陳芳，李文靜，鄧志英，田紀春，陳建省

作物生物學國家重點實驗室；山東省作物生物學重點實驗室、小麥品質(zhì)及分子育種研究室，山東泰安271018

小麥5DL上基于SNP序列的新SSR標記的開發(fā)

陳芳，李文靜，鄧志英*，田紀春*，陳建省

作物生物學國家重點實驗室；山東省作物生物學重點實驗室、小麥品質(zhì)及分子育種研究室，山東泰安271018

本文旨在利用粗山羊草的物理圖譜及其基因組序列數(shù)據(jù)庫開發(fā)普通小麥5DL上Xbarc320-Xwmc215區(qū)段與SNP緊密連鎖的SSR標記（SNP-SSR）。對AT5D4910-AT5D5010之間的90個SNP位點進行了序列延伸和本地Blast，利用SSRHunter軟件查找SNP位點附近的SSR位點，并利用Primer5設(shè)計引物。結(jié)果共發(fā)現(xiàn)109個SSR位點。對其中的72個位點設(shè)計引物，得到了47個5DL上Xbarc320-Xwmc215區(qū)段的SNP-SSR標記。對新開發(fā)的標記，利用22個小麥品種及人工合成小麥材料、中國春缺體四體及DH群體進行了有效性、多態(tài)性的檢測及染色體定位。結(jié)果表明，這些標記均能擴增出穩(wěn)定清晰的帶型，并且均定位與小麥5D染色體上；其中四個標記Xtdc11、Xtdc31、Xtdc38、Xtdc44整合到了豫麥57與花培3號群體的5DL圖譜上。

SNP-SSR；標記開發(fā)；小麥5D染色體

小麥A、D基因組測序工作的初步完成［1，2］及D基因組物理圖譜的構(gòu)建［3］為開發(fā)物理位置確定的SSR標記提供了幫助。小麥上很多重要的性狀都定位在5DL上Xbarc320-Xwmc215區(qū)段附近，可知該區(qū)段存在十分重要的基因。因此，開發(fā)此區(qū)段的標記對進一步精細定位及克隆［4，5］、種質(zhì)資源多樣性檢測［6-8］和分子輔助育種［9，10］等具有重要的作用和意義。

小麥是異源六倍體，基因組結(jié)構(gòu)復雜，每個基因組上存在的分子標記的密度也有較大差異。通過前人構(gòu)建的分子遺傳圖譜發(fā)現(xiàn)A、B基因組上的分子標記較多，而D基因組各個染色體上的標記較少，尤其是4D和5D染色體［11-15］，這也為這些染色體上控制重要性狀的基因的克隆帶來了較大的困難。因此，開發(fā)4D和5D染色體上新的分子標記不僅能夠加密飽和分子遺傳圖譜，而且對克隆控制重要性狀（如矮敗不育性狀、抽穗期等性狀）的基因奠定良好的基礎(chǔ)。在各類分子標記中，基于PCR的SSR （Simple sequence repeat）標記極其豐富，且廣泛分布于基因組中。因具有超變異性及位點專一性、共顯性和多等位基因等優(yōu)越性得到廣泛應用［16，17］。但由于受小麥基因組測序困難的限制［18］，以往開發(fā)的SSR標記只能計算出遺傳位置，沒有確定的物理位置，這不利于基因的精細定位及克隆。本課題組對有關(guān)主要農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量、品質(zhì)等性狀的QTL定位發(fā)現(xiàn)［19-21］，Xbarc320-Xwmc215染色體區(qū)段附近存在控制多個重要性狀的“QTL簇”。Sang Y等發(fā)現(xiàn)關(guān)于維管束的主效QTL位點qTVB-5D、qLVB-5D、qL/S-5D都在標記Xwmc215-Xbarc345之間［19］；張坤普等在Xwmc215-Xdm63之間定位到關(guān)于籽粒產(chǎn)量、穗粒數(shù)、總小穗數(shù)、小穗著生密度的主效QTL，而在Xbarc320-Xwmc215之間定位到可育小穗數(shù)的QTL［20］；Zhao L等在Xbarc320-Xwmc215之間定位到關(guān)于籽粒和面粉蛋白質(zhì)含量的QTL。其他研究者也發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象，瑤琴等在Vrn-D1附近檢測到關(guān)于抽穗期、株高、穗粒數(shù)的QTL位點［22］；Pestsova EG等在5DL標記Xgwm292及Xgwm982附近定位到關(guān)于開花期、小穗數(shù)和粒重的QTL［23］；Wang G等在Xwmc215-Xcfd29之間定位到關(guān)于籽粒硬度、容重、籽粒蛋白含量的QTL［24］；尤其是Zhang K定位到的抽穗期主效QTL-Qhd5D，其貢獻率最高達53.19%［25］。但是，已定位的這些主效QTL還未被精細定位及克隆。因此，本研究利用賈繼增等［2］發(fā)表的D基因組序列和羅明成等［3］構(gòu)建的D基因組物理圖譜及網(wǎng)站http://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Seq-Repository/BLAS開發(fā)5DL上Xbarc320-Xwmc215區(qū)段附近基于SNP序列新的SSR標記，一方面可為此區(qū)段的遺傳圖譜的加密提供新的分子標記，另一方為該區(qū)段附近主效QTL的精細定位和克隆奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1序列的來源

根據(jù)Xbarc320-Xwmc215在遺傳圖譜上的位置［26］確定此區(qū)段在物理圖譜（http://probes.pw.usda.gov/ WheatDMarker/）上的大體位置為AT5D4910-AT5D5010（區(qū)段內(nèi)的Contig序列由美國戴維斯分校羅明成教授提供），此區(qū)段有90個SNP標記，用這些SNP位點的延伸序列，約500 bp，對D基因組測序數(shù)據(jù)庫［2］進行本地blast或網(wǎng)站http://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Seq-Repository/BLAST提供的小麥基因組序列數(shù)據(jù)庫進行比對，根據(jù)相似度≥99%的條件，得到幾十kb的序列片段。以Xtdc38為例，用物理圖譜上的SNP位點AT5D4993的Contig對建立的D基因組數(shù)據(jù)庫進行Blast，找到相匹配的序列是KD546761［2］。

1.2SSR位點的查找

利用SSRHunter軟件查找二、三、四核苷酸3種類型的SSR，識別標準為：重復序列長度≥20 bp，即重復次數(shù)分別大于或等于10、7、5。對完全型、不完全型、復合型三種SSR進行查找，獲得SSR位點。

1.3SSR引物設(shè)計

利用Primer 5.0軟件根據(jù)SSR的側(cè)翼區(qū)域設(shè)計引物。引物設(shè)計的主要參數(shù)為：SSR序列的開始和結(jié)束位置分別距5′和3′端不少于20 bp；引物長度18～25 bp；引物GC含量40%～60%；退火溫度Tm值50～65℃，而且上游和下游引物的Tm值相差不大于5℃；PCR擴增產(chǎn)物長度100～400 bp；得分80分以上，盡量避免引物二級結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)；引物設(shè)計完成以后由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。引物命名為Xtdc加序號，如Xtdc1。

1.4試驗材料

1.4.1普通小麥品種（系）材料山農(nóng)19、山農(nóng)20、衡6632、衡6503、衡4568、衡觀76、科農(nóng)1006、科農(nóng)2009、鄭麥0856、鄭麥7698、西農(nóng)529、西農(nóng)157、泛7030、10繁27、花培3號、豫麥57。

1.4.2人工合成小麥材料SDAU1、SDAU2、SDAU3、SDAU4、SDAU5。

1.4.3中國春缺體四體材料N5A-T5B、N5B-T5A、N5D-T5A。

1.4.4DH群體（親本為花培3號和豫麥57）共168個系。

1.5DNA提取、SSR擴增和電泳

采用CTAB法提取基因組DNA，用全式金公司的2×EasyTaq PCR SuperM ix進行PCR擴增，產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，0.2%硝酸銀染色檢測。

1.6遺傳圖譜構(gòu)建

在花培3號和豫麥57之間有多態(tài)性的新SSR引物分別在DH群體的168個株系的DNA中進行PCR擴增，記錄基因型。利用軟件Mapmaker/Exp3.0的“try”命令將其整合到DH群體的5DL區(qū)段的分子標記遺傳連鎖圖譜上，設(shè)定LOD≥3.0。用MapChart軟件繪制圖譜。

2　結(jié)果

2.1SSR的分布特征

對AT5D4910-AT5D5010的90條SNP延伸序列blast，搜索SSR位點，共發(fā)現(xiàn)109個SSR位點。其中二、三、四核苷酸重復基元各有67個，34個，8個，各占61.47%，31.19%，7.34%。

在109個SSR中二核苷酸基元TC/AG或CT/GA出現(xiàn)頻率最高，共37個，占SSR總數(shù)的33.94%。AC/GT或CA/TG共17個，占15.60%。AT/TA（占11%）也有較高的出現(xiàn)頻率；三核苷酸基元TTC/AAG出現(xiàn)頻率最高，占SSR總數(shù)的11.93%；其次是CCT/GGA、CAT/GTA、CGG/GCC，出現(xiàn)頻率分別為3.67%，3.67%，2.75%，其他類型出現(xiàn)頻率較低；四核苷酸基元類型出現(xiàn)的頻率均較低（表1）。

對于重復次數(shù)，二核苷酸基元的重復次數(shù)類型多、跨度大。其中GA/CT或AG/TC的重復次數(shù)類型最多，跨度最大，為16種，從重復10次到50次；其次是AC/TG或CA/GT，重復次數(shù)類型為12種，重復11次到38次；AT/TA或TA/AT也有較大的重復次數(shù)跨度，有9種重復類型，重復次數(shù)為10～30次。三核苷酸基元的重復次數(shù)類型和跨度小于二核苷酸。其中TTC/AAG或CTT/GAA有10種重復類型，重復次數(shù)8～38次，重復次數(shù)類型最多，跨度最大；其次是CCT/GGA，CAT/GTA（表1）。

表1　主要重復基元類型及跨度分布Table1Distribution of SSR according tomotif sequence typeand repeatnumber

2.2SNP-SSR引物設(shè)計及其有效性

將發(fā)現(xiàn)的109個SNP-SSR位點，用Primer5對其中的72個位點設(shè)計合成了引物（因有些SSR引物得分較低，所以未設(shè)計引物）。對22個不同的小麥品種及個人工合成六倍體材料的DNA進行PCR擴增，并用8%的PAGE膠對擴增產(chǎn)物進行了電泳檢測分析，發(fā)現(xiàn)47對引物對可以擴增出穩(wěn)定清晰的帶型（表2）。同時，用3個中國春缺體材料（N5A-T5B、N5B-T5A、N5D-T5A）驗證SNP-SSR所在染色體的位置，發(fā)現(xiàn)這些新SNP-SSR標記均在5D染色體上有擴增（圖1）。

圖1　SNP-SSR引物Xtdc38和Xtdc44 PCR擴增產(chǎn)物結(jié)果Fig.1 The PCR amp lified bandsof the SNP-SSR primer pairs Xtdc38 and Xtdc44

表2　47個小麥新SNP-SSR引物Table 2 47wheat SNP-SSR primer pairs

物理位置指與新SSR標記緊密連鎖的SNP標記的位置。距離Kb指新標記與對應的SNP標記之間的距離。Location is the location of SNP linked new SSRmarker，Distance is distance between the new SSRmarker and corresponding SNP.

2.3遺傳作圖

用豫麥57與花培3號構(gòu)建的含有168個家系的DH群體對47對新設(shè)計的引物進行多態(tài)性檢測，其中有4個（Xtdc11、Xtdc31、Xtdc38、Xtdc44）（圖2）在豫麥57與花培3號中存在多態(tài)性，將其整合到本實驗室已構(gòu)建遺傳連鎖圖譜［26］的5DL染色體上（圖3）。

圖2　四個SNP-SSR新標記在DH群體部分家系中的分布Fig.2 The resultsof PCR amp lification in some linesof DH population using four SNP-SSR new markers

圖3　新SNP-SSR標記在5D遺傳圖譜上的位置Fig.3 Location of SNP-SSRmakers in geneticmap of 5D

3　討論

小麥的基因組研究遠遠落后于水稻、玉米、大麥等作物，因為小麥是異源六倍體，基因組結(jié)構(gòu)復雜。近年來雖然構(gòu)建了大量的高密度遺傳圖譜，但由于基因組測序工作的困難，大部分標記的物理位置并不確定，小麥重要基因的精細定位及克隆進展緩慢。2013年我國完成了小麥A、D基因組的測序工作［1，2］，同時羅明成等構(gòu)建了小麥D基因組物理草圖［3］。盡管目前小麥基因組數(shù)據(jù)庫還不夠完善，但這些成果為開發(fā)物理位置確定的SSR標記提供了很大的幫助。之前因EST和cDNA大規(guī)模測序的開展，開發(fā)了大量的EST-SSR引物［27-29］。但是這些EST-SSR標記沒有具體的物理位置，只能根據(jù)中國春缺體或遺傳群體來確定它們的大體位置。本研究根據(jù)羅明成等建立的小麥D基因組物理圖譜，結(jié)合小麥目前的基因組序列數(shù)據(jù)庫，得到47個5DL上區(qū)段Xbarc320-Xwmc215附近與SNP緊密連鎖的SSR標記，命名為SNP-SSR標記，并用中國春缺體驗證了它們的位置。由于這些新的SSR標記與羅明成等所建物理圖譜上的SNP標記緊密連鎖，具有相應的物理位置，因此，為此區(qū)段內(nèi)重要基因的精細定位及克隆和分子育種等提供了方便。

關(guān)于SSR類型的出現(xiàn)頻率，前人有報道EST中SSR的三核苷酸重復出現(xiàn)頻率最高，而本研究中二核苷酸和三核苷酸重復出現(xiàn)頻率最高，其中二核苷酸高于三核苷酸，這可能是因為SSR標記設(shè)計時的序列來源不同；其次本文查找SSR的標準為重復序列長度≥20 bp，而前人的標準為18 bp，且18 bp長度的重復序列中三核苷酸重復出現(xiàn)頻率高于二核苷酸重復。在水稻、玉米、大豆、高粱中二核苷酸重復基元出現(xiàn)頻率最多的都是GA/CT［30］；在大麥中二核苷酸重復基元AG/TC和AC/TG出現(xiàn)頻率較高［31］。在水稻、玉米、大麥中三核苷酸CCG/GGC和AGG/TCC出現(xiàn)頻率較高［30，31］。本研究發(fā)現(xiàn)的109 個SSR位點中，二核苷酸重復出現(xiàn)頻率最高，其中以GA/CT或AG/TC居多，占SSR總數(shù)的33.94%；此外，AC/GT或CA/GT也有較高頻率。三核苷酸基元TTC/AAG出現(xiàn)頻率最高，占SSR總數(shù)的11.93%。這與前人的研究結(jié)果一致。

NicotN等開發(fā)的小麥EST-SSR標記為二核苷酸SSR多態(tài)性較高［32］。本研究中二核苷酸基元的重復次數(shù)類型多、跨度大，其中GA/CT或AG/TC的重復次數(shù)及類型最多，跨度最大，為16種，從重復10次到50次。與前人結(jié)果相一致。

由于SSR標記使用方便、多態(tài)性豐富和位點專一等優(yōu)勢，前人已將SSR標記廣泛應用于構(gòu)建小麥遺傳連鎖圖譜。Chu等將410個SSR標記定位在小麥DH群體的遺傳圖譜上［18］；Elangovan等用202個SSR標記構(gòu)建了一個小麥RIL群體的遺傳圖譜［19］；Janice等用由402個家系構(gòu)成的DH群體，構(gòu)建了一個遺傳圖譜，包括268個SSR標記［21］；Li等構(gòu)建了含有250個SSR標記的小麥遺傳圖譜，并對面包加工品質(zhì)進行了QTL定位。但是這些SSR標記的位置是根據(jù)遺傳群體的分子數(shù)據(jù)計算出來的遺傳位置，其物理位置并不清楚，甚至在不同的圖譜中同一標記的順序不同。而本研究開發(fā)的47個SNP-SSR標記具有確切的物理位置，且發(fā)現(xiàn)其中有4個SNP-SSR標記在DH群體的親本豫麥57與花培3號間存在多態(tài)性，將其定位在5DL上，其中Xtdc31和Xtdc38分別在Xbarc320的上方和Xwmc215的下方，將Xbarc320 和Xwmc215標記卡在物理圖譜AT5D4964和AT5D4993之間，物理距離為12 Mb，確定了Xbarc320-Xwmc215間的基因組序列，為進一步開發(fā)此區(qū)段內(nèi)其他類型的標記，如CAPS、dCAPS、STS標記，提供相應的基因組序列依據(jù)。

本研究公開了利用SNP開發(fā)與SNP緊密連鎖的SNP-SSR分子標記的方法，該方法能夠快速大量的篩選與SNP緊密連鎖的SNP-SSR分子標記，對豐富染色體分子標記的多態(tài)性、構(gòu)建高密度的遺傳圖譜及其克隆控制重要性狀如抽穗期的基因具有重要的意義。

通過本研究所述方法獲得的與SNP緊密連鎖的SNP-SSR分子標記可應用于品種多態(tài)性的篩選、高密度遺傳圖譜的構(gòu)建及重要產(chǎn)量和品質(zhì)性狀的基因的精細定位和克隆，能夠極大縮短研究周期，加快速度，降低成本，具有操作簡單，成本低廉，周期短的優(yōu)點，適于推廣應用，為控制小麥重要性狀基因的克隆提供了技術(shù)支持，提高了效率和質(zhì)量。

4　結(jié)論

開發(fā)了47個5DL上區(qū)段Xbarc320-Xwmc215附近新的SNP-SSR標記，將其中4個標記Xtdc11、Xtdc31、Xtdc38和Xtdc44整合到已構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜上；初步確定了區(qū)段Xbarc320-Xwmc215物理位置在AT5D4964-AT5D4993之間，其物理距離為12Mb，為該區(qū)段內(nèi)主要基因的精細定位和克隆奠定了基礎(chǔ)。

致謝：小麥人工合成六倍體材料及中國春缺體DNA由付道林教授提供，本地blastn的安裝及使用由倪飛博士指導幫助，再此特表感謝。

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Development of Wheat SNP-SSR Markers on 5DL Chromosome

CHEN Fang，LIWen-jing，DENG Zhi-ying*，TIAN Ji-chun*，CHEN Jian-sheng
Group ofWheatQualityand MolecularBreeding/Key Laboratory ofCrop Biology ofShandong Province；State Key Laboratory ofCrop Biology，Taian 271018，China

The objective of this study was to develop SNP-SSR markers on Xbarc320-Xwmc215 of 5DL chromosome for wheatby using the physicalmap of Aegilops tauschii and the database of wheat D genome sequence.SSR Hunter software was used to search SSR loci based on SNP sequences and then SNP-SSR primer pairs were designed by using Primer 5.0 software.The validity of primer pairswas detected using 22 wheat varieties and synthetic hexaploid wheatmaterials.These markersweremapped using DH population and Chinese Spring Nullisomic Tetrasomic lines.109 SSRswere found among 90 SNP extended sequences and local Blast between AT5D4910-AT5D5010.Based on these SSR sequences，72 SNP-SSR primer pairs were designed.47 new SNP-SSR markers on Xbarc320-Xwmc215 of 5DL were obtained.Four of those loci Xtdc11，Xtdc31，Xtdc38，and Xtdc44were integrated into thewheat5DLgeneticmap using DH population.

SNP-SSR；developmentofmarkers；wheat5D chromosome

S33

A

1000-2324（2016）04-0494-07

2014-07-24

2014-10-09

國家自然科學基金（31301315）；山東省自然科學基金（ZR2013CM 004）；作物生物學國家重點實驗室開放課題（2013KF06）；和山東省農(nóng)業(yè)良種工程（魯農(nóng)良種字［2013］207號和［2014］96號）

陳芳（1988-），女，山東泰安人，在讀研究生，研究方向為小麥分子標記與分子設(shè)計育種.E-mail：1172898805@qq.com

Authors for correspondence.E-mail：deng868@163.com；E-mail：jctian@sdau.edu.cn