甘蔗一次多基因遺傳轉(zhuǎn)化及多重PCR檢測

王文治 楊本鵬 蔡文偉 熊國如 王俊剛 馮翠蓮 張樹珍

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗室，?？?571101）

甘蔗一次多基因遺傳轉(zhuǎn)化及多重PCR檢測

王文治 楊本鵬 蔡文偉 熊國如 王俊剛 馮翠蓮 張樹珍

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗室，?？?571101）

通過多基因遺傳轉(zhuǎn)化策略，水稻、玉米等農(nóng)作物實(shí)現(xiàn)了一次多個性狀的遺傳改良，為探索甘蔗一次多基因遺傳轉(zhuǎn)化的可行性，用一個多基因植物表達(dá)載體，對甘蔗進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。通過多重PCR法對4個外源基因在各個轉(zhuǎn)基因株系內(nèi)的整合與缺失進(jìn)行檢測。結(jié)果證明，甘蔗一次多基因遺傳轉(zhuǎn)化是可行的，但因插入的DNA片段較大，會發(fā)生基因丟失現(xiàn)象。因此，一次多基因遺傳轉(zhuǎn)化需要在轉(zhuǎn)化的過程中獲得相對較多的轉(zhuǎn)化株系，才能從中篩選到有應(yīng)用價值的株系。

甘蔗；農(nóng)桿菌介導(dǎo)法；多基因遺傳轉(zhuǎn)化；多重PCR檢測

現(xiàn)代甘蔗栽培種是甘蔗屬熱帶種，割手密和印度種等物種的種間雜交種，在長期的高貴化育種過程中，減數(shù)分裂的異常使得現(xiàn)代甘蔗栽培種形成大量的異源多倍非整倍體［1］，同時由于甘蔗對光周期反應(yīng)敏感，許多重要親本在亞熱帶和溫帶地區(qū)很難開花，即使開花也存在花粉數(shù)量不足，與近緣植物的花期不遇等問題，給甘蔗常規(guī)雜交育種帶來許多困難［2］。而轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將人工分離和修飾過的基因通過物理、化學(xué)及微生物介導(dǎo)的方式導(dǎo)入到生物體基因組中，不受生物體間親緣關(guān)系的限制，操作時間短，改良目的性狀明確。而且甘蔗組培技術(shù)成熟，轉(zhuǎn)基因技術(shù)相對較容易［3］，已成為甘蔗品種遺傳改良的重要途徑。

然而轉(zhuǎn)基因育種中單獨(dú)的轉(zhuǎn)化一個或兩個基因，很難真正對作物起到較大程度的改良。多基因轉(zhuǎn)化策略已成為基因工程在基礎(chǔ)理論與實(shí)際應(yīng)用研究中的主流方向［4］。一次多基因轉(zhuǎn)化可以縮短時間，減少成本，減少篩選標(biāo)記的積累。國內(nèi)在大豆、水稻等作物一次多基因多性狀遺傳改良方面的研究已有報道［5，6］，而對甘蔗這方面開展的研究則很少，國內(nèi)所見的報道僅限于兩個基因融合表達(dá)，未見有3個或3個以上同時多基因多性狀的遺傳改良。國內(nèi)研究單位對甘蔗遺傳改良方面已經(jīng)做了很多研究，部分轉(zhuǎn)基因甘蔗品系已進(jìn)入環(huán)境釋放階段，但最后取得成功的單位非常有限［7］。在甘蔗上開展一次多基因遺傳改良具有重要意義。

本實(shí)驗構(gòu)建一個多基因植物表達(dá)載體，對甘蔗進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，并通過多重PCR法對轉(zhuǎn)化株系進(jìn)行PCR檢測，旨在探索甘蔗一次多基因遺傳轉(zhuǎn)化的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 品種、質(zhì)粒和菌株 本研究所用的受體材料為甘蔗主栽品種新臺糖22號，含bar篩選標(biāo)記基因及另外3個不同目的基因的植物表達(dá)載體為本實(shí)驗構(gòu)建保存，載體總大小為26 kb，左臂和右臂之間的插入序列達(dá)20 kb，轉(zhuǎn)化所用農(nóng)桿菌菌株為EHA105。1.1.2 引物合成 分別合成篩選標(biāo)記基因bar和另外3個不同目的基因的特異引物P-F/R、TG1-F/R、TG2-F/R和TG3-F/R共4對，4對引物退火溫度相近，擴(kuò)增產(chǎn)物彼此之間相差100 bp以上，以便于用于轉(zhuǎn)基因植株的多重PCR檢測。各基因以及各引物擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為：篩選標(biāo)記基因bar（513 bp）、Gene 1（643 bp）、Gene 2（359 bp）、Gene 3（743 bp）。

1.1.3 培養(yǎng)基配方 胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+2，4-D 1 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉膠 8 g/L，pH5.8。

分化培養(yǎng)基：MS+6-BA 1 mg/L+KT 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉膠 8 g/L，pH5.8。

生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS（大量元素減半，其它成分不變）+NAA 2 mg/L+蔗糖20 g/L+椰水100 mL/L+卡拉膠8 g/L+活性炭0.2 g/L，pH5.8。

YEP培養(yǎng)基（1 L）：蛋白胨10 g，酵母提取物10 g，NaCl 5 g。

MR（1 L）：1/5MS大量元素+MS其他成分+2，4-D 1 mg/L+10 mmol/L果糖+10 mmol/L葡萄糖+30 g/L蔗糖，pH5.3。

1.2 方法

1.2.1 甘蔗胚性愈傷組織的誘導(dǎo) 以田間生長良好的甘蔗頂端生長點(diǎn)處的幼葉組織為外植體，經(jīng)酒精及升汞消毒、無菌水沖洗后，于無菌濾紙上吸干其表面的水分后，切成1 mm左右厚度的薄片接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，于避光條件下進(jìn)行培養(yǎng)至誘導(dǎo)出愈傷組織。

1.2.2 農(nóng)桿菌侵染菌液的制備 通過凍融法將多基因植物表達(dá)載體導(dǎo)入到農(nóng)桿菌菌株EHA105中。將經(jīng)酶切及多重PCR鑒定為陽性的農(nóng)桿菌在含抗生素的YEP平板上劃線，挑取單菌落接種到5 mL YEP的液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，于150mL三角瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD為0.6左右，將菌液轉(zhuǎn)移到離心管中，5 000 r/min離心5 min，棄上清，吸干殘液，用MR液體培養(yǎng)基重懸菌體，最后置于28℃，200 r/min激活2 h，誘導(dǎo)細(xì)菌Vir基因的表達(dá)，作為轉(zhuǎn)化材料的浸染液。

1.2.3 愈傷組織的轉(zhuǎn)化 挑取生長旺盛的愈傷組織于濾紙上吹干使其處于干縮狀態(tài)，于工程菌液中浸泡30 min后，濾去菌液，用濾紙吸干殘液，吹干，轉(zhuǎn)移到MR固體培養(yǎng)基上。共培養(yǎng)3-4 d后，轉(zhuǎn)移到含有Basta的繼代培養(yǎng)基上繼代篩選培養(yǎng)20 d后，轉(zhuǎn)移到含有Basta的分化培養(yǎng)基上分化篩選培養(yǎng)15d。待愈傷長出1 cm左右的小苗后，轉(zhuǎn)移至含有Basta的生根培養(yǎng)基上生根篩選培養(yǎng)30 d。

1.2.4 抗性小苗PCR分子檢測 當(dāng)在抗性生根培養(yǎng)基上生長旺盛，濃綠的小苗生長至4-7 cm后，按編號剪取小苗葉片組織約10-20 mg左右，剪碎置于eppendorf管中，用CTAB法提取DNA。用1.1.2合成的篩選標(biāo)記基因bar和另外3個不同目的基因的特異引物P-F/R、TG1-F/R、TG2-F/R和TG3-F/R，進(jìn)行單個基因PCR檢測和4個基因四重PCR檢測，擴(kuò)增時設(shè)置非轉(zhuǎn)基因甘蔗葉片為負(fù)對照，質(zhì)粒載體為正對照。最后統(tǒng)計篩選標(biāo)記基因bar和另外3個目的基因的PCR檢測陽性率。同時分析4個基因四重PCR檢測轉(zhuǎn)基因植株的可行性。

2 結(jié)果

2.1 多基因植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的鑒定

多基因植物表達(dá)載體構(gòu)含有bar篩選標(biāo)記基因以及3個不同的目的基因（圖1）。在凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌之前，首先對載體進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果（圖2）顯示，在不同限制性內(nèi)切酶的作用下，bar基因及3個目的基因均能切出與預(yù)期片段大小一致的條帶，證明質(zhì)粒準(zhǔn)確。通過凍融法轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌菌株后，平板上挑起單克隆，進(jìn)行菌液四重PCR鑒定，圖3表明，菌液四重PCR能擴(kuò)增出與正對照質(zhì)粒載體相同的4個條帶，證明質(zhì)粒載體已經(jīng)準(zhǔn)確導(dǎo)入到農(nóng)桿菌中。四重PCR所用4對引物為bar基因及3個目的基因的特異性擴(kuò)增引物P-F/R、TG1-F/R、TG2-F/R和TG3-F/R，PCR擴(kuò)增引物與質(zhì)粒DNA的結(jié)合位置如圖1所示，設(shè)計引物時，4對引物退火溫度相近，且4對引物彼此之間距離均超過3 000 bp，在較短的PCR延伸時間內(nèi)（30 s）不會發(fā)生不同對引物之間的交叉擴(kuò)增（如TG1-F與TG2-R之間）。

圖1 多基因植物表達(dá)載體

圖2 質(zhì)粒酶切鑒定

圖3 農(nóng)桿菌菌株多重PCR鑒定

2.2 轉(zhuǎn)基因植株的獲得

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，用多基因植物表達(dá)載體對甘蔗進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，用除草劑進(jìn)行篩選。侵染過后的愈傷組織經(jīng)繼代篩選培養(yǎng)后，部分愈傷組織能產(chǎn)生乳白色健康的抗性愈傷組織（圖4-A）?？剐杂鷤M織繼續(xù)進(jìn)行分化篩選培養(yǎng)后，生長出抗性的密集縱生芽（圖4-B）?？剐钥v生芽繼續(xù)進(jìn)行生根篩選培養(yǎng)后生長成健康濃綠的抗性植株。待抗性植株長到5 cm以后即可進(jìn)行后續(xù)的PCR等分子檢測（圖4-C）。

圖4 甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化

2.3 抗性植株的單基因PCR檢測

單基因PCR檢測結(jié)果（圖5）顯示，進(jìn)行PCR檢測的23株抗性植株中，bar基因PCR呈陰性的僅有編號11，Gene 1 為PCR呈陰性的也僅有編號11，Gene 2 呈PCR陰性的有編號4、11、16三株，而Gene 3呈陰性的有2、3、4、7、11、13、16和19共8株。

圖5 單基因PCR檢測

2.4 抗性植株的多重PCR檢測

以所提23株抗性小苗的DNA為模板，進(jìn)行四基因的四重PCR檢測。結(jié)果（圖6）顯示，bar基因PCR顯陰性的僅有編號11，Gene 1 為PCR顯陰性的也僅有編號11，Gene 2 為PCR陰性的有編號4、 11、16三株，而Gene 3為陰性的有2、3、4、6、7、11、13、16、19共9株。多重PCR檢測結(jié)果與單基因PCR結(jié)果大致相同，僅有編號6的植株單基因PCR顯陽性，而多重PCR檢測顯示陰性。說明多重轉(zhuǎn)基因植株多重PCR檢測，基本可以準(zhǔn)確反映轉(zhuǎn)基因植株的外源基因的整合情況 。

圖6 轉(zhuǎn)化植株多重PCR檢測

2.5 多基因遺傳轉(zhuǎn)化的片段遺失

根據(jù)單基因PCR檢測結(jié)果，可以看出多基因大片段的遺傳轉(zhuǎn)化會出現(xiàn)部分片段的斷裂與缺失現(xiàn)象。而圖7則清晰地顯示了篩選標(biāo)記基因與3個目的基因的插入與缺失的情況。除編號11為整個插入片段均缺失以外（懷疑為培養(yǎng)基上的假抗性植株），另外22個株系均成功的整合了bar Gene和Gene 1。而隨著Gene 2 和Gene 3 離bar Gene越來越遠(yuǎn)，缺失的現(xiàn)象也隨著加重。而且基因缺失遵循著前一個基因缺失，后面的基因必缺失；后面的基因不缺失，前面的基因也不缺失的現(xiàn)象。

3 討論

隨著后基因組時代的到來，人類將克隆到越來越多、生物學(xué)意義明確的有用基因，并通過基因工程手段對生物體進(jìn)行遺傳改良。以往的植物基因工程，大多數(shù)是通過轉(zhuǎn)單個或兩個外源基因而獲得某個新的性狀或改善某個性狀。但是生物體的絕大多數(shù)性狀和生理功能都是依靠多基因的協(xié)調(diào)表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。因此單獨(dú)的轉(zhuǎn)化一個或兩個基因，效果往往不大理想，很難真正對作物起到較大程度的改良。例如甘蔗蔗糖的合成，受到了很多關(guān)鍵酶基因的影響，如果單一對某一個基因進(jìn)行改良，是無法真正起到增糖的效果的。好比一條公路有多個限速環(huán)節(jié)，只打通其中一個限速點(diǎn)，而忽略了其他的限速點(diǎn)，對公路的提速效果肯定不理想。一次多基因遺傳轉(zhuǎn)化可以有效地解決這一問題，是很有應(yīng)用前景的作物轉(zhuǎn)基因改良技術(shù)手段。一次多基因遺傳轉(zhuǎn)化可以同時將多個基因插入植物基因組，同時對多個性狀進(jìn)行遺傳改良，減少了不同單基因多次遺傳轉(zhuǎn)化的多個篩選標(biāo)記基因的累贅，減少了工作量與成本。但是一次多基因遺傳轉(zhuǎn)化，表達(dá)載體上左臂和右臂之間的片段就比單基因的大。而在遺傳轉(zhuǎn)化的過程中會出現(xiàn)DNA片段斷裂缺失的現(xiàn)象，而且隨著插入片段越大，DNA片段斷裂與缺失的現(xiàn)象就越嚴(yán)重［8，9］。本研究的實(shí)驗結(jié)果充分印證了這一現(xiàn)象的存在。在遺傳轉(zhuǎn)化篩選的過程中，培養(yǎng)基篩選是針對篩選標(biāo)記基因進(jìn)行的，因此只要篩選劑添加的濃度合適，在篩選培養(yǎng)基上獲得的抗性植株基本為篩選標(biāo)記PCR陽性。本研究室所建立的甘蔗轉(zhuǎn)基因bar/Basta篩選系統(tǒng)與pmi/Mannose篩選系統(tǒng)最后在得到的抗性植株，篩選標(biāo)記基因的PCR陽性率基本接近于100%［10，11］。但是連接在篩選標(biāo)記基因之后的目的基因就會或多或少的出現(xiàn)一些缺失的現(xiàn)象。其缺失的規(guī)律為插入片段越大，缺失概率越大；離篩選標(biāo)記基因越遠(yuǎn)，缺失概率越大；前一個基因缺失，后面的基因必缺失；后面的基因不缺失，前面的基因也不缺失。

圖7 DNA片段插入與缺失

4 結(jié)論

本研究用一個多基因植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，對甘蔗進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得多個抗性株系。挑取其中的23株進(jìn)行單基因多次PCR，與多重PCR進(jìn)行檢測。結(jié)果證明同其他作物一樣，甘蔗一次多基因遺傳轉(zhuǎn)化也是可行的。然而一次多基因遺傳轉(zhuǎn)化會出現(xiàn)基因遺失現(xiàn)象，插入?yún)^(qū)域基因越多，片段越長，缺失現(xiàn)象就越嚴(yán)重。因此必須在遺傳轉(zhuǎn)化與篩選的過程中獲得較大數(shù)量的抗性植株，才能從中篩選到所有目的基因未缺失，表達(dá)穩(wěn)定，有應(yīng)用價值的轉(zhuǎn)基因株系。

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（責(zé)任編輯馬鑫）

Multiple Gene Transformation in Sugarcane and Multiple PCR Detection

WANG Wen-zhi YANG Ben-peng CAI Wen-wei XIONG Guo-ru WANG Jun-gang
FENG Cui-lian ZHANG Shu-zhen
（Sugarcane Research Center of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops of Ministry of Agriculture，Haikou 571101）

Multiple traits of crops such as rice and corn had been improved in single time of transformation by the strategy of multiple gene transformation. For exploring the feasibility of multiple gene transformation of sugarcane in this research， a multiple gene expression vector was used and transformed to sugarcane and many transformed plants were produced. Multiple PCR method was used to analyze the integration and deficiency of multiple genes in the transformed plants. Results showed that multiple gene transformation of sugarcane was feasible. But due to the insertion of large DNA fragments some genes were lost during the integration. Thus it is a need to have sufficient transformed plants then valuable transformed plants can be selected for further research.

sugarcane；Agrobacterium-mediated；multiple gene transformation；multiple PCR detection

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.017

2015-03-27

國家自然科學(xué)基金項目（31371687），現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金項目（CARS-20-2-5）

王文治，男，碩士研究生，助理研究員，研究方向：甘蔗基因工程；E-mail：wangwenzhi@itbb.org.cn

張樹珍，女，博士，研究員，研究方向：甘蔗生物技術(shù)；E-mail：zhangshuzhen@itbb.org.cn