牦牛CAPN3基因的克隆及組織表達(dá)特異性

王英杰閻萍潘和平吳曉云李明霞

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所 甘肅省牦牛繁育工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050）

牦牛CAPN3基因的克隆及組織表達(dá)特異性

王英杰1，2閻萍1，2潘和平2吳曉云1，2李明霞2

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所 甘肅省牦牛繁育工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050）

以牦牛背最長(zhǎng)肌為材料，采用RT-PCR法克隆了CAPN3基因的CDs區(qū)，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，牦牛CAPN3基因的CDs區(qū)長(zhǎng)2 469 bp，編碼822個(gè)氨基酸殘基；生物信息學(xué)分析顯示，其編碼的蛋白屬于非分泌表面蛋白，含有35個(gè)磷酸化位點(diǎn)，主要在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中發(fā)揮生物學(xué)作用。二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、無規(guī)則卷曲、伸展鏈和β-轉(zhuǎn)角組成，具有CysPc、calpain-Ⅲ和EFh家族蛋白結(jié)構(gòu)域，無信號(hào)肽。牦牛CAPN3基因與黃牛、綿羊和豬在系統(tǒng)發(fā)育樹上的距離最近。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量分析CAPN3在不同組織中的表達(dá)量，CAPN3基因在牦牛的7種組織中均有表達(dá)，但在背最長(zhǎng)肌、胰臟中的表達(dá)量較高。

牦牛；CAPN3基因；克隆；生物信息學(xué)分析；表達(dá)模式

牦牛是分布于海拔2 000 m以上，以我國青藏高原為中心及其毗鄰的高山亞高山地區(qū)的牛種之一，為牧民提供奶、肉、毛、役力、染料等生產(chǎn)和生活必需品［1］。牦牛肉屬于半野生天然綠色食品，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、鐵元素以及胡蘿卜素、鈣等微量元素，脂肪含量低，但牦牛肉的嫩度制約著其市場(chǎng)的接受度，因此，影響牦牛肉嫩度的候選基因成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)之一。

鈣蛋白酶是一種存在于細(xì)胞內(nèi)的非溶酶體性的限制性蛋白水解酶，與肉的嫩度和風(fēng)味等食用品質(zhì)密切相關(guān)。鈣蛋白酶系統(tǒng)基因是理想的肉質(zhì)嫩度分子標(biāo)記［2］。CAPN3基因作為影響肉嫩度的候選基因，其分子生物學(xué)特性和生理調(diào)控功能是近年來研究的熱點(diǎn)之一。CAPN3（Calpain3）是最典型的組織特異性鈣蛋白酶，其在骨骼肌細(xì)胞中呈現(xiàn)高度表達(dá)特異性［3］。Lian等［4］的研究揭示了CAPN3的mRNA水平和蛋白質(zhì)水平與肉的嫩度之間存在顯著相關(guān)性。鴨骨骼肌發(fā)育過程中，CAPN3基因與肌纖維類型和肌纖維的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)。CAPN3基因的變異影響肉的品質(zhì)［5］。侯冠彧等［6］對(duì)CAPN3基因的5'區(qū)域進(jìn)行SNP檢測(cè)和基因型分析，初步斷定該基因本座位有影響肉牛生長(zhǎng)及牛肉嫩度的傾向。Kimberly等［7］發(fā)現(xiàn)CAPN3的活性影響鼠肌肉的營養(yǎng)。延邊黃牛CAPN3在位點(diǎn)5 556發(fā)生G→A突變，導(dǎo)致該位點(diǎn)的脂肪酸和氨基酸含量在不同基因型之間存在差異［8］。CAPN3的活性和表達(dá)水平影響肉質(zhì)嫩度，并且與肢帶型肌營養(yǎng)不良密切相關(guān)，存在著很強(qiáng)的遺傳效應(yīng)［9-11］。CAPN3在組織中的表達(dá)具有特異性，豬CAPN3和CAST基因在背最長(zhǎng)肌中有較高的表達(dá)量［20］。姚慧等［13］分析了CAPN1和CAST基因在牦牛不同組織中的表達(dá)差異。CAPN3基因在牦牛不同組織中表達(dá)情況尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)克隆CAPN3基因的CDs區(qū)，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期為深入研究牦牛CAPN3基因的定位與表達(dá)調(diào)控奠定基礎(chǔ)。同時(shí)采用熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)CAPN3基因在牦牛不同組織的表達(dá)量，為進(jìn)一步揭示CAPN3基因的分子生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣、細(xì)菌菌株和載體 本實(shí)驗(yàn)選擇3頭成年青海省大通牦牛，屠宰后分別采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胰臟、背最長(zhǎng)肌組織，放入液氮保存。

1.1.2 主要試劑 E.coli DH5α購于寶生物公司；pGEM-T easy克隆載體購于Promega公司。TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol試劑、LA Taq DNA聚合酶購自寶生物工程有限公司，DNA Marker DL2000、DNA純化回收試劑盒、高純度質(zhì)粒小量提取試劑盒、SYBR Green熒光定量試劑盒購于TIANGEN公司。

1.1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中普通牛CAPN3基因cDNA序列（登錄號(hào)：149197.1）應(yīng)用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物（表1），由Sangon公司合成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 以成年牦牛背最長(zhǎng)肌為材料，參照RNA提取試劑盒說明書提取RNA?？俁NA用無菌DEPC水溶解，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。

1.2.2 PCR擴(kuò)增與測(cè)序 RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA：反應(yīng)總體系為10 μL：5×gDNA Eraser Buffer（2.0 μL），gDNA Eraser（1.0 μL），Total RNA（1.0 μL），Rrime Script RT Enzyme Mix（1.0 μL），RT Primer Mix（1.0 μL），5×RrimeScript Buffer（4.0 μL），RNase Free H2O（10 μL）。PCR反應(yīng)條件為：42℃ 25 min，85℃5 s，4℃保存。

PCR擴(kuò)增雙鏈：總反應(yīng)體系25 μL：LA Premix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1.0 μL，RNase Free H2O 10.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸3 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，連接到pGEM-T easy載體上，16℃過夜。轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，接種轉(zhuǎn)化后的DH5α于含有Amp的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12-16 h后，挑取陽性菌落接種于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃條件下220 r/min振蕩培養(yǎng)8 h，對(duì)菌液進(jìn)行PCR鑒定后，送至Sangon公司測(cè)序。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系和條件 根據(jù)NCBI中下載的牦牛CAPN3基因（登錄號(hào)：NM-174260.2）應(yīng)用Primer5.0設(shè)計(jì)1對(duì)引物（表1）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為10 μL，SYBRI Mix 5 μL，模板cDNA 0.6 μL，上下游引物各0.2 μL，RNase Free H2O 4 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性15 s，60℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 CAPN3基因的克隆及理化性質(zhì)分析

PCR產(chǎn)物用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳分析，可見3條DNA片段（圖1），大小分別為2 064、1 057和1 104 bp，與預(yù)期DNA片段大小一致。重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果（圖2）表明，本研究克隆測(cè)序得到的序列為3 180 bp，通過BLAST比對(duì)確定該序列為牦牛CAPN3基因，其中開放閱讀框長(zhǎng)2 469 bp，編碼822個(gè)氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，CAPN3基因編碼的蛋白分子量約為94.58 kD，理論等電點(diǎn)為5.70。含有20種基本氨基酸，其中含量最高的是Glu（7.5%），含量最低的是His（1.9%）；含有帶負(fù)電荷的殘基122個(gè)，正電荷殘基107個(gè)，酸性氨基酸為14.84%，堿性氨基酸為14.96%。

2.2 CAPN3基因編碼蛋白的疏水性/親水性預(yù)測(cè)和分析

依據(jù)氨基酸分值越低親水性越強(qiáng)和分值越高疏水性越強(qiáng)的規(guī)律可知，牦牛CAPN3基因氨基酸序列的第491位Arg具有最低的分值-3.967，其親水性最強(qiáng)；第481位Phe具有最高分值2.978，其疏水性最強(qiáng)。可知，整個(gè)多肽鏈表現(xiàn)為親水性（圖3）。2.3 CAPN3基因編碼蛋白信號(hào)肽和跨膜區(qū)分析

（3）以幼兒發(fā)展為中心的原則：家長(zhǎng)助教的最終目的是促進(jìn)幼兒的發(fā)展，所以活動(dòng)的核心應(yīng)圍繞幼兒的全面發(fā)展進(jìn)行。

圖1 牦牛CAPN3基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖

蛋白信號(hào)肽分析表明，CAPN3編碼的蛋白不存在信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白。編碼蛋白所有氨基酸都位于膜表面，可知其是一種表面蛋白（圖4）。

2.4 CAPN3基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位

牦牛CAPN3基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位分析結(jié)果可知，其分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的可能性為39.1%，分布在線粒體中的可能性為8.7%，分布在液泡、細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞骨架的可能性為4.3%。

2.5 牦牛CAPN3基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)域和蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)

用Interpro軟件對(duì)CAPN3基因編碼蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖5）顯示，該序列在56-426氨基酸序列之間有CysPc家族蛋白功能域，在429-583氨基酸序列之間有calpain-Ⅲ家族蛋白功能域，在697-725、727-755、792-820氨基酸序列之間有EFh家族蛋白功能域。運(yùn)用Netphos軟件對(duì)CAPN3基因編碼蛋白分析，可知該蛋白有25個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，2個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，8個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)（圖6）。

2.6 CAPN3基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

用SOPMA服務(wù)器預(yù)測(cè)CAPN3基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖7）表明，該蛋白包含35.64% α-螺旋、43.8%無規(guī)則卷曲、15.33%伸展鏈和5.23% β-轉(zhuǎn)角?？赏茢唳?螺旋和無規(guī)則卷曲是牦牛CAPN3編碼蛋白主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件。采用同源建模法，結(jié)果（圖8）顯示，該蛋白主要由α-螺旋、無規(guī)則卷曲和β-折疊組成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。

使用MegAlign軟件進(jìn)行同源性分析（圖9）發(fā)現(xiàn)，牦牛CAPN3基因編碼蛋白與其他物種CAPN3基因編碼蛋白具有很高的同源性，均在90%以上。使用MEGA5.1中的NJ法構(gòu)建CAPN3基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果（圖10）表明，牦牛與黃牛、綿羊和豬在系統(tǒng)發(fā)育樹種距離較近，這與動(dòng)物學(xué)分類一致。

圖2 牦牛CAPN3基因和編碼蛋白序列

圖3 牦牛CAPN3基因編碼蛋白的疏水性預(yù)測(cè)

圖4 牦牛CAPN3基因編碼蛋白跨膜分析

2.8 CAPN3基因在不同組織中的表達(dá)水平檢測(cè)

CAPN3基因在所檢測(cè)牦牛的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胰臟、背最長(zhǎng)肌組織中均有表達(dá)，而背最長(zhǎng)肌、胰臟中的表達(dá)高于其他組織（圖11）。

3 討論

圖5 牦牛CAPN3基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

圖6 牦牛CAPN3基因編碼蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

圖7 牦牛CAPN3基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖8 牦牛CAPN3蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖

圖9 不同物種CAPN3蛋白氨基酸序列同源性比較

圖10 CAPN3基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖11 牦牛CAPN3基因在不同組織中的表達(dá)量

CAPN3作為影響肉質(zhì)性狀的候選基因，近年來得到了越來越廣泛的重視，CAPN3 可通過自溶降解肌聯(lián)蛋白和伴肌動(dòng)蛋白，在宰后肉的嫩化中扮演重要角色［6］。本研究采用RT-PCR技術(shù)，克隆獲得CDs區(qū)長(zhǎng)2 469 bp，其編碼822個(gè)氨基酸，其編碼的蛋白質(zhì)為親水性蛋白質(zhì)，說明該蛋白為水溶性蛋白。亞細(xì)胞定位推斷牦牛CAPN3基因編碼蛋白可能主要在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中發(fā)揮生物學(xué)作用。磷酸化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，蛋白磷酸化與多種生物學(xué)過程密切相關(guān)［14］，該蛋白有35個(gè)磷酸化位點(diǎn)，可推測(cè)CAPN3在行使生理化功能前或者與其他蛋白互作時(shí)可能需要磷酸化的活化。二硫鍵可以使不同區(qū)域的氨基酸靠攏并形成穩(wěn)定的空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，同時(shí)疏水氨基酸殘基圍繞著二硫鍵可形成局部疏水中心，利于形成穩(wěn)定的高級(jí)結(jié)構(gòu)域［15］，這對(duì)CAPN3蛋白功能的發(fā)揮可以產(chǎn)生重要的影響。在一定的生理?xiàng)l件下，氨基酸序列決定了它的二級(jí)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象。牦牛CAPN3蛋白由35.64% α-螺旋、43.8%無規(guī)則卷曲、15.33%伸展鏈和5.23% β-轉(zhuǎn)角組成，不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件構(gòu)成了CAPN3蛋白特定的高級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而可以行使特定的生理生化功能。牦牛與黃牛、綿羊和豬在系統(tǒng)發(fā)育樹種距離最近，這與Walder等［16］研究結(jié)果相似。

據(jù)Kinbara等［17］報(bào)道，CAPN3在成年動(dòng)物中幾乎只在骨骼肌中表達(dá)，而Missa等［11］用免疫印跡法分析小鼠的不同器官（骨骼肌、心臟、肝臟、子宮、腎臟、小腸和肺臟）CAPN3的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)其在骨骼肌中的表達(dá)是受限的［18］。張?jiān)鰳s等［19］研究山地烏骨雞和商品雞CAPN3基因在不同組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CAPN3基因在胸肌和腿肌中的表達(dá)量最高，且CAPN3基因在10周齡商品雞中所有組織的表達(dá)量高于10周齡的山地烏骨雞。劉博洋等［20］研究發(fā)現(xiàn)草原紅牛脾臟中的CAPN3基因表達(dá)量顯著高于其他組織。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)牦牛不同組織中CAPN3基因表達(dá)水平差異進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，CAPN3基因在所檢測(cè)牦牛的心臟、肝臟、脾臟、腎臟、胰臟及背最長(zhǎng)肌7種組織中均有表達(dá)，不同組織中表達(dá)水平不同。本研究發(fā)現(xiàn)所檢測(cè)的牦牛的各組織中，胰臟、背最長(zhǎng)肌中的CAPN3基因表達(dá)量顯著高于其他組織。因此，背最長(zhǎng)肌中CAPN3基因表達(dá)量顯著高于其他組織，為改良牦牛肉的嫩度提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

牦牛CAPN3基因的CDs區(qū)長(zhǎng)2 469 bp，其編碼822個(gè)氨基酸，其編碼的蛋白質(zhì)為親水性蛋白質(zhì)，說明該蛋白為水溶性蛋白。牦牛CAPN3蛋白由35.64% α-螺旋、43.8%無規(guī)則卷曲、15.33%伸展鏈和5.23% β-轉(zhuǎn)角組成，不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件構(gòu)成了CAPN3蛋白特定的高級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而可以行使特定的生理生化功能。結(jié)果顯示，所檢測(cè)的牦牛的各組織中，胰臟、背最長(zhǎng)肌中的CAPN3基因表達(dá)量顯著高于其他組織。

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（責(zé)任編輯馬鑫）

Cloning and Tissue-specific Expression of CAPN3 Gene in Yak

WANG Ying-jie1，2YAN Ping1，2PAN He-ping2WU Xiao-yun1，2LI Ming-xia2
（1. College of Life Science and Engineering，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730030；2. Key Laboratory of Yak Breeding Engineering of Gansu Province，Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730050）

Using the longissimus of yak（Bos grunniens）back as material， the CDs sequence of yak CAPN3 gene was cloned by RTPCR， and it was analyzed by bioinformatics. The results indicated that the length of CDs in yak CAPN3 gene was 2 469 bp and encoding 822 amino acid residues. Bioinformatics analysis showed that the protein encoded by CAPN3 was the non-secretory surface protein， containing 35 phosphorylation site， and mainly played a biological role in the cytoplasm and nuclei. The secondary structure was mainly composed of α-helices，random coil， extended chain and β-turn， having the structure domains of CysPc， calpain-Ⅲ and EFh families and no signal peptide. The CAPN3 of yak was the most similar with those of Bos taurus， Ovis aries and Sus scrofa in phylogenetic tree. Real-time PCR analysis revealed the expressions of CAPN3 in varied tissues. There were expressions in all 7 tissues， and they were high in the muscle and pancreas.

Bos grunniens；CAPN3 gene；cloning；bioinformatics；expression pattern

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.025

2015-04-14

西北民族大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（ycx14165），國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD13B05）

王英杰，女，碩士研究生，研究方向：分子育種；E-mail：1124063095@qq.com

閻萍，女，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：動(dòng)物遺傳育種；E-mail：pingyanlz@163.com