張　壽,吳威紅,?！√m*,嚴(yán)作云,張靖維

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧 810016；2.青海省都蘭縣獸醫(yī)站，青海都蘭 816100)

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促卵泡素受體和促黃體素受體在乏情期和懷孕期牦牛卵巢中的表達(dá)

張壽1,吳威紅1,常蘭1*,嚴(yán)作云2,張靖維2

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧 810016；2.青海省都蘭縣獸醫(yī)站，青海都蘭 816100)

應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)和圖象分析方法對乏情期、懷孕期牦牛卵巢的促卵泡素受體(FSHR)、促黃體素受體(LHR)的表達(dá)特點(diǎn)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，牦牛卵巢的皮質(zhì)、髓質(zhì)、顆粒層和膜內(nèi)層、黃體中都分布有FSHR和LHR。且牦牛卵巢皮質(zhì)、髓質(zhì)中的FSHR光密度值在乏情期顯著大于懷孕期(P<0.05)；懷孕期無黃體側(cè)卵巢顆粒層和膜內(nèi)層中FSHR光密度值均大于乏情期和懷孕期有黃體側(cè)(P<0.05)。懷孕期有黃體側(cè)卵巢皮質(zhì)處LHR光密度值最大，乏情期次之，懷孕期無黃體側(cè)最小，各組間差異顯著(P<0.05)；在懷孕期無黃體側(cè)卵巢髓質(zhì)處LHR光密度值顯著小于懷孕期有黃體側(cè)和乏情期(P<0.05)；在乏情期、懷孕期無黃體側(cè)和懷孕期有黃體卵巢顆粒層和膜內(nèi)層處LHR光密度值之間差異均不顯著(P>0.05)。表明牦牛卵巢中FSHR和LHR隨著生殖階段的不同而變化。

促卵泡素受體；促黃體素受體；卵巢；牦牛；免疫組織化學(xué)技術(shù)

垂體激素促卵泡素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH) 、促黃體素(luteinizing hormone，LH)

的作用與卵巢、子宮上相應(yīng)的激素受體緊密相關(guān)，二者可以直接作用于卵巢，調(diào)節(jié)卵泡細(xì)胞生長發(fā)育及排卵。由于FSH、LH為大分子蛋白質(zhì)，不能透過細(xì)胞膜，需要通過卵巢上顆粒細(xì)胞的特異性受體——促卵泡素受體(FSHR)和促黃體素受體(LHR)介導(dǎo)[1]。近年來對動(dòng)物卵巢、子宮中激素受體的研究較多[2-10]，但對于牦牛卵巢FSHR和LHR相關(guān)的研究相對較少。本試驗(yàn)對懷孕期和乏情期牦牛卵巢FSHR和LHR表達(dá)進(jìn)行了研究，為深入探討牦牛生殖內(nèi)分泌特性和提高繁殖能力提供基礎(chǔ)資料。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)用動(dòng)物選取臨床健康的青海省天峻縣(平均海拔4 000 m)乏情期和懷孕4月～5月成年母牦牛各5頭，年齡5歲～6歲。

1.1.2試劑內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑(試劑A)、非免疫動(dòng)物血清(試劑B)、生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG(試劑C)、鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化酶(試劑D)，武漢博士德公司產(chǎn)品；兔源FSHR或者LHR多克隆抗體，武漢博士德公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物處理將選取的母牦牛各5頭，放血致死，迅速取兩側(cè)卵巢，分別中央縱切為兩半，置40 g/L多聚甲醛磷酸緩沖液固定。

1.2.2組織切片的制作及染色經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，切片，片厚4 μm，貼片，烤片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,組織脫蠟至水，蒸餾水洗3次，每次3 min，再用0.01 mol/L PBS液(pH7.4)洗3次，每次8 min，以下各步之間均以0.01 mol/L PBS 液(pH7.4)充分洗滌；修復(fù)液高壓修復(fù)2 min；用內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑(試劑A)，37℃孵育20 min；加非免疫動(dòng)物血清(試劑B)，37℃孵育45 min，不洗；加一抗(兔源FSHR或者LHR多克隆抗體，工作濃度均為1∶200)，4℃過夜；加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG(試劑C)，37℃孵育2h；加鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化酶(試劑D)，37℃孵育30 min；用DAB顯色劑顯色6 min，蒸餾水終止反應(yīng)；蘇木精染液復(fù)染、脫水、透明、封片。

1.2.3觀察與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)在光學(xué)顯微鏡下400倍放大觀察切片，每枚卵巢選3張切片，每組共15張，每張切片選6個(gè)微血管密度大、染色深的不重復(fù)視野，用圖象采集系統(tǒng)采集圖片，所采集的圖片用IMAGE PRO PLUS 6.0軟件(德國)進(jìn)行累計(jì)光密度值的測定，每組累計(jì)光密度值中從大到小依次取60個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行平均光密度值(mean optical density，MOD)計(jì)算，所得數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析并比較。

2　結(jié)果

2.1乏情期和懷孕期牦牛卵巢FSHR的分布

FSHR主要分布在牦牛卵巢的皮質(zhì)、髓質(zhì)、黃體以及卵泡顆粒層和膜內(nèi)層中，卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中也有分布，呈淡黃色。在乏情期卵巢皮質(zhì)、髓質(zhì)處FSHR多，懷孕期FSHR少；而在懷孕期無黃體側(cè)卵泡顆粒層和膜內(nèi)層處多、乏情期和懷孕期有黃體側(cè)少，但黃體中也分布有FSHR(圖1)。

2.2乏情期和懷孕期牦牛卵巢FSHR的表達(dá)變化

由表1可知，乏情期和懷孕期牦牛卵巢的皮質(zhì)、髓質(zhì)、黃體以及卵泡顆粒層和膜內(nèi)層處的FSHR光密度值各不相同。在乏情期卵巢皮質(zhì)和髓質(zhì)中FSHR光密度值顯著大于懷孕期有黃體側(cè)卵巢和懷孕期無黃體側(cè)的FSHR光密度值(P<0.05)，但后兩者之間差異均不顯著(P>0.05)。在懷孕期無黃體側(cè)卵巢卵泡顆粒層和膜內(nèi)層中FSHR光密度值顯著大于乏情期卵巢和懷孕期有黃體側(cè)卵巢FSHR光密度值(P<0.05)，而后兩者之間差異不顯著(P>0.05)。

2.3乏情期和懷孕期牦牛卵巢LHR的分布

LHR主要分布在乏情期和懷孕期牦牛卵巢的皮質(zhì)、髓質(zhì)、黃體以及顆粒層和膜內(nèi)層中，卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中也有分布，呈淡黃色。懷孕期有黃體側(cè)卵巢髓質(zhì)和乏情期、懷孕期無黃體側(cè)、懷孕期有黃體側(cè)卵巢的顆粒層和膜內(nèi)層中LHR樣著色較深。懷孕期有黃體側(cè)卵巢的黃體中LHR樣著色也較深(圖2)。

2.4乏情期和懷孕期牦牛卵巢LHR的表達(dá)變化

由表2可知，乏情期和懷孕期牦牛卵巢的皮質(zhì)、髓質(zhì)、黃體以及卵泡顆粒層和膜內(nèi)層處的LHR光密度值有所不同。其中，在懷孕期有黃體側(cè)卵巢皮質(zhì)處LHR光密度值最大，乏情期次之，懷孕期無黃體側(cè)最小，且各組間差異顯著(P<0.05)；在懷孕期無黃體側(cè)卵巢髓質(zhì)處LHR光密度值均顯著少于懷孕期有黃體側(cè)和乏情期(P<0.05)，而后兩者之間差異不顯著(P>0.05)；在乏情期、懷孕期無黃體側(cè)和懷孕期有黃體組間卵泡卵巢顆粒層和膜內(nèi)層處LHR光密度值差異均不顯著(P>0.05)。

3　討論

3.1FSHR免疫陽性細(xì)胞在牦牛卵巢中的分布特點(diǎn)與卵巢功能的關(guān)系

哺乳動(dòng)物FSHR陽性細(xì)胞在卵巢中主要分布卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、各級卵泡以及卵泡膜中[3-5]。

A、B、C分別為乏情期、懷孕期無黃體側(cè)和懷孕期有黃體側(cè)的皮質(zhì)；D、E、F分別為乏情期、懷孕期無黃體側(cè)和懷孕期有黃體側(cè)的髓質(zhì)； G、H、I分別為乏情期、懷孕期無黃體側(cè)和懷孕期有黃體側(cè)的顆粒層和膜內(nèi)層；J為黃體

A,B,C.Cortexes of anestrus,pregnancy(without corpus luteum),pregnancy(corpus luteum);D，E，F(xiàn).Medullae of anestrus,pregnancy(without corpus luteum),pregnancy(corpus luteum);G，H，I.Stratum granulosum and theca interna of anestrus, pregnancy(without corpus luteum),pregnancy(corpus luteum);J.Corpus luteum

圖1FSHR免疫反應(yīng)產(chǎn)物在乏情期和懷孕期牦牛卵巢的分布(400×)

Fig.1Immunolocalization of FSHR in ovaries during anestrus and pregnacy of yaks(400×)

在水牛卵巢中，F(xiàn)SHR、LHR陽性細(xì)胞主要見于卵巢內(nèi)膜上皮細(xì)胞、卵泡顆粒細(xì)胞，卵泡期FSHR、LHR的染色強(qiáng)度均高于黃體期[1]。本次研究的結(jié)果也表明牦牛卵巢中FSHR陽性細(xì)胞主要分布在具有大量原始卵泡的皮質(zhì)部、各級卵泡的顆粒細(xì)胞層和內(nèi)膜層中以及髓質(zhì)當(dāng)中，也有少量陽性細(xì)胞分布在黃體中。從FSHR光密度值可以看出，牦牛在乏情期卵巢皮質(zhì)部的光密度值比懷孕期大，說明牦牛雖然處于乏情期階段，但整個(gè)卵巢的發(fā)育仍需要FSH的調(diào)節(jié)，并且為發(fā)情期卵泡的迅速發(fā)育奠定了受體基礎(chǔ)。而在懷孕期，由于受到黃體產(chǎn)生孕酮的抑制作用，卵巢皮質(zhì)、髓質(zhì)部的FSHR光密度值明顯減少。據(jù)此，可以斷定，乏情期牦牛卵巢對FSH的敏感性較強(qiáng)而懷孕期牦牛卵巢對FSH的敏感性較低。資料報(bào)道[11]卵泡在發(fā)育到初級、次級卵泡時(shí)FSHR陽性細(xì)胞主要分布于顆粒層和內(nèi)膜層中，這有利于FSH與FSHR結(jié)合并產(chǎn)生信號，為卵泡提供物質(zhì)交換和營養(yǎng)，促進(jìn)其成熟。陽性細(xì)胞越多的卵泡受體效應(yīng)越強(qiáng)，卵泡才有機(jī)會(huì)向優(yōu)勢卵泡發(fā)育。從本試驗(yàn)的光密度值可以看出，懷孕期無黃體側(cè)卵泡顆粒層和內(nèi)膜層的FSHR光密度值明顯高于懷孕期有黃體側(cè)和乏情期，這一現(xiàn)象提示牦牛卵泡的發(fā)育可能需要少量孕酮的刺激，而大量孕酮的刺激反而抑制卵泡的發(fā)育。

表1　FSHR免疫反應(yīng)產(chǎn)物在乏情期和懷孕期牦牛卵巢的表達(dá)

注：同列角標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：The data with different letters in the same column mean significant difference(P<0.05).

A、B、C分別為乏情期、懷孕期無黃體側(cè)和懷孕期有黃體側(cè)的皮質(zhì)；D、E、F分別為乏情期、懷孕期無黃體側(cè)和懷孕期有黃體側(cè)的髓質(zhì)； G、H、I分別為乏情期、懷孕期無黃體側(cè)和懷孕期有黃體側(cè)的顆粒層和膜內(nèi)層；J為黃體

A,B,C.Cortexes of anestrus, pregnancy(without corpus luteum),pregnancy(corpus luteum);D，E，F(xiàn).Medullae of anestrus, pregnancy(without corpus luteum),pregnancy(corpus luteum);G，H，I.Stratum granulosum and theca interna of anestrus,pregnancy(without corpus luteum),pregnancy(corpus luteum);J.Corpus luteum

圖2　LHR免疫反應(yīng)產(chǎn)物在乏情期和懷孕期牦牛卵巢的分布(400×)

注：同列角標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：The data with different letters in the same column mean significant difference(P<0.05).

3.2LHR免疫陽性細(xì)胞在牦牛卵巢中的分布特點(diǎn)與卵巢功能的關(guān)系

研究表明[11]，LH在腔前卵泡發(fā)育過程中具有一定的作用，LHR在有腔卵泡的顆粒細(xì)胞和內(nèi)膜細(xì)胞中就有表達(dá)，并且LHR在近成熟卵泡排卵過程中起著至關(guān)重要的作用。卵泡在晚期LHR表達(dá)最高，這與卵泡發(fā)育到后期對促性腺激素的依賴由FSH 轉(zhuǎn)向LH是相適應(yīng)的，說明在卵泡優(yōu)勢化過程中可能與顆粒細(xì)胞獲得LHR和迎合LH峰到來有關(guān)。本次研究結(jié)果與以上資料報(bào)道基本相一致，乏情期牦牛卵巢的皮質(zhì)、髓質(zhì)以及有腔卵泡的顆粒細(xì)胞層、內(nèi)膜層中都有LHR的表達(dá)，說明處于乏情期的牦牛卵巢卵泡雖然處于相對靜止?fàn)顟B(tài)，但其功能的維持仍需要來自垂體LH的調(diào)節(jié)。結(jié)果還表明，處于懷孕期牦牛有黃體側(cè)卵巢LHR的表達(dá)比無黃體側(cè)強(qiáng)，說明有黃體側(cè)卵巢接受LH調(diào)節(jié)作用的功能更強(qiáng)，這就更有利于黃體功能的維持和懷孕的進(jìn)行。

[1]李成嬌，朱曉玲，李萬宏，等.促性腺激素受體在雌性水牛生殖器官的表達(dá)定位研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2011，38(4):66-69.

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Expression of Follicle Stimulating Hormone Receptor and Luteinizing Hormone Receptor in Yak Ovaries During Anestrus and Pregnancy

ZHANG Shou1, WU Wei-hong1,CHANG Lan1,YAN Zuo-yun2, ZHANG Jing-wei2

(1.College of Agriculture and Animal Husbandry,Qinghai University,Xining,Qinghai,810016,China;2.DulanCountyVeterinaryStation,Dulan,Qinghai,816100,China)

The expression characteristics of follicle stimulating hormone receptor and luteinizing hormone receptor in yak ovaries during the anestrus and pregnancy were investigated by immunohistochemical technique and the section image software analysis techniques.The results showed that FSHR and LHR are mainly distributed in cortex,medulla,stratum granulosum and theca interna,corpus luteum of ovaries.In cortex and medulla,the FSHR mean optical densities of yak ovaries during anestrus were significantly greater than those during pregnancy(P<0.05),respectively;in stratum granulosum and theca interna,FSHR mean optical densities of yak ovaries without corpus luteum during pregnancy were significantly greater than those during anestrus between the 3 groups(P<0.05); In medulla,LHR mean optical density of yak ovary without corpus luteum during pregnancy were significantly smaller than those with corpus luteum during pregnancy (P<0.05),respectively.In cortex,the LHR mean optical density of yak ovaries with corpus luteum during pregnancy was the largest and that of yak ovaries without corpus luteum during pregnancy was the smallest among 3 groups,there were significant luteum during pregnancy and anestrus(P<0.05);in stratum granulosum and theca interna,the LHR mean optical densities of yak ovaries were no significant difference between the 3 groups(P>0.05).The results indicated that FSHR and LHR in yak ovaries varied with the reproductive phases.

follicle stimulating hormone receptor;luteinizing hormone receptor;ovary; yak;immunohistochemical technique

2016-01-31

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360590)；青海省科技應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目(2014-ZJ-711)

張壽(1964-)男，青海西寧人，教授，主要從事高原動(dòng)物低氧適應(yīng)和繁殖研究。*通訊作者

S852.21

A

1007-5038(2016)09-0070-05