陳小平,王志旺,劉彩民△,妥海燕,王瑞瓊靖遠(yuǎn)縣中醫(yī)院,甘肅 靖遠(yuǎn) 730600;甘肅中醫(yī)藥大學(xué)
榮骨定痛膏對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠IL-1β、NO及氧自由基代謝的影響*
陳小平1,王志旺2,劉彩民1△,妥海燕2,王瑞瓊2
1靖遠(yuǎn)縣中醫(yī)院,甘肅 靖遠(yuǎn) 730600;2甘肅中醫(yī)藥大學(xué)
目的:探討榮骨定痛膏對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎模型大鼠白介素1β(IL-1β)、一氧化氮(NO)及氧自由基代謝的影響。方法:采用注射4%木瓜蛋白酶復(fù)制骨性關(guān)節(jié)炎大鼠模型,通過(guò)觀測(cè)膝關(guān)節(jié)功能,血清IL-1β、關(guān)節(jié)液NO與NOS、關(guān)節(jié)組織氧自由基代謝等指標(biāo),探討榮骨定痛膏對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎的治療作用及作用機(jī)制。結(jié)果:榮骨定痛膏可明顯減小骨性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)滑膜腫脹厚度,擴(kuò)大膝關(guān)節(jié)的活動(dòng)范圍,降低血清IL-1β、關(guān)節(jié)液NO 及NOS的水平,提高滑膜組織中SOD的活性而降低MDA的含量。結(jié)論:榮骨定痛膏對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎模型大鼠具有一定治療作用,抑制IL-1β誘導(dǎo)的NO的產(chǎn)生而發(fā)揮抗氧化、抑制滑膜細(xì)胞的凋亡是其治療骨性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制之一。
骨性關(guān)節(jié)炎;白介素1β;一氧化氮;抗氧化系統(tǒng);榮骨定痛膏
骨性關(guān)節(jié)炎是一種慢性進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)功能與結(jié)構(gòu)退行性疾病,屬臨床常見(jiàn)病,目前尚缺乏有效根治措施,作為非手術(shù)療法的中醫(yī)藥在治療慢性退行性疾病過(guò)程中顯示出獨(dú)特的療效而日益受到重視[1-2]。骨性關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)“痹證”范疇,多因腎氣虧虛、關(guān)節(jié)失養(yǎng),復(fù)受風(fēng)寒濕邪,氣血痹阻,經(jīng)絡(luò)不暢而發(fā),治療應(yīng)補(bǔ)益肝腎、活血通絡(luò)、祛風(fēng)散寒、勝濕止痛?;谏鲜鲋嗅t(yī)藥理論形成的榮骨定痛膏在臨床上取得了較好療效。本研究通過(guò)復(fù)制骨性關(guān)節(jié)炎大鼠模型,考察榮骨定痛膏對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)與功能、IL-1β、NO及氧自由基代謝的影響,探討榮骨定痛膏防治骨性關(guān)節(jié)炎的作用及機(jī)制,為臨床用藥提供理論依據(jù),現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下:
1.1藥物榮骨定痛膏(每毫升軟膏劑含原生藥1.5 g,靖遠(yuǎn)縣中醫(yī)院提供,批號(hào):20140610);鹽酸氨基葡萄糖膠囊(浙江誠(chéng)意藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號(hào):20130603)。
1.2試劑木瓜蛋白酶(美國(guó)Sigma公司生產(chǎn),批號(hào):118K1461);IL-1β試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所提供,批號(hào):20140608);NO、NOS、SOD、MDA與考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑盒(南京建成生物工程研究所提供,批號(hào):20140520、20140520、20140501、20140512與20140601)。其余試劑為分析純。
1.3動(dòng)物SPF級(jí)SD雄性大鼠,體質(zhì)量180~220g,由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(甘)2004-0006,SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室許可證號(hào):SYXK(甘)2011-0001。
1.4儀器Cole-Parmer LabGEN125勻漿機(jī)(北京中科科爾儀器有限公司);TGL-16G高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn));N-5600PC型METASH可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司生產(chǎn));HH-S型恒溫水浴鍋(金壇市正基儀器有限公司生產(chǎn));BS1103 sar torius電子天平(北京賽多里斯有限公司)。
1.5方法
1.5.1分組、造模及給藥取SD雄性大鼠48只,按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組,即正常對(duì)照組,模型對(duì)照組,氨基葡萄糖組(90mg/kg),榮骨定痛膏高、中、低劑量組(120、60、30mg/d)各8只。各組大鼠膝關(guān)節(jié)及周?chē)つw脫毛,參照相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法[3-4],在造模的第1、3、7天,將4%木瓜蛋白酶生理鹽水溶液50μL注入大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi),正常對(duì)照組注射等量生理鹽水。造模的同時(shí)給藥,即在大鼠膝關(guān)節(jié)涂抹不同濃度(1.500、0.750、0.375 g/mL)榮骨定痛膏40μL,氨基葡萄糖組灌胃0.9%氨基葡萄糖5mL/kg,正常對(duì)照組與模型對(duì)照組膝關(guān)節(jié)涂抹蒸餾水,2次/d,連續(xù)5周。
1.5.2取材、檢測(cè)指標(biāo)末次涂藥2小時(shí)后,用水合氯醛麻醉大鼠,在室溫下由同一人測(cè)量被動(dòng)膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度,即于膝關(guān)節(jié)等距離處垂直施以相等的力量伸展后回縮大鼠左、右膝關(guān)節(jié),用量角器測(cè)量其伸展至回縮的角度并計(jì)算平均值[5]。股靜脈采血,待血液自然凝固2小時(shí)后,分離血清,按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清IL-1β的水平。取血后,向大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射生理鹽水,0.1mL/次,反復(fù)抽吸后,抽取關(guān)節(jié)灌洗液,每個(gè)關(guān)節(jié)抽洗3次,將關(guān)節(jié)灌洗液2 000 r/min離心10分鐘,取上清液測(cè)定NO、NOS的水平。處死大鼠,切取完整膝關(guān)節(jié),立即打開(kāi)關(guān)節(jié)腔,刮取關(guān)節(jié)面上的滑膜組織,用螺旋測(cè)微器于固定位置測(cè)定關(guān)節(jié)滑膜厚度[5],之后立即置冰浴中的組織勻漿器內(nèi),加入冰生理鹽水,制成2%滑膜組織勻漿,在4℃下4 000 r/min離心10分鐘,取上清液,按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定SOD的活性及MDA的含量。
1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析,計(jì)量資料以±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1榮骨定痛膏對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍、關(guān)節(jié)滑膜厚度的影響大鼠膝關(guān)節(jié)注射木瓜蛋白酶35天后膝關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍縮窄,關(guān)節(jié)滑膜腫脹厚度增加,與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。經(jīng)榮骨定痛膏治療后,膝關(guān)節(jié)的活動(dòng)范圍擴(kuò)大,關(guān)節(jié)滑膜腫脹厚度減小,與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與榮骨定痛膏低劑量組比較,榮骨定痛膏高劑量組的治療作用更強(qiáng)(P<0.05),見(jiàn)表1。
表1 榮骨定痛膏對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍、關(guān)節(jié)滑膜厚度的影響χ±s)
表1 榮骨定痛膏對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍、關(guān)節(jié)滑膜厚度的影響χ±s)
注:與正常對(duì)照組比較,※※表示P<0.01;與模型對(duì)照組比較,△表示P<0.05,△△表示P<0.01;與榮骨定痛膏低劑量組比較,▲表示P<0.05。
組別 只數(shù) 劑量 關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍/° 關(guān)節(jié)滑膜厚度/mm正常對(duì)照組 8 - 158.86±7.79 0.25±0.04模型對(duì)照組 8 - 103.19±12.58※※ 0.39±0.07※※氨基葡萄糖組 8 90mg/kg 127.25±13.13△△ 0.28±0.05△△榮骨定痛膏高劑量組 8 120mg/d 133.03±14.12△△▲ 0.30±0.05△▲榮骨定痛膏中劑量組 8 60mg/d 121.69±13.00△ 0.32±0.06△榮骨定痛膏低劑量組 8 30mg/d 117.34±12.93△ 0.36±0.06
2.2榮骨定痛膏對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠IL-1β、NO及NOS的影響復(fù)制骨性關(guān)節(jié)炎模型大鼠35天,血清IL-1β水平與關(guān)節(jié)灌洗液NO與NOS的水平升高,與正常對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);經(jīng)榮骨定痛膏治療后,IL-1β、NO與NOS的水平有所下降,其中榮骨定痛膏高劑量組及中劑量組與模型對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。
2.3榮骨定痛膏對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)組織中抗氧化酶及氧化產(chǎn)物的影響骨性關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中SOD的活性降低,MDA的含量增加,與正常對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。榮骨定痛膏治療35天后,滑膜組織中SOD的活性顯著升高,MDA的含量下降,與模型對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與榮骨定痛膏低劑量組比較,高、中劑量組的作用更強(qiáng)(P<0.01),見(jiàn)表3。
表2 榮骨定痛膏對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠IL-1β、NO及NOS的影響χ±s)
表2 榮骨定痛膏對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠IL-1β、NO及NOS的影響χ±s)
注:與正常對(duì)照組比較,※※表示P<0.01;與模型對(duì)照組比較,△表示P<0.05,△△表示P<0.01。
組別 只數(shù) 劑量 IL-1β/(μg·L-1) NO/(μmol·L-1) NOS/(U·mL-1)正常對(duì)照組 8 - 0.093±0.015 6.16±1.34 2.33±0.41模型對(duì)照組 8 - 0.269±0.036※※ 9.87±2.08※※ 3.85±0.74※※氨基葡萄糖組 8 90mg/kg 0.241±0.035 7.98±1.70 3.41±0.69榮骨定痛膏高劑量組 8 120mg/d 0.208±0.033△△ 7.18±1.51△ 2.83±0.60△△榮骨定痛膏中劑量組 8 60mg/d 0.225±0.034△ 7.72±1.70△ 3.08±0.61△榮骨定痛膏低劑量組 8 30mg/d 0.231±0.035 8.36±1.73 3.45±0.68
表3 榮骨定痛膏對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)組織中抗氧化酶及氧化產(chǎn)物的影響χ±s)
表3 榮骨定痛膏對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)組織中抗氧化酶及氧化產(chǎn)物的影響χ±s)
注:與正常對(duì)照組比較,※※表示P<0.01;與模型對(duì)照組比較,△表示P<0.05,△△表示P<0.01;與榮骨定痛膏低劑量組比較,▲▲表示P<0.01。
組別 只數(shù) 劑量 SOD/(U·mg-1) MDA/(nmoL·mg-1)正常對(duì)照組 8 - 96.22±10.35 20.95±4.08模型對(duì)照組 8 - 64.87±7.97※※ 102.58±16.75※※氨基葡萄糖組 8 90mg/kg 75.36±8.15△ 83.70±14.93△榮骨定痛膏高劑量組 8 120mg/d 122.76±15.48△△▲▲ 34.44±9.31△△▲▲榮骨定痛膏中劑量組 8 60mg/d 107.41±12.77△△▲▲ 51.49±11.44△△▲▲榮骨定痛膏低劑量組 8 30mg/d 79.80±8.36△△ 81.00±14.85△
骨性關(guān)節(jié)炎(osteoar thritis,OA)也稱骨關(guān)節(jié)病、退行性關(guān)節(jié)炎等,好發(fā)于膝關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)、脊柱及手指等部位,是一種多發(fā)于老年人的慢性進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)疾病。隨著社會(huì)進(jìn)入老齡化,該病發(fā)病率逐年增加。據(jù)統(tǒng)計(jì),美、英等西歐國(guó)家有5%~10%的成年人患有骨性關(guān)節(jié)炎,此病與心血管疾病、創(chuàng)傷并列前3位,每年需手術(shù)治療者達(dá)幾十萬(wàn)人,由此產(chǎn)生的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展有較大影響[6]。隨著我國(guó)社會(huì)人口結(jié)構(gòu)的迅速老齡化,本病不但是公共衛(wèi)生問(wèn)題,而且也成為社會(huì)問(wèn)題,日益引起人們的重視,因此,防治OA已成為各國(guó)骨科學(xué)界的重要課題。OA的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,但其基本病理變化為關(guān)節(jié)軟骨的退行性變與關(guān)節(jié)的增生性改變(特別是軟骨周?chē)盎ぬ?。目前臨床尚缺乏有效的根治措施,治療目的為緩解關(guān)節(jié)疼痛,改善關(guān)節(jié)功能并促進(jìn)重建受損的軟骨及骨結(jié)構(gòu);由于手術(shù)治療缺乏確切有效的臨床治療方案,使得病程明顯延長(zhǎng),作為非手術(shù)療法的中醫(yī)藥日益受到人們的重視[7]。
中醫(yī)理論認(rèn)為,OA多因腎氣虧虛,關(guān)節(jié)失養(yǎng),局部勞損閉阻;復(fù)感風(fēng)寒濕邪,經(jīng)絡(luò)不暢,氣血痹阻,關(guān)節(jié)寒凝、痰阻,不通則痛,故治療應(yīng)補(bǔ)益肝腎、活血通絡(luò)、祛風(fēng)散寒、勝濕止痛[8-9]。在此基礎(chǔ)上擬定的榮骨定痛膏由山茱萸、杜仲、牛膝、當(dāng)歸、秦艽、獨(dú)活、川烏等40余味中藥組成,臨床應(yīng)用效果良好。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,榮骨定痛膏可明顯擴(kuò)大病變關(guān)節(jié)的活動(dòng)范圍,減小滑膜腫脹厚度,改善骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)的結(jié)構(gòu)與功能。
IL-1是最早也是最重要的骨性關(guān)節(jié)炎促炎因子,成熟的IL-1β是由IL-1轉(zhuǎn)換酶裂解IL-1β前體而來(lái)[10]。在正常關(guān)節(jié)中IL-1含量極少且主要是IL-1β,在骨性關(guān)節(jié)炎中,IL-1特別是IL-1β的含量異常升高。骨性關(guān)節(jié)炎中IL-1影響軟骨細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能,促進(jìn)其凋亡,打破軟骨基質(zhì)合成與代謝間的平衡,使滑膜炎性病變,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的破壞。在關(guān)節(jié)軟骨中,軟骨細(xì)胞對(duì)于保持關(guān)節(jié)軟骨功能和結(jié)構(gòu)發(fā)揮著重要作用,IL-1參與關(guān)節(jié)軟骨破壞的起始和進(jìn)展:一方面,IL-1殺傷線粒體呼吸鏈,導(dǎo)致線粒體功能紊亂,軟骨細(xì)胞的能量供應(yīng)減少,使軟骨細(xì)胞活性下降[11];另一方面,IL-1激活并提高誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的活性,使NO合成增加[12],而一氧化氮可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的分解代謝,加速軟骨細(xì)胞的凋亡[13]。同時(shí),一氧化氮屬于活性氮自由基,可引起活性氧的產(chǎn)生而加速脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),對(duì)DNA、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及膠原合成酶造成損傷,導(dǎo)致軟骨細(xì)胞功能紊亂[14]。骨性關(guān)節(jié)炎時(shí)滑膜常出現(xiàn)異常病變,IL-1通過(guò)影響NO控制線粒體功能,影響細(xì)胞周期蛋白而損害骨性關(guān)節(jié)炎中的滑膜細(xì)胞[15]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)榮骨定痛膏在治療骨性關(guān)節(jié)炎的過(guò)程中可降低IL-1β、NO及NOS水平,提高滑膜組織中SOD的活性而降低MDA的含量。
綜上所述,榮骨定痛膏對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎有一定治療作用,緩解IL-1、NO及氧自由基代謝的異常變化是其作用機(jī)制之一。
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The In fluence of RongGu DingTong Ointm ents on IL-1β,NO and Oxygen Free RadicalMetabolism ofOA Rats
CHEN Xiaoping1,WANG Zhiwang2,LIU Caimin1△,TUO Haiyan2,WANG Ruiqiong2
1 Jingyuan County TCM Hospital,Jingyuan 730600,China;2 Gansu University of Traditional Chinese Medicine
Objective:To discuss the effectsof RongGu DingTong ointmenton IL-1β,NO and oxygen free radicalmetabolism of the ratsw ith osteoarthritis(OA).Methods:OA ratmodelwasestablished by injecting 4%papain,therapeutic effects and itsmechanism of RongGu DingTong ointmentwere studied by observing knee joint function,the contentsof IL-1β,NO and NOS,and oxygen free radicalmetabolism in joint tissue.Results:RongGu DingTong ointmentcould reduce the thicknessof jointsynovialswelling of OA rats,increase the range ofmotion of knee joint,decrease the levels of IL-1β,NO and NOS,and improving SOD activity in synovial tissue therefore to decrease the contents of MDA.Conclusion:RongGu DingTong ointment is effective in treating OA rats to a certain degrees,one of itsmechanisms is inhibiting NO generation induced by IL-1β,hence to develop antioxidant functions and inhibit theapoptosisof synovialcells.
osteoarthritis;IL-1β;NO;antioxidantsystem;RongGu DingTong ointment
R684.3
A
1004-6852(2016)07-0023-04
2015-06-25
甘肅省中醫(yī)藥管理局科研課題基金項(xiàng)目(編號(hào)GZK-2013-38)。
陳小平(1971—),男,副主任醫(yī)師。研究方向:風(fēng)濕病、骨病的中醫(yī)藥研究與治療。
劉彩民(1956—),男,副主任醫(yī)師。研究方向:風(fēng)濕病、骨病的中醫(yī)藥研究與治療。