邵云峰，劉俊杰，陳 能

實驗研究

腺病毒介導的BMP-2基因誘導脂肪間充質(zhì)干細胞向成骨細胞定向分化

邵云峰，劉俊杰，陳 能

目的探討人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）基因通過腺病毒轉(zhuǎn)染青山羊脂肪間充質(zhì)干細胞（ADSCs）的可行性及其向成骨細胞定向分化的能力。方法取麻醉狀態(tài)下青山羊腹股溝脂肪組織，經(jīng)體外分離培養(yǎng)獲得ADSCs，轉(zhuǎn)染以腺病毒介導的人BMP-2基因。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，MTT法檢測ADSCs生長增殖情況，免疫細胞化學法對ADSCs細胞進行堿性磷酸酶（ALP）活性測定，SABC法檢測ADSCsⅠ型膠原的表達，通過RT-PCR、Western blot法檢測BMP-2基因的表達水平。結(jié)果轉(zhuǎn)染人BMP-2基因的ADSCs形態(tài)規(guī)則；細胞生長速度快，且隨培養(yǎng)時間的延長逐漸增多（P＜0.05）；成骨誘導后，轉(zhuǎn)染組細胞ALP活性和Ⅰ型膠原表達強度明顯高于未轉(zhuǎn)染組（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染組ADSCs BMP-2基因mRNA水平和蛋白含量均明顯強于未轉(zhuǎn)染組（P＜0.05）。結(jié)論經(jīng)腺病毒介導的人BMP-2基因轉(zhuǎn)染的青山羊ADSCs在體外誘導培養(yǎng)中可以向成骨細胞定向分化，并保持較強的增殖能力；轉(zhuǎn)染后細胞BMP-2目的基因表達增高。

脂肪間充質(zhì)干細胞；骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)類；腺病毒科；轉(zhuǎn)染；細胞，培養(yǎng)的；細胞分化；成骨細胞

【Abstract】Objective To investigate the feasibility of human bone morphogenetic protein-2（BMP-2）gene transfection into grey goat adipose tissue-derived mesenchymal stem cells（ADSCs）by adenovirus vector，and to explore the directional differentiation potential of ADSCs into osteoblasts.Methods Inguinal fat tissue was excised from anaesthetized grey goat，and then ADSCs were obtained by isolation and culture in vitro.After the human BMP-2 transfection by adenovirus，inverted phase contrast microscope was used to observe the morphology of ADSCs，cell growth was measured by MTT test，alkaline phosphatase（ALP）activity of ADSCswas examined by immunocytochemistry method，expression of collagenⅠ was measured by SABC method，also，expression levels of BMP-2 gene were measured by RT-PCR and Western blot tests.Results After hmuan BMP-2 transfection by adenovirus，the morphology of ADSCs became regular；Cells grew up rapidly with increasing tendency with culture time going by（P＜0.05）；After osteoinduction，ALP activity and collagenⅠexpression intensity in transfection group showed significant higher than those in control group（P＜0.05）；The expression levels of mRNA and protein content of BMP-2 in transfection group were significantly higher than those in control group（P＜0.05）.Conclusion Grey goat's ADSCs transfected by adenovirus vector carrying human BMP-2 gene have the potential of directional differentiation into osteoblasts and good proliferation ability，moreover，the expression of BMP-2 gene become increasing after transfection.

【Key words】Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells；Bone morphogenetic proteins；Adenoviridae；Transfection；Cells，cultured；Cell differentiation；Osteoblasts

種子細胞的選擇是骨組織工程研究中的基本環(huán)節(jié)，其核心問題是如何獲取性狀穩(wěn)定、增殖及成骨能力強、適合臨床應用的種子細胞。脂肪間充質(zhì)干細胞（adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）具有較強的增殖能力和多向分化潛能，并可人工分離、培養(yǎng)及體外擴增，近年來受到研究者的青睞［1-2］。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是在脫礦化骨及其提取物中發(fā)現(xiàn)的一種具有異位成骨能力的生長因子，能夠在體內(nèi)外誘導間充質(zhì)干細胞分化為成骨細胞，進而誘導新骨形成［3-5］。本實驗以青山羊為研究對象，探討青山羊ADSCs細胞的生長增殖特性，評估人BMP-2基因通過腺病毒轉(zhuǎn)染青山羊ADSCs的可行性及其向成骨細胞定向分化的能力，為其在骨組織工程領(lǐng)域的應用奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

低糖DMEM培養(yǎng)液、胰酶（Gibco公司，美國），胎牛血清（Hyclone公司，美國），BMP-2 （Santa Cruze公司，美國），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒、Western blot顯色試劑盒（北京中山生物技術(shù)公司），Ⅰ型膠原酶、地塞米松、維生素C（Sigma公司，美國），Triton X-100、兔抗CD29/CD34/CD44/CD45單克隆抗體、異硫氰酸熒光素（FITC）標記抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），重組人BMP-2腺病毒載體質(zhì)粒（pAd-BMP-2）（哈佛大學麻省總醫(yī)院John F. Mankin教授惠贈），PCR試劑盒（Clontech公司，美國），RT試劑盒（Fermentas公司，加拿大），PCR純化試劑盒（Roche公司，德國）；流式細胞儀（Becton Diskinson公司，美國），倒置相差顯微鏡（Olimpus公司，日本），CO2培養(yǎng)箱（ThermoForma公司，美國），恒溫水浴箱（姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 山羊ADSCs的分離、純化和增殖

取健康3月齡青山羊1只（由中南大學湘雅二醫(yī)院實驗動物部提供），采用3%戊巴比妥鈉按30 mg/kg劑量麻醉，無菌條件下取腹股溝皮下脂肪組織于超凈工作臺內(nèi)充分剪碎，加入與脂肪組織等體積的0.1%Ⅰ型膠原酶，恒溫水浴箱消化60 min，終止消化后以1 000 r/min離心10 min，去除上層脂肪和上清液后，離心管內(nèi)加入培養(yǎng)液重懸細胞，待細胞均勻分布后接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，每隔2～3 d更換細胞培養(yǎng)基，待細胞生長至融合率達90%時，按1∶2～1∶3比例傳代接種，根據(jù)細胞計數(shù)法測繪其生長曲線，留取第3代細胞備用。

1.3 流式細胞儀檢測細胞表面抗原

予0.25%胰蛋白酶消化收集傳3代ADSCs，1 000 r/min離心10 min，PBS重懸細胞。調(diào)整細胞濃度至1×106/mL，分裝，分別滴加飽和濃度的兔抗CD29、CD34、CD44、CD45單克隆抗體，室溫下反應30 min，PBS液洗滌2次，與FITC標記抗兔IgG二抗避光作用30 min，PBS液洗滌并重懸細胞，上機進行流式細胞儀分析。

1.4 pAd-BMP-2重組腺病毒轉(zhuǎn)染ADSCs

取生長良好的第3代青山羊ADSCs于12孔板中培養(yǎng)，pAd-BMP-2重組腺病毒感染細胞后繼續(xù)培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡觀察細胞生長情況及形態(tài)變化。將轉(zhuǎn)染BMP-2的ADSCs作為實驗組，未轉(zhuǎn)染者為對照組。兩組均置于不含BMP-2的成骨誘導培養(yǎng)基（即10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L抗壞血酸、1×10-8mol/L地塞米松溶于含10%胎牛血清的低糖DMEM液）中進行ADSCs成骨誘導分化。

1.5 MTT法檢測細胞生長與增殖

取10枚96孔板，每枚96孔板以5×103/孔的密度將第3代轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染pAd-BMP-2的ADSCs各接種于5個孔中，每孔加入含10%胎牛血清的低糖DMEM液200 μL；另外5個無細胞孔作為空白對照孔，僅加入含10%胎牛血清的低糖DMEM液200 μL。置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每三天換液1次，此后每天同一時間分別隨機抽取轉(zhuǎn)染、未轉(zhuǎn)染及空白對照孔各1板，MTT法測定光密度（optical density，OD）值。

1.6 ALP活性測定

取生長良好的第三代轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染pAd-BMP-2的ADSCs，以1×105/mL密度接種于24孔板中，每孔500 μL。1 d后分為對照組（不更換培養(yǎng)基）和成骨誘導組（更換成骨誘導培養(yǎng)基進行成骨誘導）。分別于培養(yǎng)3、7、10、14 d收集細胞，調(diào)整細胞濃度至1×105/mL，取1 mL細胞懸液進行細胞內(nèi)ALP活性測定，每個時間點取6孔。將細胞懸液以1 000 r/min離心10 min；棄上清，加入1 mL 1%的Triton X-100，反復吹打，使胞漿外流，收集細胞于EP管內(nèi)，按試劑盒操作說明進行ALP含量測定。

1.7 SABC法檢測Ⅰ型膠原表達

取生長良好的第3代轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染pAd-BMP-2的ADSCs，以1×105/mL密度接種于6孔板中，每孔2 mL。1 d后分為對照組（不更換培養(yǎng)基）和成骨誘導組（更換成骨誘導培養(yǎng)基進行成骨誘導）。誘導7 d時取出蓋玻片，采用SABC法檢測標本中Ⅰ型膠原表達，以PBS代替一抗作空白對照。

1.8 RT-PCR和Western blot法檢測ADSCs BMP-2表達

取生長良好的第三代轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染pAd-BMP-2的ADSCs，以1×105/mL密度接種于6孔板中，每孔2 mL。1 d后分為對照組（不更換培養(yǎng)基）和成骨誘導組（更換成骨誘導培養(yǎng)基進行成骨誘導）。分別于培養(yǎng)7、14 d對BMP-2 mRNA和蛋白表達進行RT-PCR和Western-blot檢測。

1.9 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗或配對t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs表面抗原檢測

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，95%以上的青山羊ADSCs傳3代細胞表達CD44和CD29，約5%的細胞表達CD34和CD45，表明分離培養(yǎng)的傳3代細胞表型均一，基本符合間充質(zhì)干細胞的表型特點。

2.2 ADSCs形態(tài)特征及pAd-BMP-2轉(zhuǎn)染后生長情況

原代培養(yǎng)的青山羊ADSCs細胞在接種4～6 h后開始貼壁，初為小圓形，培養(yǎng)48 h后可見細胞以群落或散在方式貼壁生長，呈圓形或多角形，細胞折光性好（圖1）；而轉(zhuǎn)染pAd-BMP-2的ADSCs細胞形態(tài)規(guī)則且類似于成骨細胞（圖2），細胞生長速度快。

2.3 轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組ADSCs生長動力學分析

根據(jù)MTT法測定的第三代轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染pAd-BMP-2的ADSCs各時間點OD值，繪制出細胞生長曲線（圖3）。轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染組ADSCs增殖能力存在差異，生長曲線均呈“S”形。轉(zhuǎn)染組ADSCs經(jīng)歷1～2 d的滯緩期后，3～4 d時進入對數(shù)生長期，5 d左右可單層融合，進入生長平臺期；未轉(zhuǎn)染組ADSCs增殖能力減弱，平均滯緩期約3 d，接種后5～9 d處于對數(shù)生長期，進入平臺期時間延長。轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染組ADSCs對數(shù)生長期細胞倍增時間分別為（30±6）h和（41±6）h，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.899，P=0.020）。

圖1 原代培養(yǎng)48 h的青山羊脂肪間充質(zhì)干細胞（×40）充質(zhì)干細胞（×40）

圖2 第三代轉(zhuǎn)染腺病毒介導BMP-2基因的脂肪間

2.4 轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組ADSCsALP活性測定

未轉(zhuǎn)染組ADSCs成骨誘導第三天，細胞內(nèi)ALP水平開始升高，隨誘導時間的延長，ALP水平增加更為明顯；而轉(zhuǎn)染組ADSCs成骨誘導過程中相同時相點ALP含量顯著高于未轉(zhuǎn)染組（P＜0.05，圖4）。

2.5 Ⅰ型膠原表達

成骨誘導后Ⅰ型膠原免疫細胞化學染色呈陽性，可見棕黃色顆粒分布于細胞胞漿內(nèi)，胞核周圍尤為明顯（圖5A，5B）；未成骨誘導的ADSCs細胞內(nèi)未見棕黃色顆粒（圖5C，5D）。轉(zhuǎn)染組ADSCsⅠ型膠原免疫細胞化學染色表達強度明顯高于未轉(zhuǎn)染組ADSCs（圖5B，5D）。

2.6 ADSCs BMP-2 mRNA和蛋白表達

RT-PCR檢測結(jié)果表明，擴增后轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組均有BMP-2 mRNA表達。轉(zhuǎn)染組青山羊ADSCs成骨誘導培養(yǎng)7 d時BMP-2 mRNA表達最強，14 d時表達減弱；未轉(zhuǎn)染組BMP-2 mRNA表達量7 d后也隨培養(yǎng)時間的延長而逐漸降低。轉(zhuǎn)染組成骨誘導7、14 d時BMP-2 mRNA表達明顯高于未轉(zhuǎn)染組（P＜0.05，圖6）。

圖3 第三代轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染腺病毒介導BMP-2基因的脂肪間充質(zhì)干細胞生長曲線

Western檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組均有BMP-2蛋白表達。轉(zhuǎn)染組青山羊ADSCs成骨誘導7 d BMP-2蛋白表達最強，14 d BMP-2蛋白表達減弱，提示ADSCs在向成骨誘導過程中BMP-2呈現(xiàn)先增強后減弱的趨勢；未轉(zhuǎn)染組BMP-2蛋白表達亦呈現(xiàn)相類似的趨勢。轉(zhuǎn)染組成骨誘導7、14 d時BMP-2蛋白表達明顯高于未轉(zhuǎn)染組（P＜0.05，圖7）。

圖4 第三代轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染腺病毒介導BMP-2基因的脂肪間充質(zhì)干細胞堿性磷酸酶活性

圖5 轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組Ⅰ型膠原免疫細胞化學染色結(jié)果（×100）5A未轉(zhuǎn)染組脂肪間充質(zhì)干細胞（ADSCs）成骨誘導 5B轉(zhuǎn)染組ADSCs成骨誘導 5C未轉(zhuǎn)染組ADSCs未成骨誘導（對照組）5D轉(zhuǎn)染組ADSCs未成骨誘導（對照組）

圖6 轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組脂肪間充質(zhì)干細胞BMP-2 mRNA表達RT-PCR結(jié)果β-actin為內(nèi)參

3 討論

3.1 種子細胞的選擇

骨折愈合過程中大段骨缺損、骨不連、肢體短縮等問題一直是骨科領(lǐng)域的治療難點，如何加快骨再生速度、促進術(shù)后骨愈合，是臨床上亟待解決的問題。近年來組織工程、干細胞及基因治療研究的不斷深入為解決上述問題提供了新的思路［6-7］。而就骨組織工程領(lǐng)域而言，種子細胞的選擇是第一步，也是最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)［8］。大多學者認為，骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是組織工程骨的首選種子細胞［9］，但成人骨髓量有限，骨髓中干細胞所占比例少，數(shù)量也隨年齡增加而呈減少趨勢，這在一定程度上限制了BMSCs的應用。ADSCs則易于擺脫倫理、道德、法律等不利因素的限制，提取方法相對簡單，從脂肪組織中能獲取的數(shù)量較多，在體外易于進行分離、培養(yǎng)和擴增等，更重要的是，ADSCs在多次傳代培養(yǎng)后仍能維持其基因穩(wěn)定性，具備了成為骨組織工程理想種子細胞的基本條件，應用前景廣闊［10］。

3.2 腺病毒作為目的基因載體的可行性

目前常用的病毒載體主要有腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關(guān)病毒等。其中前兩種病毒載體應用較為普遍，尤其是腺病毒載體，具有制備簡單、轉(zhuǎn)染率高、免疫排斥反應低、外源基因表達水平高、病毒顆粒穩(wěn)定、無癌變傾向等優(yōu)點［11］。本實驗RT-PCR檢測結(jié)果顯示，ADSCs成骨誘導培養(yǎng)7、14 d，轉(zhuǎn)染組目的基因BMP-2條帶明顯亮于未轉(zhuǎn)染組，Western blot檢測結(jié)果也證實成骨誘導培養(yǎng)7、14 d時上清液中檢測到BMP-2，且轉(zhuǎn)染組ADSCs BMP-2表達明顯高于未轉(zhuǎn)染組。上述結(jié)果均提示BMP-2基因已被成功轉(zhuǎn)入ADSCs，腺病毒是該基因的良好載體。

3.3 BMP-2對ADSCs成骨細胞分化的誘導作用

BMP的一個重要生物學作用是誘導未分化的間質(zhì)細胞分化成為軟骨和骨，其中以BMP-2的成骨能力最強。作為啟動骨修復過程的關(guān)鍵基因，BMP-2不僅能夠促進成骨細胞分化和誘導體外成骨，同時還具有使ADSCs定向分化為成骨細胞的能力，進而起到誘導新骨形成、有效促進機體成骨功能的作用［12-14］。目前BMP-2已廣泛應用于骨缺損、骨不連、骨質(zhì)疏松患者及各種骨科手術(shù)，取得了較好的應用效果［15-16］。

本實驗采用MTT法檢測ADSCs的細胞增殖能力，結(jié)果顯示，實驗組和對照組的生長曲線均呈上升趨勢，說明隨著時間的延長，細胞數(shù)量增多，符合細胞生長的一般規(guī)律。轉(zhuǎn)染組ADSCs在體外培養(yǎng)條件下的生長與其他細胞同樣經(jīng)歷了生長滯緩期、對數(shù)增殖期和生長平臺期。轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組ADSCs對數(shù)生長期細胞倍增時間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明BMP-2在一定時間范圍內(nèi)可能促進ADSCs的增殖，但其對ADSCs增殖的影響是否具有時間和劑量依賴性，仍需進一步的深入研究。

圖7 轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組脂肪間充質(zhì)干細胞BMP-2蛋白表達Western blot結(jié)果 β-actin為內(nèi)參

Ⅰ型膠原是構(gòu)成骨基質(zhì)的主要成分，它可通過蛋白激酶靶蛋白磷酸化來增加細胞蛋白的合成，還可活化Na+/H+交換系統(tǒng)，促進成骨細胞的黏附、增殖和分化，并可促進新骨形成。本實驗通過免疫細胞化學方法檢測Ⅰ型膠原的表達情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組ADSCs細胞強陽性表達，說明BMP-2可促進ADSCs定向分化，并誘導成骨。

骨細胞群體外實驗中ALP活性增高被認為是成骨細胞分化的指標［17］。本實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染BMP-2基因的ADSCs經(jīng)誘導后ALP表達量增加，提示BMP-2基因可促進ALP的合成和分泌，證實轉(zhuǎn)染后的ADSCs具有向成骨細胞定向分化的能力；RT-PCR和Western檢測結(jié)果亦提示，轉(zhuǎn)染組ADSCs在成骨誘導培養(yǎng)基中可誘導分化為成骨細胞，并能實現(xiàn)骨誘導因子BMP-2的局部階段性穩(wěn)定釋放。

總之，我們從青山羊腹股溝脂肪組織中成功獲取大量ADSCs，并通過腺病毒將BMP-2基因轉(zhuǎn)染到ADSCs中；轉(zhuǎn)染后的ADSCs不僅成為內(nèi)源性BMP-2的局部來源，而且還提供了激活BMP-2自身效應的靶細胞，實現(xiàn)了其向成骨細胞的定向分化并保持較強的增殖能力。今后通過一系列的體外研究和動物實驗研究，相信ADSCs將有望成為骨組織工程中理想的種子細胞。

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Osteogenic differentiation of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells after transfection by adenovirus carrying BMP-2 gene

SHAO Yunfeng，LIU Junjie，CHEN Neng.
Department of Orthopaedics，Shenzhen Shekou People`s Hospital，Shenzhen，Guangdong 518000，China

R329.24，R318.17

A

1674-666X（2016）04-221-07

2016-05-25；

2016-06-19）

（本文編輯：白朝暉）

10.3969/j.issn.1674-666X.2016.04.005

深圳市科創(chuàng)委基金（20150305190447）

518000廣東深圳，南山區(qū)蛇口人民醫(yī)院骨科

E-mail：shaoyunfeng2006@163.com