響應面法優(yōu)化合浦珠母貝糖胺聚糖提取工藝

周小雙，王錦旭，楊賢慶*，林婉玲，魏涯

1(中國水產科學研究院 南海水產研究所，農業(yè)部水產品加工重點實驗室，國家水產品加工技術研發(fā)中心，廣東 廣州，510300) 2(上海海洋大學食品學院，上海，201306)

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響應面法優(yōu)化合浦珠母貝糖胺聚糖提取工藝

周小雙1, 2，王錦旭1，楊賢慶1*，林婉玲1，魏涯1

1(中國水產科學研究院 南海水產研究所，農業(yè)部水產品加工重點實驗室，國家水產品加工技術研發(fā)中心，廣東 廣州，510300) 2(上海海洋大學食品學院，上海，201306)

以合浦珠母貝全臟器為原材料，經解凍勻漿和熱水浸提后，采用枯草桿菌中性蛋白酶和胰蛋白酶雙酶酶解，sevage法除蛋白2次，清液醇沉得糖胺聚糖粗制品(GAG)，粗制品經DEAE-52離子交換柱純化后得精制品。在單因素試驗基礎上，以粗制品得率與糖胺聚糖含量的乘積Y/(×10-4)為響應值，加酶量、液料比、酶解時間為影響因子，利用響應面試驗分析法優(yōu)化GAG的粗提工藝，得最佳提取工藝：加酶量為1.14%(枯草桿菌中性蛋白酶與胰酶質量的比為7∶8)；液料比為3∶1(mL∶g)酶解時間為4.1 h。在此條件下，糖胺聚糖粗制品得率為0.518%，糖胺聚糖含量為10.9%，經DEAE-52柱純化后的糖胺聚糖含量為89%。

合浦珠母貝；糖胺聚糖；響應面法

合浦珠母貝(Pinctadamartensii)，又稱馬氏珠母貝，雙殼綱，珍珠貝科。1965年我國成功開展其人工育苗，自此海水珍珠養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展[1]，在我國南方沿海海域均有分布。近幾年對于合浦珠母貝的研究主要是遺傳育種、珍珠層結構、插核育珠等[2]，而針對軟體部貝肉的研究不多。目前，合浦珠母貝貝肉年產量達2 000 t以上，大多用作食材或飼料，利用率不高，亟待高值化開發(fā)利用，具有良好的應用前景。

糖胺聚糖(glycosaminoglycans，GAGs)，又名氨基多糖、酸性黏多糖，是蛋白聚糖整體分子結構中的“含糖片段”，其二糖單位為氨基己糖和己糖醛酸?，F(xiàn)今確定的糖胺聚糖結構共7種，即硫酸軟骨素C (CSC)、硫酸軟骨素A (CSA)、透明質酸(HA)、硫酸皮膚素(DS)、硫酸角質素(KS)、肝素(HP)及硫酸乙酰肝素(HS)。研究表明，海洋貝類肉中糖胺聚糖具有多種生物活性，如增強免疫[3]、保濕作用[4]、抗腫瘤[5]、降血脂[6]、抗氧化[7]等活性，已有學者對翡翠貽貝[3]、近江牡蠣[6]、波紋巴非蛤[8]、四角蛤蜊[9]等多種貝類糖胺聚糖的分離純化和理化性質進行了探討。

響應面法是一種確定最佳提取條件的簡單有效方法，計算機能夠生成非線性二次式模型[10-11]，包括中心復合設計和一個二階多項式方程，來確定不同變量對響應值影響的顯著性[12]。本文在前期研究的基礎上[13]，利用響應面法優(yōu)化合浦珠母貝肉中糖胺聚糖提取的工藝條件。

1　材料與方法

1.1原材料與試劑

合浦珠母貝貝肉全臟器，購自廣東省徐聞縣，貝肉取出后-18 ℃冷凍備用。

枯草桿菌中性蛋白酶(酶活力100 U/mg)、胰蛋白酶(酶活力250 U/mg)、木瓜蛋白酶(酶活力800 U/mg)，購自廣州齊云生物技術有限公司；肝素鈉(效價150 U/mg)、1,9-二甲基亞甲基藍，購自Sigma；硫酸軟骨素鈉，購自中國食品藥品檢定研究院；甘氨酸、NaCl、NaAc、三氯甲烷、正丁醇、無水乙醇均為分析純。

1.2儀器設備

高速組織搗碎機；小型切向流超濾系統(tǒng)，美國MILLIPORE；pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)公司；Milli-Q超純水機，美國MILLIPORE；J26XP高速離心機，美國貝克曼庫特；紫外可見分光光度計，日本SHIMADZU；Alpha1-4冷凍干燥機，德國Christ；隔膜真空泵(GM- 0.33B)；TLJ-2型定時增力電動攪拌器，姜堰市天力醫(yī)療器械有限公司；HWS24電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；CBS-B程控多功能全自動部份收集器和BT-100SD定時電腦泵，上海青浦滬西儀器廠。

1.3實驗方法

1.3.1粗提工藝

合浦珠母貝全臟器→解凍→加水勻漿→熱水浸提→酶解→煮沸滅酶→10 000 r/min離心10 min，sevage法除蛋白→清液調pH值至7.0，體積分數65%乙醇4 ℃醇沉24 h→離心分離沉淀→無水乙醇和丙酮洗滌→冷凍干燥得GAG粗制品

1.3.2含量測定

糖胺聚糖的含量測定采用1,9-二甲基亞甲基藍法[14]。

1.3.3酶量比例選擇

以合浦珠母貝全臟器為原料，經解凍勻漿、熱水浸提后分別按質量分數0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%枯草桿菌中性蛋白酶和0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%胰蛋白酶的比例，在50 ℃、pH 7.5～7.7的條件下分別進行4 h單酶水解和雙酶酶解，酶解液經sevage法除蛋白兩次后醇沉的GAG粗制品，以粗制品得率與糖胺聚糖含量的乘積Y/(×10-4)作為指標，選擇出最佳酶量比例。

1.3.4合浦珠母貝肉中糖胺聚糖提取工藝的單因素試驗

選取對粗制品得率與糖胺聚糖含量有影響的3個因素，即加酶量、液料比、酶解時間，按照1.3.1提取合浦珠母貝肉中糖胺聚糖，以粗制品得率與糖胺聚糖含量的乘積Y/(×10-4)作為指標進行考察。

1.3.5響應面法優(yōu)化合浦珠母貝肉中糖胺聚糖提取工藝

綜合單因素試驗結果，根據Box-Benhken的中心組合試驗設計原理，本實驗選取加酶量A、液料比B、酶解時間C作為3因素進行編碼，糖胺聚糖粗制品得率與糖胺聚糖含量的乘積Y/(×10-4)為響應值，實驗因子和水平設計如表1。

表1　響應面分析因子及水平表

1.3.6精制工藝

取1.0 g GAG粗制品溶解于250 mL NaAc緩沖溶液(pH 6.0)后，上樣至DEAE-52離子交換色譜柱，采用0.5 mol/L NaAc緩沖液(pH 6.0)和1.5 mol/L NaCl各100 mL分別進行洗脫分離，以5 mL/管收集洗脫液后，以1,9-二甲基亞甲基藍法測定各管樣品中糖胺聚糖的含量，合并相同組分，將不同峰段組分分別進行超濾除鹽、凍干后儲存?zhèn)溆谩?/p>

2　結果與分析

2.1酶量比例選擇

如圖1和圖2所示，經單酶水解的結果表明，糖胺聚糖粗制品得率與含量的乘積Y隨加酶量的增加提高顯著，但當加酶量高于0.7%枯草桿菌蛋白酶和0.8%胰蛋白酶時有下降趨勢，故枯草桿菌蛋白酶和胰蛋白酶的最適加酶量分別為0.7%和0.8%。

圖1　枯草桿菌中性蛋白酶水解結果Fig.1　Effect of enzyme dosage on the enzymatic hydrolysis by neutral protease of Bacillus subtilis

圖2　胰蛋白酶酶解結果Fig.2　Effect of enzyme dosage on the enzymatic hydrolysis by pancreatin

隨后進一步確定枯草桿菌中性蛋白酶與胰蛋白酶的雙酶最佳比例，結果見表2。經綜合考慮粗制品得率、GAG含量及其乘積Y/(×10-4)3項指標，確定最佳酶量比例為7∶8(g∶g)。

表2　枯草桿菌中性蛋白酶與胰蛋白酶不同酶比例水解結果比較

注：酶解條件為總加酶量1.5%、pH 7.5～7.7、50 ℃酶解4 h。

2.2單因素試驗及其分析

2.2.1酶解時間對糖胺聚糖粗制品得率與含量的影響

取50 g合浦珠母貝全臟器勻漿后，加入150 mL蒸餾水55 ℃熱水浸提5 h后，加入質量分數1.5%的雙酶(枯草桿菌中性蛋白酶與胰酶的質量比為7∶8)，調節(jié)pH值至7.5～7.7，在50 ℃下分別酶解1、2、3、4、5 h。酶解后煮沸滅酶，離心去除雜質，sevage法除蛋白2次，調節(jié)pH值至7.0后加入無水乙醇至乙醇體積分數65%醇沉12 h，離心得沉淀，冷凍干燥后得糖胺聚糖粗制品，以Y/(×10-4)為指標。結果如圖3所示，可知Y值隨酶解時間的增加呈先增后減的趨勢，在4 h處達最大值，故最適酶解時間為4 h。

圖3　酶解時間對糖胺聚糖提取的影響Fig.3　Effect of hydrolysis time on the extraction yield of glycosaminoglycans

2.2.2液料比對糖胺聚糖粗制品得率與含量的影響

取50 g合浦珠母貝全臟器勻漿后，分別按1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1(mL∶g)的液料比加入蒸餾水55 ℃熱水浸提5 h后，加入質量分數1.5%的雙酶(枯草桿菌中性蛋白酶與胰酶的質量比為7∶8)，調節(jié)pH值至7.5～7.7，在50 ℃下分別酶解4 h。酶解后煮沸滅酶，離心去除雜質，sevage法除蛋白兩次，調節(jié)pH值至7.0后加入無水乙醇至乙醇體積分數65%醇沉12 h，離心得沉淀，冷凍干燥后得糖胺聚糖粗制品，以Y/(×10-4)為指標。結果如圖4所示，隨著液料比的增大，Y值快速升高，當液料比為3∶1時Y值達最大值，而后隨著液料比的增大緩慢減小。故選取液料比為3∶1。

圖4　液料比對糖胺聚糖提取的影響Fig.4　Effect of liquid-solid ratio on the extraction yield of glycosaminoglycans

2.2.3加酶量對糖胺聚糖粗制品得率與含量的影響

取50 g合浦珠母貝全臟器勻漿后，分別按3∶1的液料比加入150 mL蒸餾水55 ℃熱水浸提5 h后，分別加入質量分數0.9%、1.2%、1.5%、1.8%、2.1%的雙酶(枯草桿菌中性蛋白酶與胰酶的質量比為7∶8)，調節(jié)pH值至7.5～7.7，在50 ℃下分別酶解4 h。酶解后煮沸滅酶，離心去除雜質，sevage法除蛋白2次，調節(jié)pH值至7.0后加入無水乙醇至乙醇體積分數65%醇沉12 h，離心得沉淀，冷凍干燥后得糖胺聚糖粗制品，以Y/(×10-4)為指標。結果如圖5所示，可知當加酶量為1.2%時Y值達最大值，而后隨著加酶量的增大Y值減小。

圖5　加酶量對糖胺聚糖提取的影響Fig.5　Effect of enzyme dosage on the extraction yield of glycosaminoglycans

2.3響應面試驗結果與分析

在單因素試驗的基礎上，根據Box-Benhken的中心組合試驗設計原理，選取加酶量A、液料比B、酶解時間C作為三因素，并以糖胺聚糖粗制品得率與糖胺聚糖含量的乘積Y/(×10-4)為響應值，試驗方案及結果見表3。

運用SPSS軟件對上述結果進行整理和數據分析，回歸分析結果見表4。可以看出加酶量對合浦珠母貝肉中糖胺聚糖的提取具有極顯著的影響，液料比和酶解時間對其也有顯著影響。試驗數據經回歸擬合得回歸方程：

Y=5.65-0.34A-0.12×B+0.11C+0.47AB-0.23×AC-0.060BC-0.93A2-2.07B2-0.94C2

表3　實驗方案與結果

表4　方差分析

響應面模型的好壞要根據系數R2和方差分析來判斷[15]。方差分析結果中，模型的P值小于0.000 1，具有極顯著影響，表示該模型有效。失擬項是描述合適模型附近數據的變動情況，失擬項的值不顯著(P=0.420 8)，說明擬合的模型方程效果比較好，這種實驗方案是可行的[16]。該試驗R2=0.998 6表示水平較好，說明該模型擬合較好。同時根據F值可以判斷出3個因素對合浦珠母貝糖胺聚糖提取影響的排序為：加酶量>液料比>酶解時間。

根據回歸分析和回歸方程擬合可繪制出相應等高線和響應面分析圖，響應面三維圖形是響應值對試驗因子所構成的三維空間的曲面圖，從圖6～圖8中能夠直觀的看出各因素相互作用對響應值的影響。由于響應面圖是三維圖形，所以只能固定其中一個因素，表達其中2個因素的函數。響應面3D圖形的坡度及等高線的形狀可以反應2因子之間交互作用強弱，3D圖形的坡度越陡，等高線形狀為橢圓形則表示兩因素交互作用顯著。

圖6表示酶解時間與加酶量交互作用對糖胺聚糖提取的影響，隨著酶解時間和加酶量的增加，Y值緩慢增加后逐漸減小。圖7表示液料比與加酶量交互作用對糖胺聚糖提取的影響作用，Y值隨著液料比和加酶量的增加呈先增后減的趨勢。圖8表示液料比與酶解時間交互作用對糖胺聚糖提取的影響，隨著液料比和酶解時間的增加，Y值同樣呈先增后減的趨勢。經對比，從圖中可以看出加酶量與液料比的交互作用最為顯著。

圖6　酶解時間與加酶量交互作用對糖胺聚糖提取影響的等高線和響應面圖Fig.6　Response surface and contour plots for the effect of enzyme dosage and hydrolysis time on the extraction yield of glycosaminoglycans

圖7　液料比與加酶量交互作用對糖胺聚糖提取影響的等高線和響應面圖Fig.7　Response surface and contour plots for the effect of liquid-solid ratio and enzyme dosage on the extraction yield of glycosaminoglycans

圖8　液料比與酶解時間交互作用對糖胺聚糖提取影響的等高線和響應面圖Fig.8　Response surface and contour plots for the effect of liquid-solid ratio and hydrolysis time on the extraction yield of glycosaminoglycans

以Y值極大值為指標，經Design-Expert 8.0軟件分析可得最佳工藝條件為：加酶量1.12%(枯草桿菌中性蛋白酶與胰蛋白酶的質量比為7∶8)、液料比2.93∶1、酶解時間4.1 h，相應的響應面二次模型預測Y最大值為5.69×10-4。為了驗證本實驗響應面法的可行性，采用最佳提取工藝進行驗證實驗?？紤]到實際操作問題，選取最佳提取工藝為：加酶量1.14%(枯草桿菌中性蛋白酶與胰酶的質量比為7∶8)、液料比3∶1、酶解時間4.1 h。重復3次實驗得糖胺聚糖粗制品得率平均值為0.518%，糖胺聚糖平均含量為10.9%，故3次平行實驗得平均Y值為5.23×10-4，與理論值相差不大，說明由響應面法得出的糖胺聚糖最佳提取工藝是可行的。

2.4粗制品精制結果與分析

糖胺聚糖粗制品經DEAE-52離子交換柱純化的洗脫曲線如圖9所示，以5 mL/管收集洗脫液。1～20管收集0.5 mol/L NaAc緩沖液(pH 6.0)洗脫液，經1,9-二甲基亞甲基藍法測定無糖胺聚糖反應，可淋洗除去未吸附于離子交換填料上的雜質；21～100管收集1.5 mol/L NaCl溶液洗脫液，繪制洗脫曲線可見呈單峰，經合并相同組分測定后可得糖胺聚糖含量為89%，達到精制糖胺聚糖粗品的目的。

圖9　糖胺聚糖粗制品經DEAE-52離子交換柱純化的洗脫曲線Fig.9　Elution curve of GAG by DEAE-52 ion exchange column chromatography

3　結論

(1)本實驗通過響應面法建立3個影響因素(加酶量、液料比、酶解時間)與響應值Y/(×10-4)(糖胺聚糖粗制品得率與糖胺聚糖含量的乘積)相互作用的模型，該模型有效反映出糖胺聚糖提取的最佳工藝為：加酶量1.14%(枯草桿菌中性蛋白酶與胰酶的質量比為7∶8)、液料比3∶1(mL∶g)、酶解時間4.1 h。在此條件下進行重復試驗，合浦珠母貝全臟器中糖胺聚糖的粗制品得率為0.518%，糖胺聚糖含量為10.9%。

(2)經實驗對比等電點與sevage法2種除蛋白方法，后者的效果更好，可能因為在等電點除蛋白時的pH變化大而導致糖胺聚糖的結構破壞從而降低了糖胺聚糖的提取率。

(3)經實驗摸索，醇沉的最佳pH值為7.0，溶液呈酸性或堿性均不利于糖胺聚糖的析出。

(4)使用DEAE-52離子交換柱純化糖胺聚糖，可以有效去除殘留蛋白、色素等雜質，提高糖胺聚糖的純度，經DEAE-52柱純化后糖胺聚糖含量為89%。

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Optimization of extraction process for glycosaminoglycans fromPinctadamartensiiby response surface methodology

ZHOU Xiao-shuang1, 2, WANG Jin-xu1, YANG Xian-qing1*,LIN Wan-ling1, WEI Ya1

1(South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Aquatic Product Processing, Ministry of Agriculture, National R&D Center for Aquatic Product Processing, Guangzhou 510300, China) 2(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Glycosaminoglycans were extracted from the whole viscera ofPinctadamartensiivia enzymatic hydrolysis by pancreatin and neutral protease ofBacillussubtilis. Enzymatic hydrolysate was deproteinized twice by sevage and subsequent ethanol precipitation. The pure product of glycosaminoglycans was separated through DEAE-52 column. The product as Y/(×10-4) of the yield and the content of glycosaminoglycans was the response value. Liquid-solid ratio, enzyme dosage and enzymolysis time were impact factors. The optimum extraction conditions for glycosaminoglycans were selected by response surface. The optimal enzyme dosage were of 1.14% (the ratio of neutral protease and pancreatin at 7∶8), liquid-solid ratio 3∶1 and enzymolysis time 4.1 h. Under these conditions, the yield and content of glycosaminoglycans were of 0.518%, 10.9%, with further purification at the content of 89% through DEAE-52 column. It is feasible to optimize extraction of glycosaminoglycans fromPinctadamartensiiby response surface method, which will be great help to the research in the future.

Pinctadamartensii; glycosaminoglycans; response surface methodology

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601043

碩士研究生(楊賢慶研究員為通訊作者，E-mail:yxqgd@163.com)。

廣東省公益研究與能力建設專項(2014A020217009)；廣東省海洋漁業(yè)科技與產業(yè)發(fā)展專項科技攻關與研發(fā)項目(A201501C08)；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金項目(2014TS25)；農業(yè)部水產品加工重點實驗室開放基金項目(NYBJG201408)資助

2015-05-29，改回日期：2015-08-27