糖尿病動(dòng)物模型復(fù)制方法研究概況

付黎明　李鐵　呂佳　王之虹

[摘要]糖尿病主要是以高血糖為特征的代謝性疾病，其對(duì)人體的危害僅次于癌癥。不同類型糖尿病發(fā)病機(jī)理各不相同，制作糖尿病動(dòng)物模型的方法也不相同，常用的方法仍然為化學(xué)藥物誘導(dǎo)法。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因敲除型，自發(fā)性動(dòng)物模型等實(shí)驗(yàn)方法也逐漸應(yīng)用。各種制作方法的優(yōu)勢(shì)及怎樣制備，了解不同動(dòng)物模型的特點(diǎn)并應(yīng)用研究，對(duì)臨床上如何更好的治療糖尿病患者意義重大。

[關(guān)鍵詞]糖尿??；動(dòng)物模型；研究概況；綜述

[中圖分類號(hào)]R-332

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]2095-0616（2016）03-41-05

僅用空腹血糖指標(biāo)作為新的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)是1997年美國糖尿病學(xué)會(huì)（ADA）建議提出的，即FPG<6.1mmol/L為正常人群[正?？崭寡牵∟FG）]，6.1mmol/L≤FPG<7.0mmol/L為空腹血糖升高（IFG），F(xiàn)PG≥7.0mmol/L為糖尿病人群（DM）。它是一種代謝性疾病，臨床有1型、2型、特異性和妊娠糖尿病之分。青少年與兒童若發(fā)生糖尿病多為1型糖尿病。多以起病急，“三多一少”，乏力消瘦為特征。因?yàn)榇祟愄悄虿〉陌l(fā)病機(jī)制為體內(nèi)胰島素含量不足，所以需要用胰島素控制病情。而2型糖尿病多在中年發(fā)病，大多35歲以上，此類人體內(nèi)胰島素含量正常，但功能弱，治療時(shí)可以利用藥物刺激其分泌，但部分人仍需要胰島素治療。建立糖尿病模型，旨在更好的進(jìn)行糖尿病及其相關(guān)疾病的研究。在實(shí)驗(yàn)室中如何做出糖尿病動(dòng)物模型，現(xiàn)就各型糖尿病如何制作動(dòng)物模型作以下總結(jié)。

1.手術(shù)切除胰腺法

1889年Minkowshi在手術(shù)切術(shù)大狗胰腺以后，首次制作出了多飲多食多尿及尿糖的糖尿病大狗。Kurup等也切除了BALB/c小鼠的部分胰腺，同樣誘導(dǎo)出類似2型糖尿病動(dòng)物模型。袁暉等在1998年制作糖尿病犬模型時(shí)，手術(shù)切除大狗全部胰腺，在術(shù)后3d連續(xù)監(jiān)測(cè)血糖，造模成功，血糖超過11.1mmol/L。但此種制作方法，注射量較大，死亡率較高，不能夠真實(shí)的模擬糖尿病血糖情況。

2.化學(xué)藥物誘導(dǎo)法

2.1四氧嘧啶法（Alloxan）

Alloxan為一種胰島β細(xì)胞毒劑，可以使其壞死，不能正常分泌胰島素。通過產(chǎn)生H₂O₂等超氧自由基選擇性地破壞胰島β細(xì)胞，輔酶I含量下降，兩者使得胰島素減少發(fā)生在β細(xì)胞合成之前，最終導(dǎo)致血糖過高和糖尿病發(fā)生。

代小思在2011年設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)選取健康150只SD大鼠，分別四種不同劑量經(jīng)腹膜腔注射四氧嘧啶。24h后測(cè)血糖，結(jié)果顯示劑量為150～160mg/kg四氧嘧啶的一組造模成。

但利用此種方法造模會(huì)造成很嚴(yán)重的肝腎損傷，隨著劑量增加，所引起的糖尿病越嚴(yán)重，與糖尿病發(fā)病機(jī)制不同。近年很少應(yīng)用。

2.2鏈脲佐菌素法（STZ）

STZ是一種使動(dòng)物的胰島β細(xì)胞產(chǎn)生毒性的廣譜抗菌素，高劑量致β細(xì)胞壞死，STZ含亞硝酸基化合物，能特異性破壞胰島β的氧化侵襲，胰腺不能分泌相匹配的胰島素進(jìn)行抵抗，使機(jī)體不能耐受糖分而出現(xiàn)糖尿病。此種氧化侵襲與人體1型糖尿病發(fā)病相似；高熱量飲食，再配合低劑量STZ，胰島素作用于外周組織時(shí)作用減低，即可誘導(dǎo)出與2型糖尿病接近的動(dòng)物模型。

于海英等在2011年設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組對(duì)30只大鼠進(jìn)行STZ溶液腹腔注射，劑量為55mg/kg，而后在第9天時(shí)顯示造模成功，空腹血糖>16.65mmol/L。STZ誘導(dǎo)糖尿時(shí)，存在劑量不同，制作的動(dòng)物模型往往差異性很大。查閱文獻(xiàn)中有一次腹腔給藥45mg/kg、65mg/kg、90mg/kg、200mg/kg等的研究，基本上一次性大劑量注射STZ，建立的大鼠模型類似于1型糖尿病。利用此種注射STZ誘導(dǎo)的動(dòng)物模型，能夠破壞哺乳動(dòng)物的胰島β細(xì)胞，這種造模方式類似1型糖尿病的造模方式。但不同于2型糖尿病的發(fā)病機(jī)理，這點(diǎn)有待提高。

張琴等在2004年設(shè)計(jì)用飲食失節(jié)法配合STZ聯(lián)合用藥，STZ的用量為50mg/kg，并且是一次性的腹腔注射。并配合不規(guī)則飼養(yǎng)并配合高熱量飼料，72h后血糖持續(xù)大于16.7mmol/L，表明了造模成功。王保偉等高脂飼料喂養(yǎng)大鼠4周后，腹腔注射STZ 30mg/kg造模成功。利用小劑量并且分次給藥STZ的方法能夠做出類似2型糖尿病的動(dòng)物模型，可以有效的模擬糖尿病的發(fā)病機(jī)理，并且動(dòng)物死亡率相對(duì)減少，是研究2型糖尿病的發(fā)病機(jī)理理想動(dòng)物模型。

桂莉等在2010年設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室中對(duì)SD雄性大鼠以高脂高膽固醇喂養(yǎng)配合STZ聯(lián)合用藥，以高脂高醇食物灌胃加糖水喂養(yǎng)，2個(gè)月后加小劑量鏈脲佐菌素20mg/kg分兩次給藥，可以建成糖尿病大鼠模型，并且成活率>90%，且有較好的穩(wěn)定性。特殊膳食誘導(dǎo)的糖尿病模型由Houssay和Martinez在1947年首先報(bào)道。張松筠等在實(shí)驗(yàn)中把50只SD大鼠高脂飲食但僅24只被納入食源性肥胖組，并且成模率高達(dá)100%，說明此種方法可以制作出糖尿病動(dòng)物模型。但實(shí)驗(yàn)中50只大鼠僅有24只被納入食源性肥胖組，其余小鼠體重均保持正常。此種方法在實(shí)驗(yàn)中大鼠選擇上，比較浪費(fèi)，但只要符合食源性肥胖組的大鼠，造模成功率又相當(dāng)高，此種方法造模要求較高，難度較大。

2.3四氧嘧啶與鏈脲佐菌素聯(lián)合用藥

Alloxan與STZ兩種藥物均是一種β細(xì)胞毒劑，通過使大鼠胰島β細(xì)胞損傷而建立起大鼠模型。目前臨床常用的糖尿病動(dòng)物模型制備方法為這兩種藥物誘導(dǎo)動(dòng)物。但二者單獨(dú)使用時(shí)毒副作用都很強(qiáng)，不利于制作出類似人類病理機(jī)制的模型，并且模型成功率較低。STZ較之于Alloxan實(shí)驗(yàn)中更為常用，優(yōu)點(diǎn)為成模快，較穩(wěn)定，種屬選擇性不強(qiáng)，組織毒性相對(duì)較小等優(yōu)點(diǎn)。劉晟等在2008年時(shí)實(shí)驗(yàn)中利用四氧嘧啶與鏈脲佐菌素聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)中6只雄性狗，其中五只出現(xiàn)高血糖現(xiàn)象，平均達(dá)（22.7±3.2）mmol/L，胰島素用量從2U/d增至（21.4±2.4）U/d。但有3只雌性狗死亡。兩種藥物聯(lián)合用藥的好處在于用藥小，對(duì)動(dòng)物的肝腎損傷小，但雌性狗不耐受出現(xiàn)死亡。需要注意的是在給藥后在特定時(shí)間內(nèi)為了防止低血糖或者預(yù)防成模后的高血糖，需要及時(shí)給與一定劑量的葡萄糖。

3.自發(fā)性糖尿病動(dòng)物模型

1975年由Goto等在白化的Wistar大鼠中選出血糖較高的大鼠進(jìn)行培養(yǎng)即GK大鼠，它具有血糖輕度升高，胰島素分泌能力低，胰腺β細(xì)胞團(tuán)塊量減少等特點(diǎn)。胡泊洋等在實(shí)驗(yàn)中從第13周齡起連續(xù)監(jiān)測(cè)GK大鼠的基礎(chǔ)血糖值、體重、攝食量和飲水量。飼養(yǎng)到24～32周時(shí)，大鼠表現(xiàn)出了明顯的糖尿病特征，且大鼠的死亡率很低。胰島素分泌不足和細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致高血糖和代謝性需求不足的主要原因。但這種大鼠雖然能很好的模擬人類發(fā)病機(jī)制，但模型很難建立，需要很長的造模時(shí)間，并且成活率較低，造模難度大，實(shí)驗(yàn)研究中受到局限。

Zucker肥胖大鼠的“肥胖基因”（fa）的是1961年Zucker兄弟發(fā)現(xiàn)的，fa基因缺陷的純合子個(gè)體（fa/fa），具有肥胖、高糖皮質(zhì)激素、高血壓糖耐量減低等特點(diǎn)。在2型糖尿病動(dòng)物研究中常用Zucker肥胖大鼠。

NSY小鼠是從Jcl-ICR小鼠親株近交系小鼠，選擇葡萄糖耐量低的小鼠進(jìn)行繁殖。它具有年齡依賴性自發(fā)性糖尿病特點(diǎn)。但造模時(shí)間久，胰島素的抵抗在12周齡時(shí)仍不明顯。如控制飲食則病情發(fā)展更慢，高脂食品能夠加速疾病的發(fā)生過程。

OLETF大鼠是1984年日本一家制藥公司雜交出來的自發(fā)性2型糖尿病大鼠。其膽囊收縮素（CCK）-A受體mRNA的表達(dá)完全缺失，其中ODBl和ODB2基因、睪酮與其發(fā)病相關(guān)。但此大鼠雖然模擬了人類的發(fā)病過程，但成活率不高，制作模型時(shí)間長，經(jīng)費(fèi)高等都需要改進(jìn)。

1994年ob/ob小鼠中ob基因突變被證實(shí)且為純合子。是一種因obese基因純合子突變，不能表達(dá)正常功能的蛋白質(zhì)，在4周時(shí)會(huì)出現(xiàn)體重增加變快，肌肉和肝臟均存在多種胰島素信號(hào)通路傳導(dǎo)系統(tǒng)的損害。C57BL/KsJ品系小鼠的瘦素受體基因（dh）在1996年被Jackson發(fā)現(xiàn)的，此基因呈隱性遺傳，位于4號(hào)染色體上。ob/ob小鼠、db/db小鼠均屬遺傳性肥胖T2DM動(dòng)物模型，基因也成隱性遺傳，其發(fā)病均與瘦素基因有關(guān)，小鼠出現(xiàn)三多一少的癥狀，此種方法用于研究2型糖尿病血脂紊亂的研究和多種抗糖尿病藥物的篩選。此類動(dòng)物對(duì)環(huán)境變化敏感，飼養(yǎng)條件苛刻，需要經(jīng)費(fèi)較大。

Kondo等于1957年報(bào)道了Kkay小鼠能自發(fā)出現(xiàn)明顯肥胖、血糖高和高胰島素血癥，Kkay小鼠是在KK小鼠轉(zhuǎn)入突變毛色基因（ay）形成的。其ay基因可以影響小鼠毛色與代謝紊亂，并出現(xiàn)肥胖高血糖等癥狀，雄性小鼠癥狀更明顯。Kkay小鼠的表達(dá)人類2型糖尿病類似。屬于自發(fā)性2型糖尿病動(dòng)物模型，是研究早期腎臟損害的2型糖尿病的理想動(dòng)物。但模型的制備難度較大，需要經(jīng)費(fèi)也較高。

1978年將雄性IIM大鼠系繁殖，產(chǎn)出了糖尿病系eSS大鼠。此種大鼠為不伴肥胖的早發(fā)糖耐量受損且隨增齡而加重，并發(fā)展為嚴(yán)重的高血糖。1975年培養(yǎng)BHE系親代的一個(gè)亞系即為Bhe/Cdb大鼠，表現(xiàn)為空腹高血糖和高脂血癥。

BB大鼠是自發(fā)性的CD8+與CD4+T淋巴細(xì)胞減少，帶有甘氨酸水解酶活性的核苷酸輔酶I的T細(xì)胞表達(dá)ART2?？梢宰鳛橐葝u素耐受誘導(dǎo)的糖尿病動(dòng)物理想模型。中國倉鼠是通過選擇糖耐量異常的個(gè)體，近交繁殖而得，具有血糖高，而非肥胖的特性。屬于自發(fā)性遺傳性l型糖尿病的動(dòng)物模型。

CD（Cohen diabetic）大鼠，利用糖尿病敏感型大鼠進(jìn)行試驗(yàn)對(duì)比，普通喂養(yǎng)不表現(xiàn)糖尿病癥狀，而給予高糖低銅致糖尿病飲食時(shí)，則大鼠表現(xiàn)出糖尿病癥狀，而抵抗型大鼠仍然保持正常血糖。其營養(yǎng)代謝環(huán)境、遺傳背景中的關(guān)系可以進(jìn)步一研究，它為一種特殊的遺傳衍生的糖尿病動(dòng)物模型。

自發(fā)性糖尿病動(dòng)物模型目前都是針對(duì)于2型糖尿病的研究，以后各型糖尿病如何制作自發(fā)性糖尿病動(dòng)物模型有待研究。

4.基因敲除法動(dòng)物模型

單基因敲除，小鼠的外周胰島素抵抗受到Glut-4的一個(gè)等位基因敲除的影響，但肝的胰島素沒受影響，說明改變了體內(nèi)的糖平衡。人與動(dòng)物都易出現(xiàn)脂肪肝、糖尿病性心肌病。與2型糖尿病患者相似，此種小鼠不肥胖，可以作為此類的2型糖尿病動(dòng)物模型。

多基因敲除法，即指兩種動(dòng)物分別基因敲除，而后進(jìn)行雜交。GK+/-小鼠，其胰島素分泌變少，出現(xiàn)耐糖量的異常，而IRS-1-/-小鼠的胰島素抵抗被β細(xì)胞的增生抵消了。雜交的后代表現(xiàn)出胰島素功能異常而出現(xiàn)糖尿病。

NSY（Nagoya-Shibata-Yasuda）小鼠，根據(jù)葡萄糖耐量選擇性的對(duì)Jcl：ICR小鼠近交繁殖而成。其糖尿病發(fā)病模式具有性別差異性，雄性幾乎全部發(fā)展為糖尿病，雌性發(fā)病率僅為30%。NSY小鼠還具有年齡的依賴性，適用于糖尿病動(dòng)物模型。

5.腎上腺素性糖尿病動(dòng)物模型

王金海在2011年利用生理鹽水配置成0.8%的腎上腺素溶液，腹腔注射2U/10g，取小鼠眶靜脈采血并測(cè)血糖，肝糖原的多少用蔥酮法檢測(cè)，腎上腺素配置成0.8%的溶液，成功制作出腎上腺素性糖尿病模型。

6.T細(xì)胞介導(dǎo)誘導(dǎo)糖尿病模型

鄒曉蕾等在2006年選用BALB/c小鼠并給予多次小劑量的STZ喂養(yǎng)，并建立T淋巴細(xì)胞系，利用處死后的脾細(xì)胞懸液制作并放入小鼠體內(nèi)。結(jié)果顯示3×10³T或1.5×10⁶T細(xì)胞過與2次STZ喂養(yǎng)，或加用2次環(huán)磷酞胺即能制備1型糖尿病動(dòng)物模型。尚無對(duì)于2型糖尿病模型的研究文獻(xiàn)。

7.結(jié)論

綜上所述可以看出1型、2型糖尿病發(fā)病機(jī)理，好發(fā)年齡等都有所不同。糖尿病發(fā)病源于胰島素不能很好發(fā)揮作用，使機(jī)體糖量不能及時(shí)分解。有研究認(rèn)為胰島細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致糖尿病發(fā)病的原因，但實(shí)驗(yàn)中如何制備出更符合1型與2型糖尿病的模型仍需進(jìn)一步研究。目前實(shí)驗(yàn)中常用藥物制備模型方法制備，但這樣往往傷害動(dòng)物肝腎功能，與人類發(fā)病機(jī)理不同。而自發(fā)性糖尿病模型與高糖高膽固醇方法制備模型，模型成模率低，動(dòng)物容易死亡，所用經(jīng)費(fèi)較高。仍需進(jìn)一步改善。研究者需針對(duì)其發(fā)病機(jī)理，及針對(duì)β細(xì)胞的方面進(jìn)行研究，制作出更符合1型與2型糖尿病的模型。對(duì)于選擇哪種造模方式進(jìn)行造模，應(yīng)根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)的研究目的、實(shí)驗(yàn)條件及經(jīng)費(fèi)等情況具體問題具體分析。每種類型的造模方式都具有其優(yōu)勢(shì)及局限性。如果在動(dòng)物模型中更好的模擬出人類發(fā)病的機(jī)理及過程，如何減少動(dòng)物肝腎損傷，如何增加成模率，如何縮減成本及減少造模時(shí)間等，將更有利于人類糖尿病的治療與技術(shù)的提高。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，將開發(fā)出更多更好的動(dòng)物模型，為人類糖尿病研究做出貢獻(xiàn)。