光譜法研究胞外聚合物與四溴雙酚A的相互作用

包宜俊,楊存滿,李 穎,陸光華

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包宜俊,楊存滿,李 穎*,陸光華

(河海大學環(huán)境學院,淺水湖泊綜合治理與資源開發(fā)教育部重點實驗室,江蘇 南京 210098)

利用三維熒光光譜和紅外光譜研究污水處理廠活性污泥中萃取的胞外聚合物與四溴雙酚A之間的相互作用.結果顯示,活性污泥胞外聚合物中存在3個明顯的熒光峰,分別為,x/m=230/300nm(峰A)、x/m=240/350nm(峰B)和x/m=270/370nm(峰C).熒光滴定結果表明,3個熒光峰隨著四溴雙酚A的加入均發(fā)生不同程度的猝滅.修正的Stern-Volmer模型和Ryan-Weber非線性模型計算胞外聚合物與四溴雙酚A之間的結合常數(shù),二者間的結合常數(shù)值(lg)在4.23~6.27之間.紅外光譜和同步熒光結果顯示,胞外聚合物與四溴雙酚A 結合導致胞外聚合物原有的蛋白質(zhì)結構發(fā)生變化.同時,考察了不同環(huán)境條件(pH值、電導率以及離子)對兩者作用的影響.結果表明:pH值和離子變化對胞外聚合物與四溴雙酚A結合強度有影響,但電導率的變化影響并不顯著.

胞外聚合物；四溴雙酚A；三維熒光光譜；結合作用

四溴雙酚A(TBBA)是一種在世界范圍內(nèi)被廣泛應用的溴代阻燃劑.它是一種類似于持久性有機污染物的潛在環(huán)境內(nèi)分泌干擾物,能在環(huán)境和生物體內(nèi)累積,對環(huán)境和生物產(chǎn)生嚴重的影響,如干擾生物的激素系統(tǒng),影響骨骼和大腦發(fā)育等[1-3].污水處理作為TBBA進入環(huán)境前的重要消減環(huán)節(jié)尤為關鍵,若有大量的TBBA隨出水排放進入周圍環(huán)境,將對水生生物和人體健康造成潛在的危害.

活性污泥是應用最廣泛的廢水處理方法之一.活性污泥分泌的胞外聚合物(EPS)是微生物在生長和代謝過程中產(chǎn)生的一類高分子物質(zhì),主要由腐殖質(zhì)、多聚糖類、蛋白類和核酸類組成[4-5].EPS覆蓋在微生物細胞表面及填充在污泥絮體內(nèi)部空隙中,維持著污泥的結構和功能的完整性,在活性污泥系統(tǒng)中起著極其重要的作用[6].由于EPS表面存在大量的活性官能團和疏水區(qū)域,因此具有極大的吸附和絡合能力,能夠與廢水中存在的污染物結合,從而將污染物從水體中去除[7-9].Xu等[10]研究表明,EPS能夠通過蛋白組分的疏水作用結合磺胺甲嘧啶,且EPS蛋白組分二級結構發(fā)生顯著變化,肽鏈伸展導致的結構膨脹,更加有利于污染物的俘獲;鄭蕾等[11]研究結果表明,pH值可改變活性污泥EPS組分、濃度以及基團組成,從而改變EPS表面特性,最終導致污泥狀態(tài)改變.但是他們只是研究了污染物對EPS吸附能力以及pH值對EPS本身的影響,沒有考慮污染物與EPS的作用機制和水環(huán)境條件對反應體系的影響.本研究利用三維激發(fā)發(fā)射矩陣熒光(EEM)、同步熒光及傅里葉紅外光譜方法研究活性污泥EPS與TBBA的相互作用機制以及不同水環(huán)境條件對兩者相互作用的影響,為強化TBBA在活性污泥系統(tǒng)中的去除機理提供理論依據(jù).

四溴雙酚A(純度大于99%)購于梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司.腐殖酸購自于Sigma公司.蒽酮試劑,酒石酸鈉溶液,Fulin酚試劑,甲醇,鹽酸,氫氧化鈉,氯化鉀,硝酸鋁,硝酸鈣,硝酸鐵,離子交換樹脂(Cation exchange resin, CER)均為分析純,購于南京榮華科學器材有限公司.

電導率儀(雷磁,DSJ-308A,上海),高速冷凍離心機(湘智,TGL-16M,長沙),三維熒光光譜儀(Hitachi,F7000,日本),紫外可見分光光度計(Hach, Alpha-1506,美國),傅里葉紅外光譜儀(Bruker, Tensor27,德國).

1.2 實驗方法

1.2.1 EPS提取與測定 采自南京市江寧城市污水處理廠二沉池的活性污泥用離子交換樹脂法提取活性污泥胞外聚合物.將50mL活性污泥懸浮液以5000r/min離心15min,離心后舍棄上清液,用50mL NaCl溶液(0.1mol/L)洗滌2次.將洗滌過的污泥懸浮液置于50mL的磷酸緩沖溶液(pH 7.0)中.處理的污泥混合液轉移至提取容器中,同時加入一定量的離子交換樹脂(60g/g),在4℃下連續(xù)攪拌6h提取EPS.提取結束后將離子交換樹脂/污泥的混合液靜置3min,保證離子交換樹脂完全沉淀.將上層提取液在4 ℃下10000r/min離心30min,得到的上清液用0.45μm醋酸纖維素膜過濾,濾液即為EPS溶液.最后將該溶液在60 ℃干燥箱中烘干得到EPS固體.EPS中多糖采用蒽酮比色法測定[12],用葡萄糖作為標準.蛋白質(zhì)和腐殖酸采用改進Lowry法測定[13],分別用牛蛋白血清與腐殖酸作為標準.

1.2.2 熒光光譜實驗 將從活性污泥中提取的EPS固體用磷酸緩沖溶液配制成濃度為200mg/L的儲備液.移取5mL EPS溶液加入到一系列10mL比色管中,同時在每個比色管中加入不同體積TBBA溶液(1.0g/L),用磷酸緩沖液定容至10mL,得到TBBA濃度分別為2.5, 5, 7.5 , 10 , 12.5, 22.5, 25mg/L的混合溶液.為了保證EPS與TBBA充分結合,溶液振蕩2h后進行三維熒光以及同步熒光測定.設置對照實驗和平行實驗,測試結果取平均值.三維熒光光譜激發(fā)波長和發(fā)射波長范圍均為200~500nm;激發(fā)和發(fā)射狹縫設為2.5nm;掃描速度為12000nm/min.同步熒光光譜采集采用同步掃描波長從270~400nm;激發(fā)和發(fā)射間隔波長60nm;掃描速度為12000nm/min.

1.2.3 紅外光譜實驗 采用紅外光譜方法對EPS與TBBA結合前后構型變化進行分析.在配有DTGS KBr檢測器和衰減全反射(ATR)附件的FT-IR光譜儀進行紅外光譜測定,所測樣品與上述三維熒光光譜分析所用溶液相同.利用ATR方法記錄所有光譜,在分辨率4.0cm-1條件下掃描6次收集紅外光譜.儀器自帶軟件采集數(shù)據(jù), Origin8.0對數(shù)據(jù)進行分析.

1.2.4 環(huán)境條件實驗 移取5mL EPS儲備液到一系列10mL比色管中,同時在每個比色管中加入250μL TBBA溶液(1.0g/L),用磷酸緩沖液定容至10mL,得到待測溶液.使用1.0mol/L鹽酸和1.0mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)待測溶液pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,進行pH值條件的實驗.使用3.0mol/L KCl溶液調(diào)節(jié)待測溶液電導率分別為1800, 2000,2200,2400,2600, 2800,3000μS/cm,進行電導率條件的實驗.在待測溶液中分別加入50μL 0.01mol/L的Ca2+、Al3+、Fe3+離子進行不同離子條件的實驗.將上述混合溶液振蕩2h后進行三維熒光測定.設置對照實驗和平行實驗,測試結果取平均值.

1.3 數(shù)學模型分析

使用Stern-Volme方程[14]、修正的Stern- Volme方程[15]和Ryan-Weber非線性模型[16]分析EPS與TBBA的熒光猝滅機制,并計算其作用強度(即結合常數(shù)).

-Volme方程如下:

式中:0和分別為TBBA加入前后EPS所測得的熒光強度;SV為猝滅常數(shù);q為生物分子猝滅速率常數(shù);為分子的熒光壽命,通常對于生物大分子值為1.0×10-8s;為加入TBBA濃度.

修正的Stern-Volmer方程如下:

式中:是滴定前后熒光的變化值占初始熒光強度的比例;為結合常數(shù).

Ryan-Weber非線性模型如下:

式中:假設未加入TBBA時EPS的熒光強度為100.是EPS與對應濃度TBBA結合后的熒光強度相對初始熒光強度的百分值;end為滴定達到理論終點時的熒光強度相對初始熒光強度的百分值.為結合常數(shù);為加入TBBA濃度;c為EPS中配體的總濃度.

2 結果與討論

2.1 EPS的熒光特性研究

從圖1可以看出,活性污泥EPS有3個熒光吸收峰,分別為峰A(x/m=230/300nm)、峰B(x/m=240/350nm)和峰C(x/m=270/370nm).峰A位于I區(qū)(含芳環(huán)基團的類蛋白物質(zhì)I),峰B位于II區(qū)(含芳環(huán)基團的蛋白質(zhì)II區(qū)).峰C位于Ⅳ區(qū)(溶解性微生物副產(chǎn)物)[17-18].峰A、峰B和峰C都屬于類蛋白峰,與EPS中的芳環(huán)氨基酸結構有關[19-20].隨著TBBA濃度的增加,EPS峰A和峰B的熒光強度不斷降低.但峰C的熒光強度降低并不明顯,這主要是由于峰C為溶解性的微生物副產(chǎn)物,而TBBA與EPS的結合主要發(fā)生在類蛋白質(zhì)上的基團.EPS熒光峰的變化表明活性污泥EPS和TBBA發(fā)生了相互作用,導致EPS本身結構發(fā)生了變化.

2.2 EPS與TBBA作用機制研究

從圖2可以看出,隨著TBBA濃度的逐漸增大,3個熒光峰的值也逐漸增大,和TBBA濃度之間呈線性關系.峰A、峰B和峰C的猝滅速率常數(shù)q值是生物大分子與猝滅劑相互作用最大q值(2.0×1010L/(mol·s))的100~1980倍,說明TBBA對EPS的熒光猝滅不是由動態(tài)碰撞引起的,而是屬于靜態(tài)猝滅過程,即TBBA與EPS中的熒光基團生成不發(fā)熒光的絡合物.

表1表明:EPS與TBBA有較大的結合常數(shù),并生成穩(wěn)定的EPS-TBBA絡合物.其中類酪氨酸(峰A)的結合強度要大于其它2類蛋白峰,與苯、菲等有機污染物的結合常數(shù)相近[13].說明活性污泥中的EPS能夠?qū)ξ鬯锾幚磉^程中TBBA的遷移和歸趨產(chǎn)生影響.

2.3 TBBA對EPS結構變化影響

紅外光譜可以作為定性工具監(jiān)測污水處理廠活性污泥EPS化學基團,提供EPS 結構變化相關信息.圖3紅外光譜顯示,EPS結構中存在蛋白和多糖吸收峰,較弱的羧酸類和酚類吸收峰.3800~3000cm-1為EPS中蛋白和多糖的羥基伸縮振動[21-23],2360cm-1左右為NH的伸縮振動.1670,1540cm-1的強烈吸收為蛋白中酰胺I(主要是C=O伸縮振動)和酰胺II(C—N伸縮振動和—N—H變形振動)[21].與EPS相比,加入TBBA后EPS紅外譜圖發(fā)生了微弱的變化,EPS酰胺I峰從1670cm-1移至1645cm-1,TBBA與EPS中的C=O和C—N或—N—H基團結合,導致EPS的結構發(fā)生變化.

在利用紅外光譜研究EPS與TBBA結合前后的結構變化的同時,同步熒光光譜也被用于EPS結構變化的研究.通過測定EPS與TBBA作用后最大發(fā)射波長的變化,研究EPS的結構變化.由于EPS主要是由類蛋白質(zhì)組成,當Δ為60nm時,同步熒光可以得到色氨酸殘基的特性.從圖4可以看出,隨著TBBA濃度增加,EPS同步熒光光譜強度有規(guī)律的減弱,同時在290nm處的同步熒光峰發(fā)生紅移.由于TBBA進入EPS蛋白中色氨酸殘基的疏水區(qū)域,導致肽鏈伸展,從而使色氨酸暴露在水溶液中.色氨酸殘基處于相對親水的微環(huán)境中,使得同步熒光峰發(fā)生紅移[24],表明TBBA與EPS官能團之間結合,改變了EPS蛋白質(zhì)自身的結構.通過紅外光譜以及同步熒光光譜的研究,可以得知污水處理廠活性污泥產(chǎn)生的EPS中的蛋白質(zhì)能與TBBA結合,從而降低其在污水中的濃度.

2.4 離子對EPS-TBBA體系結合強度的影響

由于污水中會同時存在多種物質(zhì),可能和TBBA發(fā)生競爭作用,降低EPS與TBBA的結合強度.選取城市污水中檢出率較高的3種金屬離子Ca2+、Al3+、Fe3+,研究其對EPS-TBBA體系結合強度的影響.從表2中可知,Ca2+的存在使EPS-TBBA體系的結合增強,說明Ca2+的存在能夠促進EPS與TBBA的結合.而Al3+的存在則導致結合常數(shù)的減低,說明Al3+能夠和TBBA產(chǎn)生競爭作用,降低EPS與TBBA的結合.2種模型計算Fe3+的存在下對EPS-TBBA體系的結合強度的變化稍有差異性,修正的Stern-Volmer模型顯示Fe3+的存在一定程度上增強了體系的結合.

表2 不同離子對EPS-TBBA體系結合常數(shù)影響Table 2 Binding constant (lgK) of EPS-TBBA system at different ions

2.5 離子強度對EPS-TBBA體系結合強度的影響

從圖5可以看出,在不同電導率情況下,體系的熒光強度并沒有明顯變化.計算不同電導率條件下EPS-TBBA體系的結合常數(shù),并采用SPSS軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,客觀地反映離子強度對結合常數(shù)的影響程度,皮爾遜系數(shù)(p)是一個介于-1.0到1.0之間的無量綱指數(shù),反映了2個參數(shù)之間的相關性方向與強度,其中-1.0表示完美負相關,1.0表示完美正相關,0表示無相關性.統(tǒng)計結果見表3,2種模型下的p值均小于0.75,且值均大于0.05,即電導率的變化對體系結合強度沒有顯著影響(表3).說明離子強度的變化對體系的結合強度影響相對較小.

表3 電導率與EPS-TBBA體系結合常數(shù)線性相關的統(tǒng)計結果Table 3 Statistical results of linear correlations between conductivity and binding constant

2.6 pH值對EPS-TBBA體系結合強度的影響

不同pH值條件下EPS以及EPS-TBBA體系熒光強度如圖6所示.從圖6可以看出猝滅作用的影響,當pH值在3.0~6.0時,EPS熒光強度顯著增強;當pH值在6.0~9.0時,EPS熒光強度趨于穩(wěn)定.EPS-TBBA體系熒光強度隨pH值的增加逐漸降低,且在pH=8.0時達到最小.表4為不同pH值條件下EPS與TBBA結合強度值.由表4可知,不同pH值條件下2種模型擬合得到的結果與之前得到的結合常數(shù)值相比均有變化,相關性分析結果顯示(表5),2種模型下的p值均小于0.75,且值均大于0.05.說明pH值與結合強度值沒有顯著相關性,但pH值的變化一定程度上也影響了EPS與TBBA的結合強度.在污水處理過程中,水體的酸堿度會影響到活性污泥分泌出的EPS與TBBA的結合,影響TBBA的去除率.pH值對EPS-TBBA結合的影響主要是由于pH值的變化會改變TBBA在水體中的離子狀態(tài),以及EPS的表面帶電性和分子的構象,從而導致相互作用的變化[25].

表4 不同pH值對EPS-TBBA體系結合常數(shù)的影響Table 4 Binding constant (lgK) of EPS-TBBA system at different pH

3 結論

3.1 EPS中熒光峰能被TBBA明顯猝滅,修正的Stern-Volmer方程和Ryan-Weber非線性模型擬合得到的結合常數(shù)表明,EPS與TBBA間存在較強的結合作用,說明TBBA能夠被活性污泥分泌的EPS有效的富集.

3.2 紅外光譜和同步熒光光譜分析結果表明,EPS與TBBA結合后,EPS中含有的蛋白質(zhì)原有結構由于和TBBA作用發(fā)生了改變.

3.3 pH值與結合強度值沒有顯著相關性,但pH值的變化一定程度上也影響了EPS與TBBA的結合強度.3種金屬離子對體系的影響各不相同,Ca2+使EPS-TBBA體系的結合增強,Al3+的存在則導致結合常數(shù)的減低,而Fe3+能夠顯著影響體系的結合強度.電導率條件的p值均小于0.75,且值均大于0.05,即離子強度的變化對體系結合強度沒有顯著影響.

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* 責任作者, 副教授, hj6688@hhu.edu.cn

Spectroscopic methods study of the interaction of extracellular polymeric substance and tetrabromobisphenol A

BAO Yi-jun, YANG Cun-man, LI Ying*, LU Guang-hua

(Key Laboratory of Integrated Regulation and Resource Development on Shallow Lakes, Ministry of Education, College of Environment, HoHai University, Nanjing 210098, China)., 2016,36(6)：1773~1779

Three-dimensional fluorescence spectroscopy and infrared spectroscopy were used to investigatethe interaction between tetrabromobisphenol A (TBBA) and extracellular polymeric(EPS) from sludge. There were three particular fluorescence peaks in spectra of EPS,x/m=230/300nm (peak A),x/m=240/350nm (peak B) andx/m=270/370nm (peak C), respectively. The results of fluorescence titration revealed that the three fluorescence peaks of EPS could be quenched by TBBA. The binging constants (lg) were calculated by the modified Stern-Volmer model and the Ryan-Weber model, ranged from 4.23 to 6.27. Infrared spectroscopy and synchronous fluorescence spectroscopy indicated the combination of EPS with TBBA has led to a change in EPS structure. The effect of environmental condition (i.e. pH, ions, and conductivity) on TBBA binding with EPS were evaluated. The results show that pH and ions affected binding affinity, but the effect ofconductivitywas minor.

EPS；TBBA；three-dimensional fluorescence spectrum；binding

X131.2

A

1000-6923(2016)06-1773-07

包宜俊(1991-),男,江蘇鎮(zhèn)江人,河海大學碩士研究生,主要從事環(huán)境污染化學研究.發(fā)表論文1篇.

2015-11-06

國家自然科學基金資助項目(51209068,51479067);江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目