施 偉，李明昊，欒浩飛，韓得滿

（臺(tái)州學(xué)院 醫(yī)藥化工與材料工程學(xué)院，浙江 臺(tái)州 318000）

0 引言

混合模式層析（mixed-mode chromatography，MMC），作為近年來日益受到關(guān)注的新型層析模式，擁有獨(dú)特的多模式吸附原理，配基兼有多種功能基團(tuán)，因而吸附容量高，選擇性較好，并具有pH依賴性以及耐鹽吸附等特色，可以避免對(duì)料液進(jìn)行稀釋及加鹽處理［1-4］。如典型的混合模式配基，4-巰乙基吡啶（MEP）［5］，2-巰基-1-甲基咪唑（MMI）［6］、2-巰基苯并咪唑（MBI）［7］，5-氨基苯并咪唑（ABI）［8］等，在pH中性條件下，配基中的疏水基團(tuán)可以通過疏水作用結(jié)合蛋白；當(dāng)pH下降至配基的pKa以下時(shí)，配基與蛋白同時(shí)攜帶正電荷，兩者通過靜電排斥作用實(shí)現(xiàn)解吸。近年來的研究證明了混合模式層析擁有良好的蛋白分離應(yīng)用潛力［1，2］。因此，對(duì)于混合模式層析的深入研究可以促進(jìn)新配基的開發(fā)與分離過程的優(yōu)化。配基密度是評(píng)價(jià)層析介質(zhì)的重要指標(biāo)，但對(duì)于混合模式配基密度的影響研究仍顯不足，阻礙了混合模式層析的進(jìn)一步發(fā)展。

配基密度對(duì)于層析介質(zhì)吸附容量與吸附速率都有重要影響，許多研究者對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)研究［9-12］。如Fang Cheng等人［9］提出一種基于二乙烯砜的新型介質(zhì)活化方法，通過控制反應(yīng)時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了MEP配基密度的可控制備，他們證實(shí)高的配基密度可以提升介質(zhì)對(duì)抗體（IgG）的親和力及動(dòng)態(tài)吸附能力。Hong-Fei Tong等人［5］則利用分子模擬技術(shù)從分子層面研究了抗體，抗體片段與MEP配基網(wǎng)絡(luò)之間的作用力，結(jié)果表明配基密度對(duì)吸附產(chǎn)生了顯著的影響，高配基密度提供了更高的結(jié)合能，有利于蛋白吸附。還有Hui-Li Lu 等人［6］以 MMI為對(duì)象，制備了配基密度范圍 50 μmol/g～110 μmol/g 的介質(zhì)，結(jié)果顯示了100 μmol/g的介質(zhì)具有最高的吸附選擇性，意味著配基密度存在一個(gè)最佳范圍。對(duì)于其他模式的層析技術(shù)，如離子交換層析，反相層析等，也有相關(guān)研究［13-16］表明在一定范圍內(nèi)，更高的配基密度有利于吸附容量與吸附速率的提升。

本研究中，將選用新型混合模式配基色胺（Tryptamine）作為對(duì)象。色胺作為新近受到關(guān)注的一種配基，被發(fā)現(xiàn)在蛋白純化中擁有較大的潛力，特別對(duì)于血清白蛋白有較好的效果［17］。但對(duì)于色胺配基密度的影響仍然缺乏系統(tǒng)的研究，使得在色胺介質(zhì)制備過程中存在一定盲目性，阻礙了其研究和應(yīng)用的進(jìn)一步開展。為此，本研究通過控制介質(zhì)制備過程中的偶聯(lián)程度，制備一系列不同配基密度的混合模式介質(zhì)（4FF-Try），以更加多樣的實(shí)驗(yàn)手段，包括傅里葉紅外光譜（FTIR），掃描電鏡（SEM）和氮?dú)馕?脫附實(shí)驗(yàn)（BET），對(duì)介質(zhì)進(jìn)行了表征，研究了配基密度對(duì)于介質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響，并使用牛血清白蛋白（BSA）作為模型蛋白，通過靜態(tài)吸附與吸附動(dòng)力學(xué)考察pH和鹽對(duì)于不同配基密度介質(zhì)吸附性能的影響，加深配基密度在層析介質(zhì)吸附中的研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

色胺（Tryptamine）：J&K 科技有限公司（中國(guó)）；4%交聯(lián)瓊脂糖包埋石英砂（4 Fast Flow，4FF）：博格隆(上海)生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白（BSA，67 KDa）：美國(guó)Sigma有限公司；其他為市售分析純級(jí)別試劑。

傅里葉變換紅外光譜測(cè)量（FTIR）：Nicolet 5700（賽默飛世爾科技）；紫外光譜測(cè)量：UV-2450（日本島津公司）；電鏡掃描（SEM）：日立S-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡；氮吸附-脫附等溫線測(cè)量（BET）：GEMINI-V。

1.2 介質(zhì)制備及配基密度測(cè)定

色胺混合模式層析介質(zhì)制備流程參考文獻(xiàn)［17，18］，并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)，原理如圖1所示。4%交聯(lián)瓊脂糖介質(zhì) 4FF清洗抽干，取 2 g，與 NaOH，烯丙基溴（Allyl Bromide，AB）及 20%二甲基亞砜（Dimethyl Sulphoxide，DMSO）混合，置于30℃，150 rpm條件下進(jìn)行活化反應(yīng)24 h?；罨蠼橘|(zhì)清洗，以三倍活化密度N-溴代琥珀酰亞胺（N-bromosuccinimide，NBS）進(jìn)行溴化。之后加入2 mL 1 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH11.5）及不同量（0.4，0.6，0.8及 1 g）的配基。150 rpm，30℃偶聯(lián)反應(yīng) 24 h。反應(yīng)結(jié)束，介質(zhì)進(jìn)行充分清洗，存于20%乙醇（V/V）中備用。該介質(zhì)命名為4FF-Try。

圖1 4FF-Try介質(zhì)制備原理圖Fig.1 Preparation scheme for 4FF-Try resins

配基密度測(cè)定：4FF-Try用去離子水進(jìn)行充分清洗，再用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH浸泡清洗3遍，最后清洗抽干后稱取1 g介質(zhì)，與5 mL 0.5 mol/L NaCl溶液混合，用0.1 mol/L HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定。計(jì)算配基偶聯(lián)密度。

1.3 介質(zhì)表征與濃度測(cè)定

對(duì)基質(zhì)4FF和介質(zhì)4FF-Try進(jìn)行傅里葉紅外光譜測(cè)定，檢測(cè)偶聯(lián)前后瓊脂糖微球成分變化，證實(shí)制備成功與否。利用掃描電鏡對(duì)介質(zhì)進(jìn)行觀察，表征4FF-Try形態(tài)與表面結(jié)構(gòu)。通過氮?dú)馕?脫附實(shí)驗(yàn)測(cè)定介質(zhì)表面積，孔道體積以及孔道直徑。蛋白濃度檢測(cè)通過紫外光譜測(cè)定獲得。

1.4 靜態(tài)吸附平衡

靜態(tài)吸附平衡實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)［19］。配制pH范圍為5.0～8.0的緩沖液：pH4.0和pH5.0為20 mmol/L乙酸鈉緩沖液；pH6.0、pH7.0和pH8.0為20 mmol/L磷酸鈉緩沖液。介質(zhì)清洗抽干分別稱取0.04 g放入若干2 mL離心管。BSA溶于不同pH的緩沖液中，配制濃度范圍為0.25 mg/mL～4 mg/mL的蛋白溶液，各取1.8 mL與介質(zhì)混合，并置于恒溫混勻儀中，1000 rpm、25℃平衡吸附3 h。達(dá)到吸附平衡后，取上清，測(cè)定吸光度（280nm），計(jì)算蛋白濃度。計(jì)算依據(jù)物料平衡原理，公式如下：

式中：Q*為單位體積介質(zhì)的吸附容量（mg/g介質(zhì)），C0為蛋白初始濃度（mg/mL），C*為平衡時(shí)蛋白濃度（mg/mL），V 為蛋白溶液體積（mL），m 為介質(zhì)質(zhì)量（g），ρp為介質(zhì)濕真密度（mg/mL）。

吸附等溫線，采用Langmuir吸附平衡方程進(jìn)行擬合，公式如下：

式中：Qm為飽和吸附容量（mg/g介質(zhì)），Kd為解離常數(shù)（mg/mL），C*為吸附平衡時(shí)蛋白濃度（mg/mL）。

緩沖液加入不同濃度NaCl（0.2 mol/L，0.4 mol/L和0.8 mol/L），采用上述方法測(cè)定并擬合吸附等溫線，考察鹽對(duì)蛋白靜態(tài)吸附的影響。

1.5 吸附動(dòng)力學(xué)

介質(zhì)清洗抽干分別稱取0.04 g放入一系列2 mL離心管。將BSA溶于緩沖液中，配制濃度為4 mg/mL的蛋白溶液，取1.8 mL與介質(zhì)混合，并置于恒溫混勻儀中，1000 rpm，25℃進(jìn)行吸附。每隔一定時(shí)間，過濾，終止吸附，測(cè)定蛋白溶液吸光度（280 nm），計(jì)算蛋白濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 介質(zhì)表征

如圖2紅外光譜圖所示，4FF-Try上出現(xiàn)740 cm-1左右的特征峰，該峰由N-H振動(dòng)產(chǎn)生，是由色胺引入介質(zhì)中，而基質(zhì)4FF上則無此峰存在，證明配基已被偶聯(lián)在4FF基質(zhì)上，新型混合模式介質(zhì)4FFTry制備成功。改變配基加入量，制備4種不同配基密度的4FF-Try。配基密度隨配基加入量變化如圖3所示，獲得配基密度分別為 40±3，62±3，79±4 及 110±5 μmol/g 介質(zhì)。與報(bào)道的文獻(xiàn)相比［17］，在所制備的配基密度范圍內(nèi)，配基密度隨著配基加入量的增加同樣呈線性增加，但本研究中配基密度范圍更大，具有更好的代表性。依次命名 4 種介質(zhì)為 4FF-try（40），4FF-try（60），4FF-try（80）及 4FF-try（110）。

圖2 4FF與4FF-Try紅外光譜圖Fig.2 FTIR of 4FF,4FF-Try

圖3 色胺配基密度隨色胺用量的變化Fig.3 Effects of ligand addition on ligand density

圖4 為4種介質(zhì)的電鏡掃描圖，如圖所示，配基密度的不同并未對(duì)介質(zhì)形態(tài)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響，4種介質(zhì)表面皆光滑平整，孔道結(jié)構(gòu)清晰。進(jìn)一步通過氮?dú)馕?脫附實(shí)驗(yàn)對(duì)介質(zhì)的表面積與孔道參數(shù)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖5所示。4種介質(zhì)在表面積，孔道體積與孔道直徑方面表現(xiàn)相似，測(cè)定的范圍分別為146.2 m2/g～161.9 m2/g，0.93 m3/g～1.11 m3/g及21.5 nm～26.0 nm，進(jìn)一步表明配基密度對(duì)介質(zhì)形態(tài)結(jié)構(gòu)影響較小。

圖 4 4FF-Try（40）（A），4FF-Try（60）（B），4FF-Try（80）（C）及 4FF-Try（110）（D）掃描電鏡圖Fig.4 SEM images（5μm） of 4FF-Try（40）（A）,4FF-Try（60）（B）,4FF-Try（80）（C）and 4FF-Try（110）（D）

圖 5 4FF-Try（40），4FF-Try（60），4FF-Try（80）及 4FF-Try（110）氮?dú)馕?脫附圖（A）及相關(guān)參數(shù)（B）Fig.5 Nitrogen adsorption desorption isotherms（A） and relative parameters（B） of 4FF-Try（40）,4FF-Try（60）,4FF-Try（80） and 4FF-Try（110）

2.2 吸附等溫曲線

以BSA作為模型蛋白，首先考察不同pH條件下4種不同配基密度介質(zhì)的靜態(tài)吸附性能，并以Langmuir擬合數(shù)據(jù)。從圖6可見，pH對(duì)介質(zhì)吸附BSA產(chǎn)生了顯著影響，呈現(xiàn)典型的pH依賴性。pH 4.0條件下，因配基與BSA同時(shí)帶有正電荷，產(chǎn)生靜電斥力，4種介質(zhì)的蛋白吸附量極小，無法進(jìn)行擬合。pH5.0～8.0條件下，Langmuir擬合良好，可獲得飽和吸附容量Qm及解離常數(shù)Kd。其中pH5.0位于BSA等電點(diǎn)附近，蛋白疏水區(qū)域大量暴露，產(chǎn)生疏水作用力，因此擁有更大的Qm及更小的Kd。但隨著pH值增加，配基與蛋白間疏水作用力逐漸下降，致使吸附等溫線變得平坦，難以在所處濃度范圍達(dá)到“飽和平臺(tái)期”，繼續(xù)采用Qm對(duì)不同pH及不同配基密度介質(zhì)的吸附容量進(jìn)行比較并不合適。因此引入蛋白吸附密度（Qc）概念［20-22］，即根據(jù)Langmuir擬合計(jì)算獲得的特定蛋白平衡濃度下的介質(zhì)吸附容量。在本研究中，選擇4 mg/mL作為比較濃度，結(jié)果顯示于表1。從表中數(shù)據(jù)可知，4個(gè)配基密度的介質(zhì)在所測(cè)pH范圍內(nèi)的吸附密度Qc都呈現(xiàn)“U”型變化，即pH4.0吸附密度最小，pH5.0最大，之后隨pH增加逐漸減小。橫向比較吸附密度隨配基密度變化情況，同樣發(fā)現(xiàn)“U”型趨勢(shì)。即配基密度在80 μmol/g以下時(shí)，隨著配基密度增加，介質(zhì)對(duì)BSA吸附能力逐漸增強(qiáng)。但當(dāng)配基密度繼續(xù)增大到110 μmol/g時(shí)，Qc反而減小。推測(cè)原因可能為過多的配基造成了空間位阻效應(yīng)，使BSA的擴(kuò)散與吸附變得困難。與文獻(xiàn)相比，Wu等人［17］所制備的色胺介質(zhì)（約150 μmol/g）對(duì)人血清白蛋白擁有141.33 mg/g的吸附容量。本研究則以80 μmol/g的配基密度實(shí)現(xiàn)了74.5 mg/g的吸附容量，兩者單位配基密度所實(shí)現(xiàn)的吸附容量相近。解離常數(shù)Kd的變化也符合不同pH以及不同配基密度的變化趨勢(shì)。即pH5.0時(shí)Kd最小，高于或低于此pH值，Kd發(fā)生增加，蛋白與介質(zhì)之間的親和力減少。另外，隨著配基密度的增加，Kd逐漸減小，直至80 μmol/g，之后發(fā)生增加。說明過高的配基密度會(huì)減小蛋白與介質(zhì)之間的親和力。從目前所得數(shù)據(jù)可知，4FF-Try的最佳配基密度范圍在60 μmol/g～80 μmol/g，介質(zhì)制備可參考此范圍。此外，使用最佳配基密度范圍進(jìn)行介質(zhì)制備也減少了過高的配基加入量導(dǎo)致的成本升高。

圖 6 4FF-Try（40）（a），4FF-Try（60）（b），4FF-Try（80）（c）及 4FF-Try（110）（d）在不同 pH 下吸附等溫線Fig.6 Adsorption isotherms of BSA on 4FF-Try（40）（a）,4FF-Try（60）（b）,4FF-Try（80）（c）and 4FF-Try（110）（d） at different pH values

表14 FF-Try（40），4FF-Try（60），4FF-Try（80）及4FF-Try（110）在4 mg/mL平衡濃度下的蛋白吸附密度Qc（pH4.0～8.0）Table.1 The QcSof of BSA on 4FF-Try（40）,4FF-Try（60）,4FF-Try（80） and 4FF-Try（110）at the equilibrium liquid-phase concentration of 4 mg/mL（pH 4.0～8.0）.

耐鹽性吸附是混合模式層析的一個(gè)優(yōu)勢(shì)，因此在本研究中也考察了鹽的濃度對(duì)不同配基密度介質(zhì)吸附的影響。本研究中選擇中性鹽NaCl進(jìn)行添加，濃度設(shè)為0.2 mol/L，0.4 mol/L和0.8 mol/L。結(jié)果如圖7和表2所示。從圖7可見，不同鹽濃度下的吸附等溫?cái)?shù)據(jù)仍能通過Langmuir進(jìn)行良好的擬合，但其“飽和平臺(tái)期”更加難以實(shí)現(xiàn)，因此仍然使用蛋白吸附密度Qc進(jìn)行比較。從表2數(shù)據(jù)可知，4種配基密度的4FF-Try都保持了良好的耐鹽吸附能力，即使鹽濃度高達(dá)0.8 mol/L，仍然具有一定程度的Qc。值得注意的是，隨著配基密度增加，介質(zhì)對(duì)蛋白的Qc下降趨勢(shì)減緩，意味著更高的配基密度范圍對(duì)鹽濃度的耐受能力更大。原因可能在于更高的配基密度提供了更多的蛋白結(jié)合位點(diǎn)。此外，與無鹽條件吸附相比，加鹽后4種介質(zhì)的Kd急劇增加，可能是由于大量鹽的存在屏蔽了配基與蛋白之間的氫鍵作用，使蛋白與介質(zhì)間的親和力下降，只能以較慢的速率進(jìn)行吸附。

圖 7 4FF-Try（40），4FF-Try（60），4FF-Try（80）及 4FF-Try（110）在不同鹽濃度 0.2M（a），0.4M（b）及 0.8M（c）條件下吸附等溫線Fig.7 Adsorption isotherms of BSA on 4FF-Try（40）,4FF-Try（60）,4FF-Try（80） and 4FF-Try（110） at different NaCl concentration （0.2 M（a），0.4 M（b）and 0.8 M（c））

表 2 4FF-Try（40），4FF-Try（60），4FF-Try（80）及 4FF-Try（110）在 4mg/mL 平衡濃度下的蛋白吸附密度Qc（NaCl 0.2～0.8 mol/L）Table.2 The QcSof of BSA on 4FF-Try（40）,4FF-Try（60）,4FF-Try（80） and 4FF-Try（110）at the equilibrium liquid-phase concentration of 4 mg/mL（NaCl 0.2～0.8 mol/L）

2.3 吸附動(dòng)力學(xué)

圖8顯示了不同配基密度的4FF-Try在pH 5.0及0 mol/L NaCl條件下的吸附動(dòng)力學(xué)。從圖中可知，4FFTry（40）達(dá)到吸附平衡的速率最快，在10 min左右，該介質(zhì)的吸附即趨于平衡。隨著配基密度的增加，吸附平衡達(dá)到時(shí)間發(fā)生延遲，大約增加到20 min左右。分析原因，可能是配基密度的增加，降低了蛋白在介質(zhì)孔道中的擴(kuò)散速率，因此介質(zhì)制備時(shí)，最佳配基密度的選擇應(yīng)該充分考慮吸附速率與吸附容量之間的關(guān)系。

圖 8 4FF-Try（40），4FF-Try（60），4FF-Try（80）及 4FF-Try（110）吸附動(dòng)力學(xué)Fig.8 Adsorption kinetics curves of BSA on 4FF-Try（40）,4FF-Try（60）,4FF-Try（80） and 4FF-Try（110）

3 結(jié)論

本研究中以色胺為配基，制備了一系列不同配基密度的新型混合模式介質(zhì)4FF-Try。通過FTIR，SEM及BET對(duì)所制備介質(zhì)的成分與結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，證明4FF-Try制備成功，擁有良好的孔道結(jié)構(gòu)，并且配基密度的高低并未對(duì)介質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響。靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)表明存在最佳配基密度范圍，小于此密度，吸附性能隨配基密度增加而增加；高于此密度則會(huì)由于空間位阻效應(yīng)，產(chǎn)生吸附性能下降。4種介質(zhì)保持了良好的耐鹽吸附能力，耐鹽能力隨配基密度增加，有一定程度提升。吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明高配基密度有利于吸附容量提升但高于一定范圍后會(huì)顯著影響吸附速率。基于以上結(jié)果，本研究證明新型混合模式介質(zhì)介質(zhì)4FF-Try制備過程中存在一個(gè)最佳配基密度范圍（60 μmol/g～80 μmol/g），在介質(zhì)制備與分離過程優(yōu)化中應(yīng)予以充分考慮。通過本研究，對(duì)于新型混合模式介質(zhì)——色胺介質(zhì)的制備與性能有了進(jìn)一步的了解，有助于于混合模式層析的進(jìn)一步發(fā)展。