謝茂松，徐國(guó)興，黃禮彬

?

·實(shí)驗(yàn)論著·

基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)變化

謝茂松，徐國(guó)興，黃禮彬

Abstract

?AIM: To study the changes of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) expression in gene modified bone marrow mesenchymal stem cells (BMSC).

?METHODS: BMSC were divided into blank control group (without transfected BMSC),negative control group (empty vector without BDNF gene transfected BMSC) and experimental group (BDNF gene transfected BMSC).The expression of BDNF mRNA in BMSC was measured by Realtime PCR,and the expression of BDNF in BMSC was measured by ELISA.

?RESULTS: The BDNF mRNA expressions of 3,4,5,6,7 and 8-generation BMSC cells in the experimental group were higher than those in the blank control group and negative control group.The differences were statistically significant (P3: F=491.788,P<0.05; P4: F=380.112,P<0.05; P5: F=1854.929,P<0.05; P6: F=224.540,P<0.05; P7: F=619.155,P<0.05; P8: F=10.092,P<0.05).As the BMSC cells in the experimental group passaging,the BDNF mRNA expressions in the experimental group decreased.The difference of BDNF mRNA expression among different passage cells was statistically significant (F=298.603,P<0.05).The BDNF secretion of 3,4,5,6,7 and 8-generation BMSC cells in the experimental group were higher than those in the blank control group and negative control group.The differences were statistically significant (P3: F=520.609,P<0.05; P4: F=734.520,P<0.05; P5: F=152.847,P<0.05; P6: F=80.372,P<0.05; P7: F=96.083,P<0.05; P8: F=38.532,P<0.05).As the BMSC cells in the experimental group passaging,the BDNF secretion decreased.The difference of BDNF secretion among different passage cells was statistically significant (F=230.084,P<0.05).

?CONCLUSION: Long-term expression of BDNF in BMSC can be enhanced by genetic engineering.

目的：研究基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)分泌腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的表達(dá)變化。

方法：實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(未經(jīng)轉(zhuǎn)染BMSC細(xì)胞)、陰性對(duì)照組(采用不含BDNF基因的空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BMSC細(xì)胞)和實(shí)驗(yàn)組(采用含BDNF基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BMSC細(xì)胞)。Realtime PCR測(cè)定基因修飾的BMSC細(xì)胞BDNF mRNA表達(dá)，ELISA測(cè)定基因修飾的BMSC細(xì)胞BDNF的分泌表達(dá)。

結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組第3、4、5、6、7 和8代BMSC細(xì)胞BDNF mRNA表達(dá)高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P3：F=491.788，P<0.05；P4：F=380.112，P<0.05；P5：F=1854.929，P<0.05；P6：F=224.540，P<0.05；P7：F=619.155，P<0.05；P8：F=10.092，P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組BMSC細(xì)胞隨著細(xì)胞傳代，BDNF mRNA表達(dá)逐漸下降，不同代數(shù)間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=298.603，P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組3、4、5、6、7和8代BMSC細(xì)胞BDNF的分泌表達(dá)高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P3：F=520.609，P<0.05；P4：F=734.520，P<0.05；P5：F=152.847，P<0.05；P6：F=80.372，P<0.05；P7：F=96.083，P<0.05；P8：F=38.532，P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組BMSC細(xì)胞隨著細(xì)胞傳代，BDNF的分泌表達(dá)逐漸下降，不同代數(shù)間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=230.084，P<0.05)。

結(jié)論：通過(guò)基因工程可增強(qiáng)BMSC細(xì)胞表達(dá)BDNF。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；基因修飾；視網(wǎng)膜變性疾??；治療

引用：謝茂松，徐國(guó)興，黃禮彬.基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)變化.國(guó)際眼科雜志2016;16(10):1816-1819

0　引言

視網(wǎng)膜變性疾病是嚴(yán)重的不可逆性致盲眼病。目前此類疾病尚無(wú)有效的治療方法[1-2]。細(xì)胞移植治療為視網(wǎng)膜變性疾病的治療點(diǎn)亮了希望。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)由于多向分化潛能、自體取材方便，無(wú)免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，是理想的種子細(xì)胞[3-4]。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)可增加突觸可塑性及神經(jīng)發(fā)生，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生存[5-6]。干細(xì)胞治療和基因治療有望為視網(wǎng)膜變性疾病的治療提供新的途徑。本項(xiàng)目研究擬通過(guò)基因工程增強(qiáng)BMSC表達(dá)BDNF神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，研究基因修飾的BMSC細(xì)胞BDNF的表達(dá)變化。

1　材料和方法

1.1材料健康清潔級(jí)雄性SD大鼠(福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，10只，4～6周齡，體質(zhì)量80～100g，排除眼部及全身疾病，按照正常晝夜節(jié)律，室內(nèi)溫度25℃，相對(duì)濕度40%～65%，置于獨(dú)立籠內(nèi)，可自由攝食、飲水，大鼠的實(shí)驗(yàn)條件及使用過(guò)程符合視光與眼科研究協(xié)會(huì)(Association for research in vision and ophthalmology，ARVO)相關(guān)的動(dòng)物使用規(guī)定。純化的BDNF過(guò)表達(dá)慢病毒液(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)。FITC-小鼠抗CD44單克隆抗體、FITC-小鼠抗CD34單克隆抗體、FITC-小鼠抗CD90單克隆抗體(Santa Cruz公司)，DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶(Gibco公司)，大鼠BDNF ELISA試劑盒(R&D公司)，RNeasy Mini Kit(Qiagen)，PrimeScript?1st strand cDNA Synthesis Kit(Takara)，SYBR?Premix Ex TaqTM Kit(Takara)。

1.2方法

1.2.1大鼠BMSC取材和培養(yǎng)鑒定大鼠BMSC培養(yǎng)鑒定方法[7]：健康清潔級(jí)4周齡雄性SD大鼠腹腔注射100g/L水合氯醛麻醉后無(wú)菌條件下取出雙側(cè)脛骨和股骨，無(wú)菌PBS沖洗備用。把脛骨和股骨從中間剪斷，用完全培養(yǎng)液(DMEM/F12培養(yǎng)液+200mL/L FBS+50U/mL肝素)10mL反復(fù)沖洗骨髓腔，沖洗液經(jīng)200目不銹鋼標(biāo)準(zhǔn)篩過(guò)濾掉大的團(tuán)塊后充分吹打混勻獲取細(xì)胞懸液，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃，50ml/L CO2的培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Forma)內(nèi)培養(yǎng)。3d后首次換液，換液時(shí)倒除舊的培養(yǎng)液，加入含0.4g/L EDTA的PBS 4mL潤(rùn)洗，37℃孵育10min，倒除PBS和未貼壁的細(xì)胞，加入新的完全培養(yǎng)液。采用CD44、CD34、CD90對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取第2代細(xì)胞用于基因修飾。

1.2.2BDNF基因修飾的BMSC細(xì)胞取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第2代的BMSC，細(xì)胞融合率約30%～50%，更換為新鮮完全培養(yǎng)液。調(diào)整慢病毒感染復(fù)制數(shù)MOI為30加入濃縮純化的BDNF過(guò)表達(dá)慢病毒液(滴度為2×108TU/mL)，同時(shí)加入稀釋好的Polybrene至終濃度為5μg/mL。輕晃混勻，繼續(xù)培養(yǎng)。感染24h后，更換為新鮮完全培養(yǎng)液。熒光顯微鏡下，計(jì)數(shù)表達(dá)綠色熒光的BMSC，計(jì)算感染率。

表1BDNF和GAPDH的引物序列

基因引物序列BDNFF:5 -GGAGCCTCCTCTGCTCTTT-3 R:5 -TTTTGATACCGGGACTTTCT-3 GAPDHF:5 -ACGGCAAGTTCAACGGCACAG-3 R:5 -GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC-3

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(未經(jīng)轉(zhuǎn)染BMSC細(xì)胞)、陰性對(duì)照組(采用不含BDNF基因的空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BMSC細(xì)胞)和實(shí)驗(yàn)組(采用含BDNF基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BMSC細(xì)胞)。

1.2.4Realtime PCR測(cè)定基因修飾的BMSC細(xì)胞BDNF mRNA表達(dá)取第3代、第4代、第5代、第6代、第7代、第8代和第9代細(xì)胞各5×105抽提各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。BDNF引物序列參照GenBank中的序列，用primer 5.0軟件設(shè)計(jì)而成，具體序列見表1。以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行Realtime PCR檢測(cè)，預(yù)變性95℃ 10min，變性95℃ 15s、退火延伸60℃ 60s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每次在延伸階段讀取吸光值。PCR結(jié)束后，在95℃變性1min。然后冷卻至55℃ 1min，使DNA雙鏈充分結(jié)合。收集獲取熒光信號(hào)得到擴(kuò)增曲線、溶解曲線和CT值，通過(guò)內(nèi)參GAPDH校正，采用2-△△CT法分析數(shù)據(jù)，用相對(duì)表達(dá)量表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5ELISA測(cè)定基因修飾的BMSC細(xì)胞BDNF的分泌表達(dá)取第3代、第4代、第5代、第6代、第7代、第8代和第9代細(xì)胞調(diào)整BMSCs密度，按3×104/孔接種于6孔板，24h后細(xì)胞約為5×104/孔，更換新鮮培養(yǎng)基(2mL/孔)，培養(yǎng)12h后收集各組細(xì)胞上清液，按照BDNF的ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

2　結(jié)果

2.1基因修飾的BMSC細(xì)胞BDNF mRNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)組第3、4、5、6、7和8代BMSC細(xì)胞BDNF mRNA表達(dá)高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P3：F=491.788，P<0.05；P4：F=380.112，P<0.05；P5：F=1854.929，P<0.05；P6：F=224.540，P<0.05；P7：F=619.155，P<0.05；P8：F=10.092，P<0.05，圖1)。實(shí)驗(yàn)組BMSC細(xì)胞隨著細(xì)胞傳代，BDNF mRNA表達(dá)逐漸下降，不同代數(shù)間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=298.603，P<0.05)；第3代與第4代，第4代和第5代、第5代與第6代，第6代和第7代組間兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第7代與第8代，第8代和第9代組間兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2基因修飾的BMSC細(xì)胞BDNF的分泌表達(dá)實(shí)驗(yàn)組第3、4、5、6、7和8代細(xì)胞BMSC細(xì)胞BDNF的分泌表達(dá)高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P3：F=520.609，P<0.05；P4：F=734.520，P<0.05；P5：F=152.847，P<0.05；P6：F=80.372，P<0.05；P7：F=96.083，P<0.05；P8：F=38.532，P<0.05，圖2)。實(shí)驗(yàn)組BMSC細(xì)胞隨著細(xì)胞傳代，BDNF的分泌表達(dá)逐漸下降，不同代數(shù)間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=230.084，P<0.05)；第3代和第4代、第4代和第5代、第5代和第6代組間兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第6代和第7代、第7代和第8代、第8代和第9代組間兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3　討論

視網(wǎng)膜變性疾病是嚴(yán)重的不可逆性致盲眼病。視網(wǎng)膜變性疾病如黃斑變性、光感受器細(xì)胞變性、視網(wǎng)膜色素上皮變性、Stargardt病等最終均可致盲[1-2]。由于體內(nèi)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞不能再生，目前此類疾病尚無(wú)有效的治療方法。尋找再生能力強(qiáng)、非視網(wǎng)膜來(lái)源的、可替代視網(wǎng)膜細(xì)胞功能的自體細(xì)胞是移植的理想種子細(xì)胞，也是近年視網(wǎng)膜變性疾病治療的研究熱點(diǎn)和焦點(diǎn)。干細(xì)胞治療和基因治療有望為視網(wǎng)膜變性疾病的治療提供新的途徑。自體BMSC是理想的種子細(xì)胞[3-4]。BMSC可能通過(guò)固有的再生能力分化替代變性的視網(wǎng)膜細(xì)胞、上調(diào)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)、修復(fù)變性的視網(wǎng)膜細(xì)胞等途徑綜合治療視網(wǎng)膜變性疾病。van Velthoven等[8]研究發(fā)現(xiàn)，BMSC可通過(guò)分泌BDNF、類表皮生長(zhǎng)因子、persephin (PSP)或sonic hedgehog調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞增生和分化，改善新生兒缺血缺氧性腦病的預(yù)后。BMSC不僅可通過(guò)分化替代變性的視網(wǎng)膜細(xì)胞，還可通過(guò)分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，挽救修復(fù)周圍神經(jīng)細(xì)胞，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[5-6]。通過(guò)基因工程，可增強(qiáng)BMSC的神經(jīng)保護(hù)功能。

本項(xiàng)目研究在體外成功構(gòu)建了BDNF過(guò)表達(dá)的慢病毒載體，將目的基因BDNF導(dǎo)入BMSC中，轉(zhuǎn)染效率較高。BDNF基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BMSC細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組第3、4、5、6、7和8代BMSC細(xì)胞BDNF的mRNA表達(dá)高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組；ELISA證實(shí)了第3、4、5、6、7和8代BMSC細(xì)胞BDNF的分泌表達(dá)高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組。BDNF表達(dá)于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)。主要在腦組織合成，上丘和視皮質(zhì)有豐富的BDNF分布。視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞自身和移位的無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞可以分泌BDNF，視網(wǎng)膜的外叢狀層、外核層、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層均有表達(dá)。BDNF的受體主要有兩種：高親和力受體酪氨酸蛋白激酶(Trk)和低親和力的P75NT受體。視網(wǎng)膜的TrkB受體主要位于內(nèi)叢狀層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層。BDNF與TrkB受體結(jié)合后引起Trk蛋白及多種蛋白的磷酸化，激活胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(主要包括MAPK/ERK和PI3K/AKT))，營(yíng)養(yǎng)突觸后的神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)、發(fā)育、功能維持，調(diào)節(jié)軸突和樹突的生長(zhǎng)、突觸的形成與功能、細(xì)胞的遷移和增生及神經(jīng)元的存活[9-10]。含有BDNF的培養(yǎng)液中成活的RGC比例多于不含BDNF的培養(yǎng)基[9-10]。視神經(jīng)夾傷動(dòng)物模型于造模后立即玻璃體腔注射不同劑量的BDNF，BDNF注射量為30μg時(shí)RGC的存活率最高，大的RGC數(shù)目較多；而BDNF注射量為90μg時(shí)，可最大程度減少中等大小RGC的缺失，保持小、中、大3種RGC的正常比例[11-12]。這提示RGC對(duì)不同治療劑量的反應(yīng)不同。注射1wk后與未處理組比較，玻璃體腔注射BDNF，視神經(jīng)橫切顯示存活的RGC增多，細(xì)胞凋亡延緩[13]。但是外源性BDNF半衰期短，反復(fù)眼內(nèi)注射可能造成眼球損傷，增加眼內(nèi)感染風(fēng)險(xiǎn)。我們研究發(fā)現(xiàn)BDNF基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BMSC細(xì)胞分泌的BDNF明顯增強(qiáng)，且可持續(xù)表達(dá)5～6代。這為進(jìn)一步研究其對(duì)視網(wǎng)膜的保護(hù)作用奠定了基礎(chǔ)。Saito等[14]用腺相關(guān)病毒將BDNF基因轉(zhuǎn)入虹膜色素上皮細(xì)胞，然后將細(xì)胞移植入光損傷的大鼠模型視網(wǎng)膜下腔，移植細(xì)胞對(duì)感光細(xì)胞有顯著的保護(hù)作用，視乳頭附近多個(gè)位置的外核層較對(duì)照組厚，抑制TrkB-T1可降低移植細(xì)胞的保護(hù)作用。這提示通過(guò)基因工程增強(qiáng)眼內(nèi)細(xì)胞長(zhǎng)期表達(dá)BDNF，減少反復(fù)注射的風(fēng)險(xiǎn)。

圖1各組BMSC細(xì)胞BDNF mRNA表達(dá)變化bP<0.01 vs 空白對(duì)照組；dP<0.01 vs 陰性對(duì)照組。

圖2各組BMSC細(xì)胞BDNF的分泌變化bP<0.01 vs 空白對(duì)照組；dP<0.01 vs 陰性對(duì)照組。

本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組BMSC細(xì)胞隨著細(xì)胞傳代，BDNF mRNA表達(dá)和蛋白分泌逐漸下降。第7代與第8代，第8代和第9代的BDNF mRNA表達(dá)，組間兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第6代和第7代，第7代和第8代，第8代和第9代的BDNF的蛋白分泌組間兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能是由于體外傳代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞快速增殖，細(xì)胞內(nèi)BDNF基因的表達(dá)減弱或攜帶BDNF基因的細(xì)胞比例減少。這提示一方面可通過(guò)傳代的代數(shù)來(lái)控制移植細(xì)胞在眼內(nèi)BDNF的分泌表達(dá)。另一方面用于移植的轉(zhuǎn)染細(xì)胞不宜傳代5代以上。

綜上所述，通過(guò)基因工程增強(qiáng)BMSC細(xì)胞長(zhǎng)期表達(dá)BDNF，減少反復(fù)注射的風(fēng)險(xiǎn)。干細(xì)胞治療和基因治療有望為視網(wǎng)膜變性疾病的治療提供新的途徑。

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Changes of brain-derived neurotrophic factor expression in gene modified bone marrow mesenchymal stem cells

Mao-Song Xie,Guo-Xing Xu,Li-Bin Huang

Young and Middle-aged Talent Training Project of Fujian Provincial Health and Family Planning Commission (No.2014-ZQN-ZD-16)

Mao-Song Xie.Department of Ophthalmology,First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350005,Fujian Province,China.pandaxms1978@163.com

2016-05-09Accepted：2016-09-05

bone marrow mesenchymal stem cell; brain-derived neurotrophic factor; gene modified; retinal degenerative diseases; therapy

福建省衛(wèi)計(jì)委中青年骨干人才培養(yǎng)項(xiàng)目(No.2014-ZQN-ZD-16)

(350005)中國(guó)福建省福州市，福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科 福建省眼科研究所

謝茂松，博士，副教授，副主任醫(yī)師，研究方向：眼底病。

謝茂松.pandaxms1978@163.com

2016-05-09

2016-09-05

Department of Ophthalmology,First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350005,Fujian Province,China

Xie MS,Xu GX,Huang LB.Changes of brain-derived neurotrophic factor expression in gene modified bone marrow mesenchymal stem cells.Guoji Yanke Zazhi(Int Eye Sci) 2016;16(10):1816-1819

10.3980/j.issn.1672-5123.2016.10.07