5-Aza-CdR對低氧NG108-15細胞的影響機制研究

張柱霞 孫明英 楊潔 姜樹原 閆少春 邵國

（包頭醫(yī)學院中心實驗室生物醫(yī)學研究中心，包頭 014010）

5-Aza-CdR對低氧NG108-15細胞的影響機制研究

張柱霞 孫明英 楊潔 姜樹原 閆少春 邵國

（包頭醫(yī)學院中心實驗室生物醫(yī)學研究中心，包頭 014010）

通過使用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）抑制劑5-氮-2'脫氧胞苷（5-aza-2'deoxycytidine，5-Aza-CdR）和低氧干預神經(jīng)細胞系NG108-15，旨為揭示5-Aza-CdR、低氧、低氧預適應對NG108-15細胞增殖和細胞周期影響的相關機制。利用5-Aza-CdR（10.0 μmol/L）孵育NG108-15細胞后進行低氧與低氧預適應處理；使用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化；通過RTCA分析細胞增殖指數(shù)；收集細胞后使用流式細胞儀檢測各組細胞周期和細胞凋亡的變化情況；利用Real-time PCR檢測甲基轉(zhuǎn)移酶DNMTs和細胞周期相關基因在mRNA水平的表達變化情況。結(jié)果表明，5-Aza-CdR和低氧抑制NG108-15細胞增殖，促進細胞早期和晚期凋亡，低氧預適應促進細胞的增殖。然而，5-Aza-CdR處理后再低氧與低氧預適應，DNMTs和細胞相關周期基因的mRNA轉(zhuǎn)錄增加（P＜0.05）。10.0 μmol/L的5-Aza-CdR聯(lián)合低氧處理抑制細胞的增殖，低氧預適應對細胞的增殖有促進作用。

NG108-15細胞；5-氮-2'脫氧胞苷；低氧；低氧預適應

低氧預適應（Hypoxic preconditioning）是指一次或多次短暫、非致死性低氧刺激后，可以增強機體對致死性缺血/低氧的耐受性，是一種細胞內(nèi)源性保護機制的啟動［1］。據(jù)流行病學研究顯示臨床上各種心血管疾病都與缺血/低氧有著密切的聯(lián)系［2］，但是低氧預適應的應用卻研究甚少。前期的實驗研究顯示低氧預適應影響DNA的甲基化，DNA甲基化是表觀遺傳學中很重要的研究方向，對DNA進行甲基化修飾的酶是甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMT），已發(fā)現(xiàn)了3種有催化活性的轉(zhuǎn)移酶［3］：DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。

核苷酸類似物5-Aza-CdR［4］作為去甲基化的試劑，以其抑制DNMTs而廣泛應用于表觀遺傳學的研究［5］。由于DNA甲基化在正常細胞的周期中有重要作用，5-Aza-CdR對細胞的周期、分化和死亡產(chǎn)生影響［6］。5-Aza-CdR在腫瘤的治療方面有廣泛的應用［7］，因其可摻入DNA中抑制DNA的復制。其在神經(jīng)發(fā)育和分化，突觸可塑性、學習記憶，以及維持神經(jīng)元的生存等相關基因的表達方面具有重要作用［8］。

NG108-15細胞系由Bernd Hamprecht 于1971年建立，目前已在國內(nèi)不少實驗室傳代和利用，并將其作為生物模型［9］和藥物作用靶點進行研究［10］。NG108-15細胞作為神經(jīng)細胞模型，由于其細胞膜上存在多種離子通道和受體［11］，在神經(jīng)生物學相關研究領域是一種優(yōu)良的模型，并得到廣泛地應用。5-Aza-CdR對腫瘤細胞系細胞周期的影響已有報道［12-15］，但其對神經(jīng)細胞周期的影響尚未見報道。因此，本研究利用小鼠神經(jīng)細胞系NG108-15為實驗材料，通過研究5-Aza-CdR和低氧預適應對細胞的影響，旨為在體內(nèi)研究5-Aza-CdR對神經(jīng)系統(tǒng)的影響奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞 NG108-15細胞購于上海細胞所。

Dulbecco，s Modified Eagle Medium（GIBCO 公司）；5-Aza-CdR（Sigma 公司）；TRIzol（TaKaRa公司）；superscript III（Invitrogen 公司）；2 X real-time PCR Mix（南京凱基）；其余試劑為國產(chǎn)試劑。CO2培養(yǎng)箱（Therom）；三氣培養(yǎng)箱（Therom）；xCELLigence DP系統(tǒng)（艾森生物公司提供）；流式細胞儀（BD FACSCantoTMⅡ）。Real-time PCR儀（ABI公司7900-HT）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及5-Aza-CdR的配制 NG108-15細胞于含10%新生牛血清的Dulbecco，s Modified Eagle Medium培養(yǎng)基，37℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。5-Aza-CdR粉末溶于PBS中配成濃度為1.0 mmol/L 的貯存液，過濾后-20℃保存。

1.2.2 NG108-15細胞的5-Aza-CdR和低氧處理 當細胞達到指數(shù)生長期時進行實驗，實驗分為4組：C組（空白組）、H組（低氧組）、Ha組（10 μmol/L 5-Aza-CdR+低氧組）、HP（低氧預適應組）。低氧預適應組條件：低氧（1%O2/5% CO2/94% N2）30 min和常氧（21% O2/5% CO2/75%N2）30 min交替進行，共4個循環(huán)，然后低氧8 h，復氧8 h；低氧組是直接低氧刺激8 h，然后復氧8 h。收集細胞。

1.2.3 RTCA測定細胞的增殖 NG108-15細胞株在進行細胞毒性實驗前一天進行細胞傳代，當細胞融合度在60%-80%之間，從培養(yǎng)箱中取出細胞，懸浮細胞，調(diào)整細胞濃度達8×104個/mL。E-plate置于儀器檢測臺上測試培養(yǎng)基的基線。上室孔中加入細胞懸液，室溫放置30 min。測定24 h內(nèi)細胞貼壁生長情況。10 μmol/L的5-Aza-CdR藥物處理，24 h后，3個E-plate分別進行不同條件的處理，對照、低氧、低氧預適應處理。實時檢測細胞增值指數(shù)。

1.2.4 NG108-15細胞流式測定凋亡和周期 收集細胞懸液，用PBS緩沖液洗3遍，加入預冷的70%的乙醇固定1 h，用3 mL PBS在流式管中洗一遍，用1 mL PI染色4℃避光反應30 min。測定細胞周期的變化。

預冷的PBS洗細胞懸液3遍，用1 mL的Binding buffer懸浮細胞，轉(zhuǎn)移100 μl到流式管中，染色，渦旋震蕩，室溫避光放置15 min，補加400μL的Binding buffer。測定細胞凋亡的變化。

1.2.5 Real-time PCR檢測DNMT各亞型在轉(zhuǎn)錄水平的表達變化 TRIzol法提取各組細胞的總RNA，Nondrop 2000微量分光光度計檢測總RNA的純度和含量。使用的superscript III試劑盒（Invitrogen公司）逆轉(zhuǎn)錄總RNA成為cDNA，于-20℃保存。引物由Invitrogen公司合成（表1）。

Real-time PCR：Real-time PCR的條件與先前發(fā)表文章相同［7］。Real-time檢測中CCND1、CCND2和DNMTs的CT值通過β-actin的CT值均一化，即ΔCT= CT目標基因-CTbeta-actin，而DNMTs mRNA相對豐度值以ΔΔCT值（DD value）表示，ΔΔCT=2-ΔCT。

1.2.6 統(tǒng)計學處理 用SPSS 10.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件ANOVA和Tukey對組間數(shù)據(jù)進行處理和分析，數(shù)值以±s表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表 1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)圖

NG108-15細胞分別進行C、H、Ha、HP四種不同的處理，24 h后倒置顯微鏡下觀察它們的形態(tài)變化情況。圖1可以看出，C組細胞呈現(xiàn)上皮性貼壁生長，細胞呈多角形，形狀不規(guī)則，輪廓清楚，細胞間結(jié)構緊密，細胞生長旺盛（圖1-C）；H組有少部分細胞形態(tài)出現(xiàn)了皺縮，多角形態(tài)趨于規(guī)則，細胞密度降低，細胞間接觸變松，部分細胞體積縮小，胞核固縮，染色質(zhì)凝集成塊狀，折光性及貼壁能力減弱，增殖減慢，細胞存活數(shù)減少，生長狀態(tài)變差（圖-H）；Ha和HP組細胞形態(tài)較H組有一定程度的好轉(zhuǎn)，不過HP組表現(xiàn)比較明顯，表明低氧預適應可以很明顯增強細胞的耐受性。

圖1 不同處理下的細胞顯微形態(tài)圖（100×）

2.2 RTCA監(jiān)測加入5-Aza-CdR前后低氧預適應細胞增值變化情況。

上一階段實驗已經(jīng)證明5-Aza-CdR對細胞的抑制濃度為10 μmol/L［2］。通過RTCA（實時定量細胞動態(tài)監(jiān)測）分析C、H、Ha和HP組對細胞增殖的作用，如圖2所示。與C組相比，H組和Ha組都抑制了細胞的增殖（P≤0.05，n=6），HP促進細胞的增殖（P≤0.05，n=6）。與H組相比，Ha組進一步抑制了細胞的增殖（P≤0.05，n=6），可見低氧和5-Aza-CdR都抑制細胞的增殖，而低氧預適應對細胞增殖有一定的促進作用。

圖2 RTCA測定NG108-15細胞在不同情況下的增長指數(shù)

2.3 5-aza-CdR對低氧預適應處理的NG108-15細胞周期和凋亡的影響

10.0 μmol/L的5-Aza-CdR處理24 h后，進行低氧、低氧預適應處理，24 h后，使用流式細胞儀測定C、H、Ha、HP組細胞的周期和凋亡變化情況（圖3），單純的低氧很明顯的促進了細胞的早期和晚期凋亡，低氧預適應對細胞凋亡有抑制作用。加入5-Aza-CdR后再低氧，與對照組相比促進細胞的凋亡，但沒有直接低氧組表現(xiàn)明顯。細胞周期變化不是很顯著，但是可以觀察到5-Aza-CdR聯(lián)合低氧組細胞G2期表達增加（圖4）。

2.4 5-Aza-CdR對低氧預適應處理的NG108-15細胞甲基轉(zhuǎn)移酶和細胞相關周期基因的影響

收集細胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Real-time PCR檢測它們的表達變化情況（圖5）。以mRNA/beta-actin mRNA的相對豐度表示，H組較C組，其DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表達顯著降低（0.1619±0.1157 VS 0.584 9±1.121 3， 1.433 7±1.027 2 VS 6.323 5±8.637 0，0.272 6±0.2265 VS 0.910 2±1.499 1）；HP組較H組其DNMT1、DNMT-3A和DNMT3B mRNA表達顯著升高（1.297 6 ±1.347 1 VS 0.161 9±0.115 7，4.397 1±3.776 2 VS 1.433 7±1.027 2和0.781 2±0.778 5 VS 0.272 6±0.226 5，P≤0.05，n=9）；Ha組較H組其DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表達顯著升高（1.5236±1.9031 VS 0.161 9±0.115 7，18.690 2±19.326 3 VS 1.433 7±1.027 2和2.122 3±2.364 3 VS 0.272 6±0.226 5，P≤0.05，n=9），低氧很明顯地抑制了甲基轉(zhuǎn)移酶的地轉(zhuǎn)錄水平。低氧預適應和加入5-Aza-CdR后低氧同樣會提高甲基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)錄水平，且表現(xiàn)為統(tǒng)計學意義。

圖3 5-Aza-CdR對低氧預適應的神經(jīng)細胞NG108-15凋亡的影響

圖4 流式測定NG108-15細胞周期情況

圖5 甲基轉(zhuǎn)移酶DNMTs和細胞周期相關基因在空白組、低氧預適應組和加入5-Aza-CdR后低氧預適應處理組的RNA轉(zhuǎn)錄水平的表達情況

細胞周期相關基因，以mRNA/beta-actin mRNA的相對豐度表示（圖5），H組較C組，其CCND1和CCND2 mRNA表達顯著降低（0.429 7±0.641 9 VS 0.696 6±0.906 4，0.169 2±0.170 2 VS 0.417 1± 0.674 4），HP組較H組其CCND1和CCND2 mRNA表達顯著升高（0.565 4±0.581 8 VS 0.429 7±0.641 9P≤0.05，n=9，0.524 0±0.468 2 VS 0.169 2±0.170 2），Ha組較H組其CCND1和CCND2 mRNA表達顯著升高（0.646 5±0.738 6 VS 0.429 7±0.641 9 P≤0.05，n=9，1.305 5±1.280 0 VS 0.169 2±0.170 2），低氧很明顯的抑制了細胞周期相關基因地轉(zhuǎn)錄水平。低氧預適應和加入5-Aza-CdR后低氧同樣會提高轉(zhuǎn)錄水平，且表現(xiàn)為統(tǒng)計學意義。

3 討論

本實驗利用細胞模型進行研究5-Aza-CdR和低氧預適應對細胞的影響。細胞形態(tài)學的變化告訴我們，5-Aza-CdR和低氧處理都會使細胞的形態(tài)、伸展性、貼壁性變差，而低氧預適應處理細胞則會使它們都有所好轉(zhuǎn)。RTCA細胞增值曲線顯示，5-Aza-CdR和低氧抑制細胞的分裂增殖，低氧預適應很明顯地促進分裂增殖，其增殖速度甚至超過了空白對照。我們猜測低氧和5-Aza-CdR抑制了細胞內(nèi)部的某種生長、分裂因子，使細胞的生長增殖信號傳遞受到抑制，表現(xiàn)為低氧和5-Aza-CdR處理后細胞的生長增殖受到抑制，而低氧預適應促進細胞的生長增殖，為在臨床上抑制腫瘤和促進正常細胞的增殖提供了理論指導。因此我們可以通過使用一定濃度的5-Aza-CdR和一定程度的低氧來抑制腫瘤細胞的生長，而同樣可以通過采用低氧預適應的方法來預防或治療臨床上由于缺血缺氧造成的各種疾病，使癥狀得到一定程度的改善。

細胞凋亡結(jié)果提示我們，加入5-Aza-CdR后再進行低氧處理促進早期細胞的凋亡，但是對晚期細胞的凋亡促進作用不是很明顯，直接低氧處理對細胞早期和晚期凋亡都有很明顯的促進作用。而低氧預適應對細胞的早期、晚期凋亡都表現(xiàn)為明顯的抑制作用。實時定量PCR結(jié)果顯示低氧抑制甲基轉(zhuǎn)移酶和細胞周期相關基因的轉(zhuǎn)錄水平，而加入5-Aza-CdR或是低氧預適應處理后，它們的轉(zhuǎn)錄水平都提高，且都有顯著性的統(tǒng)計學差異。

文獻報道5-Aza-CdR對DNMT1有抑制作用［15，16］，這與5-Aza-CdR對小鼠神經(jīng)細胞NG108-15的作用相似，同時看到低氧抑制了甲基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄，但是在低氧后加入5-Aza-CdR后卻很大程度的促進了甲基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄水平。這與低氧預適應有相同的表達。5-Aza-CdR處理的細胞再進行低氧處理后，卻進一步抑制了細胞增殖。猜測5-Aza-CdR配合低氧提高甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，DNA的甲基化表達增加，能關閉某些基因的活性，從而達到抑制腫瘤的目的。同樣這種處理使細胞周期相關基因表達提高，使細胞阻滯在G2期。低氧預適應對細胞增殖具有促進作用，提高低氧條件下的耐受性。

5-Aza-CdR聯(lián)合低氧和低氧預適應條件下，DNMTs和細胞周期相關基因有相同的表達水平，但是前者表現(xiàn)為抑制細胞增殖，而后者卻表現(xiàn)為促進細胞增殖作用?？梢?-Aza-CdR聯(lián)合低氧對細胞的抑制作用還有其它的途徑。而且報道DNA甲基化以突觸可塑性的機制在大腦中參與學習記憶［17-20］，但是其具體機制尚不清楚。這兩個問題需要我們更深一步的探索。

4 結(jié)論

低氧抑制細胞的增殖，5-Aza-CdR聯(lián)合低氧抑制細胞的增殖但是對DNMTs和細胞周期相關基因的表達卻有促進作用。低氧預適應對DNMTs和細胞周期相關基因的表達卻有促進作用，同時促進細胞的增殖。

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（責任編輯李楠）

The Affecting Mechanism of 5-aza-2'-deoxycytidine on the NG108-15 Cells in Hypoxia

ZHANG Zhu-xia SUN Ming-ying YANG Jie JIANG Shu-yan YAN Shao-chun SHAO Guo
（Biomedical Research Center of Center Laboratory，Baotou Medical College，Baotou 014010）

The aim of this study is to explore the mechanisms of 5-aza-2'deoxycytidine（5-Aza-CdR）and/or hypoxia and/or hypoxic preconditioning on the proliferation and cycle of NG108-15 cells while using the inhibitor（5-Aza-CdR）of DNA methyltransferases（DNMTs）to interfere the nerve cell line NG108-15. The 10.0 μmol/L 5-Aza-CdR was added to cell culture medium， and then cells were treated in hypoxia and/or hypoxic preconditioning. The cell morphology was observed under inverted microscope. The proliferation of NG108-15 was measured using the RTCA. The cell apoptosis and cell cycle were analyzed through flow cytometry analysis. The mRNA levels of DNMTs and cell cycleassociated gene were analyzed by real-time PCR. 5-Aza-CdR and hypoxia inhibited NG108-15 cells proliferation， promoted cell early and late apoptosis， and hypoxic preconditioning promoted cell proliferation. However， as cells were treated by hypoxic or hypoxic preconditioning after the cell treated with 5-Aza-CdR， DNMTs and mRNA transcription of cell cycle-associated genes increased. Conclusively， the jointed treatment of 10.0 μM 5-Aza-CdR with hypoxic inhibited the proliferation of nerve cell line NG108-15， and hypoxic preconditioning had a promoting effect on the cell proliferation.

NG108-15 cell line；5-aza-2'-deoxycytidine；hypoxic；hypoxic preconditioning

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.034

2015-03-16

國家自然科學基金項目（81460283），內(nèi)蒙古自然科學基金項目（2014MS0810），自治區(qū)研究生科研創(chuàng)新項目［S201410127（Y02）］

張柱霞，女，碩士研究生，研究方向：生物化學和分子生物學，E-mail：836796250@qq.com；孫明英同為本文第一作者

邵國，男，博士，教授，研究方向：低氧神經(jīng)保護；E-mail：shootshao@163.com