嗪結(jié)構(gòu)的配基庫，從中篩選得到與MI13具有較強親和力的配基ligand2/2，取代基為兩個氨基萘醇，成功實現(xiàn)釀酒酵母細胞發(fā)酵液中純化MI13。Baumann等[38]以豬胰腺a淀粉酶（PPA）的催化活性位點作為靶點，通過理性設(shè)計構(gòu)建了一個含53個潛在配基的仿生配基庫，利用分子對接和實驗相結(jié)合進行篩選，得到了配基G5-A33；進一步偶聯(lián)于瓊脂糖凝膠制備仿生介質(zhì)，發(fā)現(xiàn)可以通過PPA抑制劑實現(xiàn)PPA的洗脫，證實了該配基確實結(jié)合于PPA的活性中心。Carredano等[39]以人IgG κ-Fab片段的CH1和CL間的保守口袋區(qū)域作為靶點，設(shè)計并計算機虛擬篩選得到249個待選配基，進一步結(jié)合飽和轉(zhuǎn)移差譜NMR（STD-NMR）和表面等離子體共振（SPR）手段進行二次篩選，最后得到了3個高特異性的仿生親和配基。Liu等[40]以組織型纖溶酶原激活物t-PA的表面口袋結(jié)構(gòu)作為靶點，理性設(shè)計并通過分子對接篩選得到了一種四肽仿生配基QDES，通過分子模擬證明了配基通過靜電相互作用以及氫鍵與t-PA相結(jié)合，偶聯(lián)配基制備仿生介質(zhì)，可以從豬心提取液中純化t-PA。

基于目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)的理性設(shè)計方法高度依賴于對目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)的認知，根據(jù)目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)參數(shù)，設(shè)計出有利于與目標(biāo)蛋白作用的仿生配基，并通過實驗驗證和后續(xù)結(jié)構(gòu)優(yōu)化以提高性能。當(dāng)無法得到目標(biāo)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)時，則可通過同源建模方法構(gòu)建蛋白結(jié)構(gòu)，也已應(yīng)用于配基的理性設(shè)計。

3 仿生配基的篩選技術(shù)

不管是基于天然配基還是目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)的理性設(shè)計，都可以得到相對適合目標(biāo)蛋白的潛在配基，構(gòu)建一個合理的配基庫，大大降低仿生配基庫的容量大小。為了得到更為合適的仿生配基應(yīng)用于實際分離，還必須對潛在配基進行進一步的篩選。配基設(shè)計和篩選過程，既要關(guān)注配基與目標(biāo)蛋白的特異性結(jié)合，同時還要兼顧蛋白與配基的解離條件，避免蛋白活性發(fā)生變化。目前比較成熟的篩選方法有組合化學(xué)法、噬菌體展示法以及計算機輔助法。

3.1 組合化學(xué)技術(shù)

組合化學(xué)是一種化學(xué)合成策略和篩選方法，最大的優(yōu)勢在于能夠在短時間內(nèi)合成大量的化合物，構(gòu)建組合庫，從而實現(xiàn)具有某種物理、化學(xué)性質(zhì)或生物活性的化合物的快速篩選[26]。組合化學(xué)技術(shù)在新材料、藥物、催化劑等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，也可作為篩選化學(xué)合成和短肽仿生配基的有利工具之一。

利用組合化學(xué)高通量篩選仿生層析介質(zhì)如圖4所示，一般包括以下步驟[41]：（1）構(gòu)建組合化學(xué)庫，選擇合適的小分子化合物或氨基酸作為配基偶聯(lián)到固定相上；（2）初步篩選，目標(biāo)蛋白用熒光染料或生物素標(biāo)記，利用目標(biāo)蛋白和備選化合物之間親和性的差別進行篩選，與目標(biāo)蛋白結(jié)合較好的化合物可作為陽性配基；（3）鑒定化合物序列，利用HPLC/MS、MALDI-TOF-MS等方法對陽性配基進行解析和鑒定；（4）配基合成、偶聯(lián)和評估，利用固相法合成仿生配基，偶聯(lián)到合適的層析基質(zhì)上，考察目標(biāo)蛋白的吸附和分離性能；（5）應(yīng)用驗證，仿生介質(zhì)應(yīng)用于實際分離體系，驗證分離效果。

由于化學(xué)合成配基和短肽配基的構(gòu)成單元有所差別，組合化學(xué)庫的篩選策略也有所差異[18]。對于化學(xué)合成仿生配基，一般采用離散實驗法。將偶聯(lián)待篩選配基的固相分散在96孔板中，在不同液相條件下與目標(biāo)蛋白樣品進行平行的吸附實驗，挑選出高效結(jié)合目標(biāo)蛋白的配基進行后續(xù)測序分析。Saraswat等[42]詳細描述了96孔板平行實驗法從組合化學(xué)庫中篩選特異性結(jié)合人血清白蛋白HSA的配基過程。Teng等[16]利用組合化學(xué)對含88個與IgG結(jié)合的候選配基庫進行篩選，得到了仿生配基ligand 22/8，可以將IgG從人血漿中高效分離出來。Roque等[11]通過理性設(shè)計和組合化學(xué)相結(jié)合，獲得蛋白L的仿生配基ligand8/7，可以從hIgG的木瓜蛋白酶水解液中分離Fab片段。Haigh等[15]研究多組分Ugi反應(yīng)合成仿生配基時，也是采用組合化學(xué)法對取代基進行篩選。

短肽配基庫的高通量篩選不僅可以采用離散實驗法，也可以用“分割和重組”法。具體步驟如下：首先將偶聯(lián)待篩選配基的固定相與目標(biāo)蛋白在特定的緩沖液體系中進行吸附反應(yīng)；然后將固定相與能夠和目標(biāo)蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)的標(biāo)記抗體反應(yīng)，進行免疫染色；依據(jù)免疫染色結(jié)果篩選出固定相，并將目標(biāo)蛋白和標(biāo)記抗體洗脫；最后進行配基測序分析。該方法雖然快速有效，但可能會出現(xiàn)一些假陽性結(jié)果，后續(xù)進行了一些改良，如采用酶或熒光物質(zhì)標(biāo)記的目標(biāo)蛋白與固定相發(fā)生反應(yīng)[43]、采用兩種顏色的標(biāo)記物進行標(biāo)記[44]或采用正交染色法[45]，可以顯著減少假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。Kaufman等[46]以人血纖維蛋白原為目標(biāo)蛋白，采用免疫染色技術(shù)從短肽庫中篩選獲得親和仿生配基FLLVPL。Gurgel等[47]利用組合化學(xué)篩選α-乳白蛋白的六肽仿生配基WHWRKR[48]。Yang等[49]針對IgG的Fc片段構(gòu)建了一個N端開始依次為組氨酸-芳香族氨基酸-堿性氨基酸的六肽庫，利用組合化學(xué)進行三輪篩選，得到了特異性結(jié)合Fc片段的六肽配基HWRGWV，具有廣譜的抗體識別能力，可以應(yīng)用于乳清、脫脂牛奶和牛初乳中純化IgG以及細胞培養(yǎng)液中純化IgG和IgA[23, 50-51]。

組合化學(xué)法應(yīng)用于配基高通量篩選的優(yōu)勢在于：固相合成時，液相反應(yīng)物過量可以促使反應(yīng)完成，操作簡單，終產(chǎn)物收率高。但也存在一定的局限性，如反應(yīng)的溶劑受到限制，化學(xué)合成過程的條件優(yōu)化較為復(fù)雜，且必須通過構(gòu)建大庫容、高質(zhì)量的隨機組合庫來實現(xiàn)其多樣性，在實際工作中往往比較費時費力。

3.2 噬菌體展示技術(shù)

噬菌體展示技術(shù)是一種利用生物技術(shù)手段快速構(gòu)建隨機多肽庫的方法?；驹硎菍⒁欢尉幋a多肽的隨機基因片段插入噬菌體基因，并與噬菌體外殼蛋白進行融合表達，利用噬菌體能夠大量復(fù)制的特點，從而快速得到外殼含不同多肽的噬菌體展示庫[41]。一般可以通過降解DNA鏈或直接將某個基因的全部序列隨機插入，從而得到一個噬菌體展示多肽庫。

插入基因所表達的多肽一般呈線性展示在噬菌體的表面，然后可以利用目標(biāo)蛋白對噬菌體展示庫進行篩選。目標(biāo)蛋白選擇性地與外源肽結(jié)合，分離出含目標(biāo)多肽的噬菌體，經(jīng)過3～5輪的“吸附-洗脫-擴增”篩選，可以使含有高親和力多肽的噬菌體高度富集，最后合成該目標(biāo)多肽，考察蛋白吸附性能[52]。利用噬菌體展示技術(shù)進行肽庫篩選的優(yōu)勢在于篩選容量大，且利用噬菌體快速增殖的特性可實現(xiàn)目標(biāo)多肽的快速富集。Cwirla等[53]利用噬菌體展示技術(shù)，構(gòu)建了一個可結(jié)合抗體和其他受體的多肽庫，成千上萬的六肽表達在噬菌體表面，篩選出高效結(jié)合單克隆抗體3-E7的多肽。經(jīng)過三輪篩選，得到了51個多肽配基，化學(xué)合成其中6種，測得單抗3-E7的結(jié)合常數(shù)在0.35~8.3 μmol·L-1之間。Huang等[54]針對人血漿中糖蛋白vWF，利用噬菌體展示技術(shù)篩選得到了特異性結(jié)合的多肽配基RVRSFY，發(fā)現(xiàn)仿生介質(zhì)與vWF之間通過靜電和疏水相互作用結(jié)合。Gaskin等[55]基于絲狀噬菌體M13構(gòu)建了一個七肽配基庫，篩選出脂肪酶的親和配基，通過ELISA法確定親和性最好的配基，偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠制備仿生介質(zhì)，但純化效果并不十分理想，表明七肽與脂肪酶之間的親和力不僅與多肽序列有關(guān)，也可能與噬菌體的外殼蛋白相關(guān)。Ehrlich等[56]以人源抗Tac單克隆抗體（HAT）作為目標(biāo)蛋白，利用噬菌體展示技術(shù)篩選與其保守區(qū)域具有親和性的多肽配基，構(gòu)建了七肽庫和十二肽庫，進行四輪高通量篩選，并根據(jù)蛋白A同源性的高低程度進行排序，得到了5種多肽配基，發(fā)現(xiàn)EPIHRSTLTALL短肽仿生介質(zhì)效果最好。

噬菌體展示技術(shù)可以作為多肽庫的高通量篩選手段，不過也存在著一些缺點[52]。例如，宿主細胞對于多肽具有一定的選擇性，一些親和性好的多肽可能由于對宿主生長不利或者具有毒性而被排除；篩選的多肽在游離狀態(tài)時對目標(biāo)蛋白的生物活性下降或消失；篩選多肽難以偶聯(lián)到基質(zhì)等。

3.3 計算機輔助篩選技術(shù)

針對目標(biāo)蛋白，無論是組合化學(xué)還是噬菌體展示，都是基于實驗的高通量篩選手段，工作量巨大。一些學(xué)者探討借助計算機輔助手段進行虛擬篩選，具有不消耗實驗耗材、節(jié)省人力和時間成本等優(yōu)勢。近年來，計算機性能不斷提高，分子模擬技術(shù)飛速發(fā)展，研究者可以從原子尺度來研究分子間相互作用模式，探討結(jié)合過程中作用力和結(jié)構(gòu)的變化，從而為仿生配基的篩選提供了新的途徑。目前常用的方法包括分子對接和分子動力學(xué)模擬。

分子對接基于分子間的空間匹配和能量匹配，預(yù)測兩個或多個分子間的識別過程，廣泛應(yīng)用于研究小分子與大分子間相互作用、生物大分子識別和藥物設(shè)計等領(lǐng)域。根據(jù)配體-受體的簡化程度和方式，可以分為剛性對接、半柔性對接和柔性對接3種，其中半柔性對接兼顧了計算量和預(yù)測能力，應(yīng)用較為廣泛。常用分子對接軟件包括DOCK、Autodock、LUDI、GOLD、FlexX、LigandFit、Glide和ICM-Dock等[5]。分子動力學(xué)模擬以牛頓經(jīng)典力學(xué)為基礎(chǔ)，通過數(shù)值求解的方式來描述體系的運動方式，模擬體系隨時間的動態(tài)演化過程，在生物大分子結(jié)構(gòu)和功能研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。根據(jù)分子力場的簡化程度，可以分為全原子力場、聯(lián)合原子力場以及粗?；?種，主要有AMBER、CHARMM、GROMACS、GROMOS和MARTINI等力場[5]。分子動力學(xué)模擬可以計算蛋白與配基之間的相互作用能，從而評價二者間是否存在特異性結(jié)合。由于蛋白分子量較大，分子動力學(xué)模擬的計算量大，耗時長，通常需要與一些高通量的篩選方法（如分子對接等）結(jié)合使用，利用分子對接進行初篩，然后采用分子動力學(xué)模擬開展精確驗證。

對于化學(xué)合成的仿生配基來說，潛在的功能取代基的數(shù)目巨大，采用計算機輔助手段對取代基進行篩選，可以大大減少工作量。Li等[13]研究了蛋白A和IgG的Fc片段間的特異性識別位點，設(shè)計了一系列三嗪類仿生配基，利用分子對接進行篩選，得到了一個能夠與蛋白A競爭的仿生配基ApA，與IgG的結(jié)合常數(shù)為105～106L·mol-1。Feng等[57]利用分子對接，從200個類似于蛋白A活性位點結(jié)構(gòu)的化合物庫中篩選出了一個仿生配基-cbz-L-Tyr，與IgG的結(jié)合常數(shù)為4.91×106L·mol-1。Qian等[29]利用多組分Ugi反應(yīng)合成蛋白G仿生配基時，基于蛋白G和鼠源IgG1的Fab片段結(jié)合區(qū)域的X射線晶體結(jié)構(gòu)，理性設(shè)計一些潛在的功能取代基，將配基與Fab片段進行分子對接，篩選得到了A2C7l1仿生配基，可以從哺乳動物或者酵母細胞培養(yǎng)液中純化得到IgG和Fab片段。

計算機輔助技術(shù)也被應(yīng)用于短肽仿生配基的篩選。Liu等[58]使用柔性對接，對理性設(shè)計的多肽配基庫進行篩選，建立了一個可以評價多肽配基與目標(biāo)蛋白之間親和力的打分函數(shù)，由分子對接計算Dscore值直接用于評價親和力?；讦?淀粉酶，篩選得到六肽配基FHENWS，表觀結(jié)合常數(shù)為2.5×105L·mol-1，偶聯(lián)FHENWS六肽配基制備仿生介質(zhì)，實現(xiàn)從谷草芽孢桿菌粗發(fā)酵液中分離α-淀粉酶。Liu等[40]利用分子對接和分子動力學(xué)模擬相結(jié)合的手段，篩選得到了針對組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）的短肽配基。首先構(gòu)建了一個含14個四肽的短肽配基庫，在目標(biāo)蛋白的待定結(jié)合口袋進行分子對接，評價配基與目標(biāo)蛋白的親和性，篩選得到了高親和性的四肽配基QDES，進一步利用分子動力學(xué)模擬驗證QDES-t-PA復(fù)合物的結(jié)合穩(wěn)定性。偶聯(lián)QDES配基于瓊脂糖凝膠，通過一步層析從豬心提取液中分離得到純度較高的t-PA。Aghaee等[59]也利用分子對接和分子動力學(xué)模擬相結(jié)合，篩選得到人血清白蛋白的短肽配基?；贖SA的待定結(jié)合口袋建立一個短肽配基庫，采用分子對接進行篩選，計算二肽與HSA之間的親和力，篩選得到二肽配基Trp-Trp，在尾部添加空間臂Lys[CO(CH2)5NH]，進一步進行分子對接，并對配基-蛋白復(fù)合物進行分子動力學(xué)模擬，結(jié)果表明配基與蛋白可以實現(xiàn)緊密結(jié)合。

4 親和仿生層析在抗體分離純化中的應(yīng)用

抗體是一類重要的生物技術(shù)藥物，親和仿生層析作為一種新型的生物分離技術(shù)，因其價格相對低廉、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、特異性較高、純化過程更易于控制等優(yōu)點，在抗體純化中表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。針對特定抗體，可以通過計算機輔助技術(shù)和實驗研究相結(jié)合的方法，得到高度親和與特異性的仿生親和配基。

4.1 化學(xué)合成配基

4.1.1 三嗪類仿生配基

三嗪類化合物作為重要的化學(xué)合成仿生配基，已成功用于抗體的分離純化，表1列舉了近年來用于抗體分離的三嗪類仿生配基。劍橋大學(xué)Lowe教授課題組[10-13, 15-16]在該方面做了大量工作，通過分子模擬等手段大大縮小了相關(guān)胺類物質(zhì)的篩選范圍。Li等[13]以蛋白A作為模板，設(shè)計了基于三嗪類的仿生配基。通過分析蛋白A與IgG-Fc片段復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，確定二者間的特異性識別位點，用計算機輔助分子模擬手段設(shè)計了一系列仿生配基。其中以關(guān)鍵殘基Phe132-Tyr133二肽作為模板設(shè)計仿生配基Ligand 22/8，將其偶聯(lián)到瓊脂糖基質(zhì)上用于分離血漿中的抗體，吸附容量可達到50 mg·g-1以上，抗體收率大于60%，純度大于92%，且該介質(zhì)可以在1 mol·L-1NaOH中保存7 d[10]?；谠撆浠纳虡I(yè)化介質(zhì)MabSorbent A1P，已應(yīng)用于單克隆抗體和Fc融合蛋白的分離純化，可以達到蛋白A親和層析的效果。另一種衍生的商業(yè)化仿生介質(zhì)MabSorbent A2P，以-氨基苯酚/-氨基苯酚雙取代三嗪作為功能化配基，也可以達到很好的抗體分離效果[60-62]。

表1 用于抗體分離的三嗪類仿生配基 Table 1 Triazine-based biomimetic ligands for antibody separation

Roque等[11]以蛋白L作為模板，利用理性設(shè)計和組合化學(xué)的方法設(shè)計了仿生配基Ligand 8/7，用于純化抗體以及Fab和scFV片段，可以從hIgG的木瓜蛋白酶降解液中分離Fab片段，純度達97%。Platis等[27]和Maltezos等[28]則分別針對抗HIV的單克隆抗體4E10和2G12，設(shè)計并合成了三嗪類仿生配基4E10lig和4ABS-trz-4ABS，采用一步層析從轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)基因玉米中分離單抗。

Telma等[67]利用一種更為綠色簡單的方法合成了仿生配基TPN-BM，解決了Ligand22/8配基的溶解限制。以醚鍵替換了傳統(tǒng)三嗪仿生配基中取代基與三嗪核心結(jié)構(gòu)間的氨基結(jié)構(gòu)，配基合成反應(yīng)溫度控制在0℃，催化劑也更為綠色安全。將配基偶聯(lián)到殼聚糖整體柱上，吸附容量高達160 mg·g-1，從哺乳動物細胞培養(yǎng)液中捕獲單抗，收率達85%，純度高達98%。

4.1.2 多組分反應(yīng)合成的配基

Lowe教授課題組[15, 29-30]開發(fā)了多個Ugi反應(yīng)合成的仿生配基，應(yīng)用于抗體的分離純化，配基結(jié)構(gòu)如表2 所示。Haigh等[15]針對抗體構(gòu)建了一個由多個伯胺、羧酸和異腈組成的化合物庫，結(jié)合計算機輔助手段和層析過程篩選，采用Ugi反應(yīng)合成了一種蛋白L的仿生配基A3C1I1，偶聯(lián)于瓊脂糖凝膠制備仿生親和介質(zhì)，發(fā)現(xiàn)配基可以特異性地與IgG的Fab片段結(jié)合，而不與Fc片段發(fā)生作用，F(xiàn)ab片段的靜態(tài)吸附容量約16.6 mg·g-1，親和常數(shù)為2.6×10-6mol·L-1。Qian等[29]通過Ugi反應(yīng)合成了一種仿生配基A2C11I1，模擬蛋白G的Asn35和Trp43，與來源于人、牛、羊、鼠、豬、兔血清的IgG、雞血清IgY以及重組駱駝Fc結(jié)構(gòu)域均有較好的親和性。Khoury等[30]也采用Ugi反應(yīng)合成了蛋白G的仿生配基A2C7I1，分子模擬分析表明配基與IgG的Fab片段的結(jié)合位點在CH1區(qū)域，偶聯(lián)A2C7I1配基制備仿生介質(zhì)，從哺乳動物細胞培養(yǎng)液中純化IgG和Fab片段，收率達99%，純度93%。

表2 Ugi反應(yīng)合成的仿生配基 Table 2 Biomimetic ligands synthesized by Ugi reaction

4.2 短肽仿生配基

近年來應(yīng)用于抗體分離純化的短肽仿生配基如表3所示，主要包括多聚肽、線性肽以及環(huán)肽配基。

表3 用于抗體分離的短肽仿生配基 Table 3 Peptide-based biomimetic ligands for antibody separation

4.2.1 多聚肽配基

Fassina等[69]通過篩選多聚肽庫，得到可以特異性識別IgG的Fc片段的多聚肽，命名為TG19318。合成過程可以在溶液或固相中進行，產(chǎn)率高而成本較低，該配基與IgG的親和常數(shù)接近0.3 μmol·L-1[70]，吸附容量略低于蛋白A配基，不過可特異性結(jié)合的抗體種類更為廣泛，可以用于不同動物的血清和哺乳動物細胞培養(yǎng)液中分離IgG，以及卵黃中分離IgY，純度均在95%以上[71]。Palombo等將TG19318配基用于從細胞培養(yǎng)液和血清中分離IgA[72]，腹水中分離IgE[73]，血清、腹水、細胞培養(yǎng)液中分離IgM[74]，均取得了良好的分離效果。Verdoliva等[75]進一步對配基進行了改造，采用非天然D型氨基酸取代所有的天然氨基酸，發(fā)現(xiàn)D-PAM功能化的仿生介質(zhì)可以直接從血清中捕獲IgG，收率為60%～90%，純度90%。與蛋白水解酶接觸1 h后，水解比例小于10%，說明D-PAM配基既保持了PAM與抗體結(jié)合的特異性，又提高了對蛋白酶的耐受性。

4.2.2 線性肽配基

Carbonell教授課題組對線性短肽配基進行了深入研究，在介質(zhì)的吸附性能（靜態(tài)和動態(tài)吸附能力）、不同分離對象（動物血清、細胞培養(yǎng)液、乳清等）、配基-抗體相互作用機理等方面均有報道。Yang等[49]設(shè)計了以組氨酸作為N端、包含芳香族和帶正電氨基酸殘基的六肽組合化學(xué)庫，通過三次篩選得到了能夠特異性識別IgG-Fc片段的六肽配基HWRGWV，對Fc片段的選擇性與蛋白A相仿，從哺乳動物細胞培養(yǎng)液中捕獲hIgG，純度和收率均可達到95%[21]。研究表明，HWRGWV六肽配基與IgG的結(jié)合位點與蛋白A/蛋白G并不一致，質(zhì)譜和分子對接分析表明HWRGWV結(jié)合位點在pFc區(qū)域，與CH3域的Ser383-Asn389環(huán)發(fā)生作用[22]。以六肽HWRGWV作為功能配基，偶聯(lián)于層析基質(zhì)制備仿生介質(zhì)，經(jīng)基質(zhì)改造和層析過程優(yōu)化，實現(xiàn)從CohnⅡ+Ⅲ組分中純化IgG、IgA和IgM，乳清、脫脂牛奶和牛初乳中純化IgG，以及細胞培養(yǎng)液中純化IgG和IgA[23, 50-51]。值得關(guān)注的是，Menegatti等[24]通過介質(zhì)表面化學(xué)改性，避免配基偶聯(lián)時酯鍵的形成，制備出耐堿的HWRGWV六肽仿生介質(zhì)，經(jīng)過200次0.1 mol·L-1NaOH再生循環(huán)，IgG收率從91%下降到85%，而純度保持在95%左右。

Sugita等[76]通過考察IgG-Fcγ受體與Fc片段的相互作用，采用點合成多肽陣列技術(shù)合成了兩種親和力較強的八肽配基NKFRKYK和NARKFYKG，與IgG-Fc的親和常數(shù)分別為8.9×106L·mol-1和6.5×106L·mol-1，不過從細胞培養(yǎng)液中分離IgG和Fc片段時，純度分別僅為83%和68%。

Zhao等[33, 77]以蛋白A與IgG-Fc片段具有特異性結(jié)合的6個熱點殘基（F132、Y133、H137、E143、R146和K154）為基礎(chǔ)，引入半胱氨酸作為配基偶聯(lián)殘基，并充分考慮熱點殘基的空間距離等因素，將19種氨基酸插入到熱點殘基中，構(gòu)建了一個多肽庫；采用分子對接和分子動力學(xué)模擬的方法，篩選出3種八肽配基FYWHCLDE、FYCHWALE和FYCHTIDE，均可以有效地將hIgG從血漿和細胞培養(yǎng)液中分離出來。其中FYWHCLDE配基的吸附容量最大，分離性能最優(yōu)。Zhao等[78]進一步將FYWHCLDE配基偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠上，制備了不同配基密度（10.4～30.1 μmol·ml-1）的八肽仿生介質(zhì)，考察配基密度對IgG靜態(tài)和動態(tài)吸附的影響，結(jié)果表明隨著配基密度的增大，靜態(tài)吸附容量和動態(tài)載量均有明顯提高。此外，Zhao等[79]還將3種八肽配基兩兩混合偶聯(lián)到基質(zhì)上，制備了3種雙配基親和體系，發(fā)現(xiàn)與單配基體系相比，雙配基體系存在協(xié)同增強效應(yīng)，與hIgG的親和力更強。

4.2.3 環(huán)肽配基

Menegatti等[80]開發(fā)了一種新型的環(huán)肽配基cyclo[-M-WFRHY-K]，能夠特異性地結(jié)合IgG的Fc片段，而不結(jié)合Fab片段，對IgG的吸附容量和解離常數(shù)分別為19.7 mg·ml-1和7.6×10-6mol·L-1，應(yīng)用于從CHO細胞培養(yǎng)液中分離IgG1和IgG4時，可在更溫和的條件（pH4）下實現(xiàn)洗脫，收率和純度分別為96%和93%。結(jié)果表明，相對于線性肽，環(huán)肽配基具有更加合理的空間分布，對抗體具有更強的親和力和特異性，且對蛋白水解酶的耐受性更好。

綜上可見，由于結(jié)合組合化學(xué)和分子模擬等方法，仿生配基的設(shè)計和篩選效率得到了很大的提高，出現(xiàn)了一系列成功應(yīng)用于抗體分離純化的仿生配基。然而，值得注意的是仿生配基的合成方法還比較單一，還未能適應(yīng)抗體結(jié)構(gòu)復(fù)雜性的要求，使其整體結(jié)構(gòu)受到了限制，很難像天然生物配基那樣實現(xiàn)與抗體在空間結(jié)構(gòu)上的完美匹配，因此選擇性低于生物配基。

5 總結(jié)與展望

親和仿生層析是一種新型的生物分離技術(shù)，可用于生物活性物質(zhì)的分離純化，尤其在抗體純化中表現(xiàn)出良好的前景。親和仿生配基既具備了小分子配基價格低廉、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、清洗方便等優(yōu)點，又顯著提高了抗體結(jié)合的特異性，分離過程易于控制，顯現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力。

目前應(yīng)用比較廣泛的兩種親和仿生配基是化學(xué)合成仿生配基和短肽仿生配基，前者具有合成較為簡單、種類多樣等優(yōu)點；后者以氨基酸殘基作為原料，生物相容性好，與目標(biāo)蛋白的親和性高。無論是化學(xué)合成配基還是短肽配基，構(gòu)成配基的功能基團或者氨基酸殘基的種類都很多，隨機選擇的效率很低，因而采用理性設(shè)計方法，構(gòu)建一個合理的配基庫是十分必要的?；诘鞍捉Y(jié)構(gòu)解析的快速發(fā)展和計算機分子模擬技術(shù)的不斷進步，可以利用計算機輔助技術(shù)對仿生配基進行理性設(shè)計，包括模擬天然配基和基于目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)的理性設(shè)計。在理性設(shè)計的配基庫基礎(chǔ)上，針對特定分離對象，通過高通量的篩選，最終得到合適的仿生配基。目前比較成熟的篩選方法有組合化學(xué)法、噬菌體展示法以及計算機輔助篩選。鑒于仿生配基設(shè)計和篩選的復(fù)雜性，充分結(jié)合計算機輔助技術(shù)和實驗研究方法，可以提高研發(fā)效率，得到高度親和力和特異性的仿生親和配基。

針對抗體分離的仿生配基設(shè)計和篩選，可以采取如下策略：首先根據(jù)抗體結(jié)構(gòu)的特點，分析特征結(jié)合部位，利用分子模擬對配基進行理性設(shè)計，構(gòu)建一個仿生配基庫，采用高通量方法進行篩選，得到為數(shù)不多的潛在配基；合成潛在配基，實驗分析配基-抗體相互作用，驗證配基與目標(biāo)蛋白間的親和性，或者偶聯(lián)配基制備仿生介質(zhì)，通過親和層析進一步篩選，得到特異性結(jié)合的仿生親和配基；對仿生親和介質(zhì)的性能（如介質(zhì)孔徑、配基密度、空間臂等）以及層析過程進行優(yōu)化，應(yīng)用于實際分離體系。親和仿生層析已在抗體分離純化中得到了成功應(yīng)用，相信隨著相關(guān)技術(shù)的不斷進步，越來越多的目標(biāo)蛋白將可以“定制”仿生配基，實現(xiàn)高效的親和仿生層析分離。

References

[1] SERPA G, AUGUSTO E F P, TAMASHIRO W M S CEvaluation of immobilized metal membrane affinity chromatography for purification of an immunoglobulin G1 monoclonal antibody [J].Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical & Life Sciences, 2005, 816 (1/2): 259-268.

[2] ZIMMERMAN T, FRERE C P, SATZGER MSimultaneous metal chelate affinity purification and endotoxin clearance of recombinant antibody fragments [J].Journal of Immunological Methods, 2006, 314 (1/2): 67-73.

[3] LOWE C R,PEARSON J C. Affinity chromatography on immobilized dyes [J].Methods in Enzymology, 1984, 104 (104): 97-113.

[4] CLONIS Y D, LABROU N E, KOTSIRA V PBiomimetic dyes as affinity chromatography tools in enzyme purification [J].Journal of Chromatography A, 2000, 891 (1): 33-44.

[5] 童紅飛. 新型疏水性電荷誘導(dǎo)配基設(shè)計及層析分離抗體研究[D]. 杭州：浙江大學(xué), 2014: 18-22.
TONG H F. Antibody separation by hydrophobic charge-induction chromatography and novel ligand design [D]. Hangzhou：Zhejiang University, 2014: 18-22.

[6] MURAD J P, LIN O A, PAEZ ESPINOSA E VCurrent and experimental antibody-based therapeutics: insights, breakthroughs, setbacks and future directions [J].Current Molecular Medicine, 2013, 13 (1): 165-178.

[7] SHUKLA A A, HUBBARD B, TRESSEL TDownstream processing of monoclonal antibodies—application of platform approaches [J].Journal of Chromatography B, 2007, 848 (1): 28-39.

[8] LOW D, O’LEARY R,PUJAR N S. Future of antibody purification [J].Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical & Life Sciences, 2007, 848 (1): 48-63.

[9] ROQUE A C, SILVA C S,TAIPA M ?. Affinity-based methodologies and ligands for antibody purification: advances and perspectives [J].Journal of Chromatography A, 2007, 1160 (1): 44-55.

[10] SU F T, SPROULE K, HUSAIN AAffinity chromatography on immobilized “biomimetic” ligands. Synthesis, immobilization and chromatographic assessment of an immunoglobulin G-binding ligand [J]. Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical & Life Sciences, 2000, 740 (1): 1-15.

[11] ROQUE A C A, ?NGELA T M,LOWE C R. Synthesis and screening of a rationally designed combinatorial library of affinity ligands mimicking protein L from[J].Journal of Molecular Recognition, 2005, 18 (3): 213-224.

[12] ROQUE A C A, TAIPA M ?,LOWE C R. An artificial protein L for the purification of immunoglobulins and Fab fragments by affinity chromatography [J].Journal of Chromatography A, 2005, 1064 (2): 157-167.

[13] LI R, DOWD V, STEWART D JDesign, synthesis, and application of a protein A mimetic [J].Nature Biotechnology, 1998, 16 (2): 190-195.

[14] KHOURY G E, WANG Y, WANG DDesign, synthesis, and assessment of aaffinity adsorbent for the purification of recombinant human erythropoietin [J].Biotechnology & Bioengineering, 2013, 110 (11): 3063-3069.

[15] HAIGH J M, HUSSAIN A, MIMMACK M LAffinity ligands for immunoglobulins based on the multicomponent Ugi reaction [J].Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical & Life Sciences, 2009, 877 (14/15): 1440-1452.

[16] TENG S F, SPROULE K, HUSSAIN AA strategy for the generation of biomimetic ligands for affinity chromatography. Combinatorial synthesis and biological evaluation of an IgG binding ligand [J].Journal of Molecular Recognition, 1999, 12 (1): 67-75.

[17] ALEXER D,IVAR U. Multicomponent reactions with isocyanides [J]. Angewandte Chemie, 2000, 39 (18): 3168-3210.

[18] RALD P G, PATRICK S,EGISTO B. The quest for affinity chromatography ligands: are the molecular libraries the right source? [J]. Journal of Separation Science, 2015, 38 (15) 2559-2572.

[19] DOMLING A. Recent developments in isocyanide based multicomponent reactions in applied chemistry [J].Chemical Reviews, 2006, 106 (1): 17-89.

[20] WEBER L, ILLGEN K,ALMSTETTER M. Discovery of new multi component reactions with combinatorial methods [J].Synlett, 1999, 1999 (3): 366-374.

[21] YANG H, GURGEL P V,CARBONELL R G. Purification of human immunoglobulin GFc-specific small peptide ligand affinity chromatography [J].Journal of Chromatography A, 2009, 1216 (6): 910-918.

[22] YANG H, GURGEL P V, WILLIAMS D KBinding site on human immunoglobulin G for the affinity ligand HWRGWV [J]. Journal of Molecular Recognition, 2010, 23 (3): 271-282.

[23] NAIK A D, MENEGATTI S, GURGEL P VPerformance of hexamer peptide ligands for affinity purification of immunoglobulin G from commercial cell culture media [J].Journal of Chromatography A, 2011, 1218 (13): 1691-1700.

[24] MENEGATTI S, NAIK A D, GURGEL P VAlkaline-stable peptide ligand affinity adsorbents for the purification of biomolecules [J].Journal of Chromatography A, 2012, 1245 (13): 55-64.

[25] GEYSEN H M, RODDA S J,MASON T J. A priori delineation of a peptide which mimics a discontinuous antigenic determinant [J].Molecular Immunology, 1986, 23 (7): 709-715.

[26] 任軍，賈凌云. 親和色譜仿生配基的篩選和設(shè)計 [J].分析化學(xué), 2005, 33 (9): 1345-1349.
REN J, JIA L Y. Screening and design of affinity chromatography biomimetic ligand [J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2005, 33 (9): 1345-1349.

[27] PLATIS D, MALTEZOS A, MA K CCombinatorialdesign and application of a biomimetic affinity ligand for the purification of human anti-HIV mAb 4E10 from transgenic tobacco [J].Journal of Molecular Recognition, 2009, 22 (6): 415-424.

[28] ANASTASIOS M, DIMITRIS P, DIMITRIOS VDesign, synthesis and application of benzyl-sulfonate biomimetic affinity adsorbents for monoclonal antibody purification from transgenic corn [J].Journal of Molecular Recognition, 2014, 27 (1): 19-31.

[29] QIAN J, KHOURY G E, ISSA HA synthetic protein G adsorbent based on the multi-component Ugi reaction for the purification of mammalian immunoglobulins [J].Journal of Chromatography B, 2012, 898 (6): 15-23.

[30] KHOURY G E, LOWE C R. A biomimetic protein G affinity adsorbent: an Ugi ligand for immunoglobulins and Fab fragments based on the third IgG‐binding domain of protein G [J].Journal of Molecular Recognition, 2013, 26 (4): 190-200.

[31] SALVALAGLIO M, ZAMOLO L, BUSINI VMolecular modeling of protein A affinity chromatography [J].Journal of Chromatography A, 2009, 1216 (50): 8678-8686.

[32] HUANG B, LIU F F, DONG X YMolecular mechanism of the affinity interactions between protein A and human immunoglobulin G1 revealed by molecular simulations [J].Journal of Physical Chemistry B, 2011, 115 (14): 4168-4176.

[33] ZHAO W W, LIU F F, SHI Q HBiomimetic design of affinity peptide ligands for human IgG based on protein A-IgG complex [J].Biochemical Engineering Journal, 2014, 88 (28): 1-11.

[34] TONG H F, LIN D Q, ZHANG Q LMolecular recognition of Fc-specific ligands binding onto the consensus binding site of IgG: insights from molecular simulation [J].Journal of Molecular Recognition, 2014, 27 (8): 501-509.

[35] TONG H F, LIN D Q, CHU W NMultimodal charge-induction chromatography for antibody purification [J].Journal of Chromatography A, 2015, 1429: 258-264.

[36] WANG R Z, LIN D Q, TONG H FMolecular insights into the binding selectivity of a synthetic ligand DAAG to Fc fragment of IgG [J].Journal of Molecular Recognition, 2014, 27 (5): 250-259.

[37] SPROULE K, MORRILL P, PEARSON J CNew strategy for the design of ligands for the purification of pharmaceutical proteins by affinity chromatography [J].Journal of Chromatography B Biomedical Sciences & Applications, 2000, 740 (1): 17-33.

[38] BAUMANN H, ?HRMAN S, SHINOHARA YRational design, synthesis, and verification of affinity ligands to a protein surface cleft [J].Protein Science A Publication of the Protein Society, 2003, 12 (4): 784-793.

[39] CARREDANO E, BAUMANN H, GR NBERG AA novel and conserved pocket of human κ-Fab fragments: design, synthesis, and verification of directed affinity ligands [J].Protein Science, 2004, 13 (6): 1476-1488.

[40] LIU F F, DONG X Y, WANG TRational design of peptide ligand for affinity chromatography of tissue-type plasminogen activator by the combination of docking and molecular dynamics simulations [J].Journal of Chromatography A, 2007, 1175 (2): 249-258.

[41] 王榮柱. 以四肽為配基的仿生層析和抗體的分離純化 [D]. 杭州：浙江大學(xué), 2015: 14-18.
WANG R Z. Research on tetrapeptide biomimetic chromatography for antibody purification [D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2015: 14-18.

[42] SARASWAT L D, ZHANG H, HARDY L WAffinity ligand selection from a library of small molecules: assay development, screening, and application [J].Biotechnology Progress, 2005, 21 (1): 300-308.

[43] LAM K S, SALMON S E, HERSH E MA new type of synthetic peptide library for identifying ligand-binding activity [J].Nature, 1991, 354 (6348): 82-84.

[44] LAM K S, WADE S, ABDULLATIF FApplication of a dual-color detection scheme in the screening of a random combinatorial peptide library [J].Journal of Immunological Methods, 1995, 180 (2): 219-223.

[45] BUETTNER J A, DADD C A, BAUMBACH G AChemically derived peptide libraries: a new resin and methodology for lead identification [J]. International Journal of Peptide and Protein Research, 1996, 47 (1/2): 70-83.

[46] KAUFMAN D B, HENTSCH M E, BAUMBACH G AAffinity purification of fibrinogen using a ligand from a peptide library [J].Biotechnology & Bioengineering, 2002, 77 (3): 278-289.

[47] GURGEL P V, CARBONELL R G,SWAISGOOD H E. Identification of peptide ligands generated by combinatorial chemistry that bind α-lactalbumin [J].Separation Science & Technology, 2001, 36 (11): 2411-2431.

[48] GURGEL P V, CARBONELL R G,SWAISGOOD H E. Fractionation of whey proteins with a hexapeptide ligand affinity resin [J].Bioseparation, 2000, 9 (6): 385-392.

[49] YANG H, GURGEL P V,CARBONELL R G. Hexamer peptide affinity resins that bind the Fc region of human immunoglobulin G [J].Journal of Peptide Research, 2005, 66 (s1): 120-137.

[50] NAIK A D, MENEGATTI S, REESE H RProcess for purification of monoclonal antibody expressed in transgenic Lemna plant extract using dextran-coated charcoal and hexamer peptide affinity resin [J].Journal of Chromatography A, 2012, 1260 (20): 61-66.

[51] BILLAKANTI J M, FEE C J, NAIK A DApplication of peptide chromatography for the isolation of antibodies from bovine skim milk, acid whey and colostrum [J].Food & Bioproducts Processing, 2014, 92 (2): 199-207.

[52] 黃波. 抗體親和肽配基的理性設(shè)計和色譜表征 [D].天津：天津大學(xué), 2011: 4-18.
HUANG B. Rational design of affinity peptide ligands for antibody and chromatographic characterizations [D]. Tianjin: Tianjin University, 2011: 4-18

[53] CWIRLA S E, PETERS E A, BARRETT R WPeptides on phage: a vast library of peptides for identifying ligands [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1990, 87 (16): 6378-6382.

[54] HUANG P Y, BAUMBACH G A, DADD C AAffinity purification of von Willebrand factor using ligands derived from peptide libraries [J].Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4 (5): 699-708.

[55] GASKIN D, STARCK K, TURNER N APhage display combinatorial libraries of short peptides: ligand selection for protein purification [J].Enzyme & Microbial Technology, 2001, 28 (9/10): 766-772.

[56] EHRLICH G K, BAILON P. Identification of model peptides as affinity ligands for the purification of humanized monoclonal antibodies by means of phage display [J].Journal of Biochemical & Biophysical Methods, 2001, 49 (1/2/3): 443-454.

[57] FENG H Q, JIA L Y, LI H LScreening and chromatographic assessing of a novel IgG biomimetic ligand [J].Biomedical Chromatography, 2006, 20 (10): 1109-1115.

[58] LIU F F, WANG T, DONG X YRational design of affinity peptide ligand by flexible docking simulation [J].Journal of Chromatography A, 2007, 1146 (1): 41-50.

[59] AGHAEE E, GHASEMI J B, MANOUCHEHRI FCombined docking, molecular dynamics simulations and spectroscopic studies for the rational design of a dipeptide ligand for affinity chromatography separation of human serum albumin [J].Journal of Molecular Modeling, 2014, 20 (10): 1-13.

[60] GHOSE S, HUBBARD B,CRAMER S M. Evaluation and comparison of alternatives to protein A chromatography mimetic and hydrophobic charge induction chromatographic stationary phases [J].Journal of Chromatography A, 2006, 1122 (1/2): 144-152.

[61] CHHATRE S, FRANCIS R, TITCHENER-HOOKER N JEvaluation of a novel agarose-based synthetic ligand adsorbent for the recovery of antibodies from ovine serum [J].Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical & Life Sciences, 2007, 860 (2): 209-217.

[62] ZAMOLO L, SALVALAGLIO M, CAVALLOTTI CExperimental and theoretical investigation of effect of spacer arm and support matrix of synthetic affinity chromatographic materials for the purification of monoclonal antibodies [J].Journal of Physical Chemistry B, 2010, 114 (29): 9367-9380.

[63] KABIR S. Immunoglobulin purification by affinity chromatography using protein A mimetic ligands prepared by combinatorial chemical synthesis [J].Immunological Investigations, 2002, 31 (3/4): 263-278.

[64] BRANCO R J F, DIAS A M G C,ROQUE A C A. Understanding the molecular recognition between antibody fragments and protein A biomimetic ligand [J].Journal of Chromatography A, 2012, 1244 (12): 106-115.

[65] SANTANA S D F, DHADGE V L,ROQUE A C A. Dextran-coated magnetic supports modified with a biomimetic ligand for IgG purification [J].ACS Applied Materials & Interfaces, 2012, 4 (11): 5907-5914.

[66] PADILLA S, ALVAREZ T, FERRO WAssessment of synthetic protein-A mabsorbents in antibody purification from tobacco plant extract [J].Chromatographia, 2010, 72 (1/2): 121-125.

[67] BARROSO T, LOUREN O A, ARA JO MA green approach toward antibody purification: a sustainable biomimetic ligand for direct immobilization on (bio)polymeric supports [J]. Journal of Molecular Recognition, 2013, 26 (12): 662-671.

[68] BARROSO T, BRANCO R J F, AGUIAR-RICARDO AStructural evaluation of an alternative protein A biomimetic ligand for antibody purification [J].Journal of Computer-Aided Molecular Design, 2014, 28 (1): 25-34.

[69] FASSINA G, VERDOLIVA A, ODIERNA M RProtein A mimetic peptide ligand for affinity purification of antibodies [J].Journal of Molecular Recognition, 1996, 9 (5/6): 564-569.

[70] FASSINA G, RUVO M, PALOMBO GNovel ligands for the affinity-chromatographic purification of antibodies [J].Journal of Biochemical & Biophysical Methods, 2001, 49 (1/2/3): 481-490.

[71] FASSINA G, VERDOLIVA A, PALOMBO GImmunoglobulin specificity of TG19318: a novel synthetic ligand for antibody affinity purification [J].Journal of Molecular Recognition, 1998, 11 (1-6): 128-133.

[72] PALOMBO G, FALCO S D, TORTORA MA synthetic ligand for IgA affinity purification [J].Journal of Molecular Recognition, 1998, 11 (1-6): 243-246.

[73] PALOMBO G, ROSSI M, CASSANI GAffinity purification of mouse monoclonal IgG using a protein A mimetic ligand (TG19318) immobilized on solid supports [J].Journal of Molecular Recognition, 1998, 11 (1-6): 247-249.

[74] PALOMBO G, VERDOLIVA A,FASSINA G. Affinity purification of immunoglobulin M using a novel synthetic ligand [J].Journal of Chromatography B Biomedical Sciences & Applications, 1998, 715 (1): 137-145.

[75] VERDOLIVA A, PANNONE F, ROSSI MAffinity purification of polyclonal antibodies using a new all-D synthetic peptide ligand: comparison with protein A and protein G [J].Journal of Immunological Methods, 2002, 271 (271): 77-88.

[76] SUGITA T, KATAYAMA M, OKOCHI MScreening of peptide ligands that bind to the Fc region of IgG using peptide array and its application to affinity purification of antibody [J].Biochemical Engineering Journal, 2013, 79 (2): 33-40.

[77] ZHAO W W, LIU F F, SHI Q HOctapeptide-based affinity chromatography of human immunoglobulin G: comparisons of three different ligands [J].Journal of Chromatography A, 2014, 1359: 100-111.

[78] ZHAO W W, SHI Q H,YAN S. Fywhclde-based affinity chromatography of IgG: effect of ligand density and purifications of human IgG and monoclonal antibody [J].Journal of Chromatography A, 2014, 1355: 107-114.

[79] ZHAO W W, SHI Q H,YAN S. Dual-ligand affinity systems with octapeptide ligands for affinity chromatography of hIgG and monoclonal antibody [J].Journal of Chromatography A, 2014, 1369: 64-72.

[80] STEFANO M, MAHMUD H, AMITH D NmRNA display selection and solid-phase synthesis of Fc-binding cyclic peptide affinity ligands [J].Biotechnology & Bioengineering, 2013, 110 (3): 857-870.

Affinity biomimetic chromatography and its applications for antibody purification

LU Huili, LIN Dongqiang, YAO Shanjing

(Key Laboratory of Biomass Chemical Engineering of Ministry of Education, College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, Zhejiang, China)

Affinity biomimetic chromatography is a novel bioseparation technology for the biological active substance, particularly showing good performance for antibody purification with the advantages of low cost, stable ligand structure, high specificity and so on. The critical point of affinity biomimetic chromatography is the specially-designed biomimetic ligand. The biomimetic ligands used currently include chemical synthetic ligand and short peptide ligand, which are normally obtained by rational design and screening. For a particular target protein, instead of selecting the ligand randomly, it is necessary to build a reasonable ligand library by rational designing method and screen the suitable mimetic ligand by high-throughput screening technology. According to the recent advances in affinity biomimetic chromatography, the designing and screening of ligands used for affinity mimetic chromatography and the applications in antibody purification are reviewed in the present article.

affinity biomimetic chromatography; chemical synthetic ligand; short peptide ligand; antibody; purification; molecular simulation

supported by the National Natural Science Foundation of China(21576233, 21276228).

2016-02-24.

Prof. YAO Shanjing, yaosj@zju.edu.cn

TQ 028

A

0438—1157（2016）09—3523—13

10.11949/j.issn.0438-1157.20160203

國家自然科學(xué)基金項目（21576233，21276228）。

2016-02-24收到初稿，2016-04-28收到修改稿。

聯(lián)系人：姚善涇。第一作者：盧慧麗(1986—)，女，博士后。