北京大氣PM2.5對A549細胞炎性因子及DNA損傷的毒性

焦周光,付緒磊,溫占波*,李勁松*,李 娜,張 柯,王 潔,胡凌飛

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北京大氣PM2.5對A549細胞炎性因子及DNA損傷的毒性

焦周光1,付緒磊2,溫占波1*,李勁松1*,李 娜1,張 柯1,王 潔1,胡凌飛1

(1.軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全國家重點實驗室,北京 100071；2.渤海大學食品科學與工程學院,遼寧 錦州 121013)

為探討大氣PM2.5及其不同組分對人肺上皮細胞A549的毒性作用及其劑量-反應關系,將前期采集的PM2.5顆粒物用不同方法進一步制備PM2.5水溶性組分、PM2.5脂溶性組分和PM2.5單純顆粒物,將制備的PM2.5顆粒物及其組分以不同濃度對A549細胞染毒,用MTS法分別在染毒6, 10, 24, 48, 72h后測定細胞活力,染毒24h后用ELISA及RT-QPCR法測定IL-6和TNF-α表達量,AP位點計數法測定細胞DNA損傷情況.結果表明: 除PM2.5水溶性組分外,其余染毒樣本高濃度染毒時始終對細胞生長表現(xiàn)出抑制作用,其中低濃度染毒時可在較短時間對細胞生長表現(xiàn)出抑制作用,染毒時間較長時抑制作用減弱或消失,PM2.5水溶性組分對細胞生長抑制作用并不顯著;除PM2.5水溶性組分外,其余染毒樣本都顯著升高了IL-6mRNA的相對表達量和IL-6蛋白的分泌,除PM2.5脂溶性組分外,其余染毒樣本都顯著升高了TNF-α mRNA的相對表達量;除PM2.5水溶性組分外,其余染毒樣本都顯著提高了DNA堿基缺失程度.總的來說,PM2.5水溶性組分在抑制細胞活力、造成炎性損傷及DNA損傷方面作用相對較小,而PM2.5所產生的毒性作用并不僅限于其所吸附的復雜成分,其中作為載體的固體核心顆粒對機體可能造成的毒性作用也不容忽視.

PM2.5；組分；A549；細胞活力；炎性因子；DNA損傷

PM2.5粒徑小,比表面積大,能夠吸附大量的毒害物質,可以深入支氣管及肺泡,因而對人體健康影響巨大[1-3].流行病學調查表明,以PM2.5為主的空氣顆粒物污染可以導致呼吸系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病及人群過早死亡的發(fā)生[4-7].由于有害的空氣污染物主要在肺表面釋放并吸附于肺上皮細胞,因而肺臟,尤其是肺上皮細胞被認為是吸入顆粒物的主要生物靶目標[8-9].PM2.5來源廣泛,其吸附的各種化學組分成分復雜[10],有研究表明PM2.5吸附的有機化合物和無機組分與其生物學效應密切相關[11-13],此前已有研究人員對PM2.5的水溶性組分和脂溶性組分的生物毒性作用進行了有益的探索[10,14-18],但對其以碳質為主的固體組分的生物毒性研究多以碳黑來代替[19-20],并不能完全代表其單純固體組分的生物毒性作用,因而對于由PM2.5造成的疾病損傷其吸附成分和固體組分哪個損傷作用更大尚值得探討.本研究采集了北京城區(qū)大氣PM2.5顆粒物樣本,并在PM2.5顆粒物樣本(文中將洗脫下來的PM2.5稱為PM2.5完全顆粒物)的基礎上另外制備了PM2.5水溶性組分、PM2.5脂溶性組分及PM2.5單純顆粒物(主要成分為PM2.5中的不溶性固體組分),以人肺上皮A549細胞為研究對象,使用PM2.5顆粒物及其不同組分樣品對A549細胞染毒,并從細胞活力、炎性損傷及DNA損傷三方面來評估及比較各染毒樣本對A549細胞染毒后對研究對象所產生的毒性作用.

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

PM10/PM2.5大流量采樣器(Thermo),石英濾膜(PALL),B2200S超聲清洗器(上海必能信超聲有限公司),3-18K低溫離心機(Sigma),冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司),CO2培養(yǎng)箱(NUAIRE),CK40倒置顯微鏡(OLYMPUS),MK-3酶標儀(Thermo),0.2μm濾器(PALL),熒光定量PCR儀(Roche),DMEM高糖培養(yǎng)基(GIBCO),胎牛血清(PAN),MTS試劑(Promega),胰蛋白酶(Amresco),炎性損傷指標測定試劑盒(IL-6、TNF-α,武漢博士德生物有限公司),DNA提取試劑盒(TAKARA),RNA提取試劑盒(TAKARA), STBR GreenⅠ熒光染料(TAKARA),損傷定量試劑盒-AP位點計數(日本同仁化學研究所).

1.2 顆粒物的采集

采樣地點位于北京城區(qū)西南三環(huán)到四環(huán)之間,靠近東大街和豐管路,周邊交通流量較大且分布有文體機構、大型商場及各類機關單位,無工業(yè)污染源,采樣器距離地面約18m,采集的PM2.5顆粒物可較好代表北京城區(qū)情況.采用PM10/ PM2.5大流量采樣器連續(xù)采樣30d(2014年5月28日~2014年6月26日),采用PM2.5切割頭采集PM2.5樣本,采樣流量為1.13m3/min,每23.5h換一次采樣濾膜.采樣濾膜為(8×10)英寸的石英濾膜,采樣前被置于馬弗爐中600℃灼燒2h以除去可能存在的有機物質,采樣后將濾膜置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.3 PM2.5完全顆粒物及不同組分的制備

采樣結束后,將吸附有顆粒物的濾膜剪成1cm2左右小塊并置于超純水中超聲震蕩2.5h(超聲4.5min,停5min,依次循環(huán),使水溫保持在20℃以下),超聲結束后將濾膜吸附的水擠出后經六層紗布過濾至100mL玻璃瓶,-20℃冷凍后經冷凍干燥即可得PM2.5完全顆粒物[21].

依據相關文獻[22],另外制備PM2.5水溶性組分及PM2.5脂溶性組分.PM2.5水溶性組分制備方法:將適量PM2.5完全顆粒物置于超純水中,充分震蕩后以5000r/min低溫離心5min,用0.2μm濾器過濾上清液可得PM2.5水溶性成分的水溶液,將其冷凍干燥后可得PM2.5水溶性組分;PM2.5脂溶性組分制備方法:將適量采樣后濾膜剪成小塊后用濾紙包好并置于索氏提取器用二氯甲烷萃取即得PM2.5脂溶性組分的有機溶液,于通風櫥中揮發(fā)掉二氯甲烷后可得PM2.5脂溶性組分.將PM2.5完全顆粒物高壓滅菌并分別去除水溶性組分、脂溶性組分后將剩余顆粒物經180℃高溫烘烤3h即可得到PM2.5單純顆粒物.

1.4 細胞培養(yǎng)

人肺上皮細胞A549(軍事醫(yī)學科學院)用含10%胎牛血清和雙抗(青鏈霉素各100U/mL)的DMEM培養(yǎng)基,于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng),當細胞融合至80%時用0.25%胰蛋白酶消化、傳代及用于試驗.

1.5 各染毒樣本染毒母液制備

分別稱取適量PM2.5完全顆粒物和PM2.5單純顆粒物用不含血清(含雙抗)的DMEM培養(yǎng)基制備16mg/mL的染毒母液備用(4℃存儲,72h內使用),根據制備的PM2.5水溶性組分質量用無菌生理鹽水配制成100mg/mL的染毒母液備用(4℃存儲),PM2.5脂溶性組分用二甲基亞砜(DMSO)配制成100mg/mL的染毒母液備用,方法與水溶性組分制備方法類似.

將PM2.5完全顆粒物、PM2.5水溶性組分、PM2.5脂溶性組分及PM2.5單純顆粒物染毒母液在使用前用細胞破碎儀超聲裂解5min,依次取適量各染毒母液加入10%胎牛血清細胞培養(yǎng)基使各染毒樣本染毒液濃度為400μg/mL,在400μg/ mL的基礎上再進一步稀釋為200, 100, 50, 10μg/ mL,PM2.5完全顆粒物和PM2.5單純顆粒物以無血清培養(yǎng)基為溶劑對照,PM2.5水溶性組分以生理鹽水為溶劑對照,PM2.5脂溶性組分以DMSO為溶劑對照.

1.6 細胞毒性試驗

將處于對數生長期的A549細胞消化后稀釋為5×104/mL的細胞懸液,將細胞懸液以100μL/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后棄上清,溶劑對照, 10, 50, 100, 200, 400μg/mL)染毒液以100μL/孔分別加入96孔細胞培養(yǎng)板,另外設定無細胞無染毒液的空白對照孔,每個濃度設定5個平行孔,分別培養(yǎng)6, 10, 24, 48, 72h后,棄上清,用PBS洗3遍,每孔加入100μL新鮮培養(yǎng)基和20μL MTS試劑,繼續(xù)培養(yǎng)3.5h后,用酶標儀于492nm處測定其OD值,各處理組的OD值能代表測定時細胞的活力.另外,計算染毒后相比于溶劑對照組的細胞存活率,細胞存活率(%)=(OD實驗-OD空白)/(OD對照-OD空白)′100%.

1.7 炎性損傷指標的測定

將處于對數生長期的A549細胞消化后以3×105/孔接種于6孔板培養(yǎng),每孔3mL培養(yǎng)基,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后棄上清,將各染毒樣本的不同濃度組(溶劑對照, 10, 50, 100, 200, 400μg/mL)染毒液以3mL/孔分別加入6孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24h.

1.7.1 炎性因子IL-6、TNF-α的分泌量檢測 將染毒結束后的細胞培養(yǎng)上清以3000r/min離心15min后留上清,用ELISA法按照相應試劑盒操作說明書通過酶標儀于450nm處測定各孔的吸光度值,然后根據標準品吸光度值繪標準曲線進而計算各處理組培養(yǎng)上清中IL-6、TNF-α的濃度,試驗時每種處理設定3個平行孔;

1.7.2 炎性因子IL-6、TNF-α的mRNA表達量檢測 對染毒后細胞采用RT-QPCR技術(SYBR GreenⅠ法)檢測細胞因子mRNA的表達,按照相關試劑盒使用說明書,首先提取RNA后,經過RT反轉錄,熒光定量PCR法檢測mRNA的表達,每種處理設定三個平行孔.選取甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參,內參所用引物參照文獻[23]設計,根據IL-6和TNF-α的mRNA序列(GenBank序列號依次為: NM_000600.4、NM_000594.3)利用Primer Premier 5.0設計引物,引物由北京博邁德公司合成.GAPDH引物序列為正義鏈:CCATGGAGAAGGCTGGGG,反義鏈:CAAAGTTGTCATGGATGACC;IL-6引物序列為正義鏈:GAGTAACATGTGTGAAAGCAGC,反義鏈:CCAGGCAAGTCTCCTCATTGAATCC; TNF-α序列為正義鏈:ACCACGCTCTTCTG- CCTGCTG,反義鏈:GAGGGTTTGCTACAACA- TGG;擴增產物GAPDH、IL-6、TNF-α片段長度分別為194, 116, 157bp.PCR反應程序在熒光定量PCR儀上進行,擴增條件為:預擴增95℃ 30s;然后95℃ 5s,60℃ 40s,40個循環(huán),每個循環(huán)檢測一次熒光變化;做熔解曲線95℃ 0s, 20℃/s,65℃ 15s, 20℃/s,95℃ 0s, 0.1℃/s,整個過程連續(xù)檢測熒光變化,熔解曲線可用于驗證擴增是否具特異性.根絕內參C值,利用2-DDCt法計算各處理組目的基因的表達量相當于溶劑對照組的倍數.

1.8 染毒后細胞DNA損傷測定

細胞培養(yǎng)及染毒方式同炎性因子指標測定時的培養(yǎng)方法.染毒24h后,棄上清,根據試劑盒使用說明書對染毒后的細胞提取DNA,然后用微量分光光度計對提取的DNA濃度進行檢測,并用TE buffer調節(jié)DNA濃度為100μg/mL,然后根據DNA損傷定量試劑盒操作說明對提取的DNA堿基缺失情況進行測定,用酶標儀在630nm處測定各孔吸光度值,根據標準曲線可以計算出每種處理造成的DNA堿基缺失個數(個/105堿基),每種處理設定3個平行孔.

1.9 統(tǒng)計與分析

先采用Excel 2010繪制標準曲線及整理數據,然后用SAS 9.2軟件進行統(tǒng)計學處理,試驗結果以“平均數±標準差”表示并作柱狀圖,采用析因設計的分析方法對各因素的影響進行統(tǒng)計學分析,統(tǒng)計檢驗水準<0.05時差異有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 不同濃度PM2.5各樣本對A549細胞染毒后活力及存活率變化

2.1.1 不同濃度PM各樣本對A549細胞活力的影響 如圖1所示,隨著時間的延長,各染毒組細胞活力總體都呈現(xiàn)增長的趨勢,但除水溶性組分外,其余樣本高濃度染毒時都表現(xiàn)出了比低濃度組更強的抑制細胞生長的作用.PM2.5完全顆粒物染毒6h時低濃度染毒組(10, 50μg/mL)即表現(xiàn)出對細胞生長的抑制作用,染毒組細胞活力顯著低于溶劑對照組,染毒48h及以后低濃度染毒組對細胞生長不表現(xiàn)出抑制作用,而較高染毒濃度組(100μg/mL及以上)始終表現(xiàn)出較強的抑制細胞生長的作用;PM2.5單純顆粒物在染毒6h時即對細胞生長表現(xiàn)出抑制作用,10h時對細胞生長的抑制作用有所緩解,而后又都表現(xiàn)出毒性作用,至染毒72h時,低濃度染毒組(10, 50μg/mL)對細胞生長抑制作用消失,高濃度染毒組始終對細胞生長表現(xiàn)出抑制作用;PM2.5水溶性組分各染毒濃度組始終沒有對細胞生長表現(xiàn)出抑制作用,僅個別染毒濃度組在48h時對細胞生長表現(xiàn)出促進作用;PM2.5脂溶性組分最低染毒濃度組(10μg/mL)始終沒有表現(xiàn)出對細胞生長的抑制作用,較低濃度染毒組(100μg/mL)在6h時即表現(xiàn)出對細胞生長的抑制作用,隨著時間的延長,至染毒時間為72h時對細胞生長的抑制作用消失,高濃度染毒組(200, 400μg/mL)對細胞生長始終表現(xiàn)出抑制作用,且隨著時間的延長,高濃度染毒組細胞活力跟溶劑對照組相比差距越來越大.

2.1.2 不同濃度PM2.5各樣本對A549細胞死亡率的影響 如表1所示,對于PM2.5單純顆粒物,除染毒10h外,其他時間點其對應的細胞存活率都顯著低于相同條件下的PM2.5完全顆粒物;對于PM2.5水溶性組分,在各個時間點其對應的細胞存活率都顯著高于相同條件下的PM2.5完全顆粒物;對于PM2.5脂溶性組分,其高濃度染毒組(200, 400μg/mL)對應的細胞存活率始終顯著低于相同條件下的PM2.5完全顆粒物,而其他染毒濃度組對應的細胞存活率則表現(xiàn)為不小于相同條件下的PM2.5完全顆粒物.

表1 PM2.5完全顆粒物、單純顆粒物、水溶性組分、脂溶性組分對A549細胞染毒后細胞存活率Table 1 The effects of original PM2.5, pure particles, water-soluble, fat-soluble on cell survival

注:細胞染毒后與同一染毒時間的PM2.5完全顆粒物染毒組相比,*為<0.05,**<0.01.

2.2 不同濃度PM2.5各樣本染毒24h后對A549細胞炎性因子IL-6和TNF-α分泌量和表達的影響

2.2.1 不同濃度PM2.5各樣本染毒24h后對A549細胞IL-6分泌量的影響 不同濃度PM2.5各染毒樣本對A549細胞染毒后細胞培養(yǎng)上清中IL-6分泌量如圖2所示,在染毒濃度為100μg/mL及以上時,PM2.5完全顆粒物染毒后細胞培養(yǎng)上清中IL-6分泌量顯著高于溶劑對照組,染毒濃度在50μg/mL及以上時,PM2.5單純顆粒物和PM2.5脂溶性組分染毒組細胞培養(yǎng)上清中IL-6分泌量顯著高于溶劑對照組,但PM2.5水溶性組分各染毒濃度對應細胞培養(yǎng)上清中IL-6分泌量相比于溶劑對照組差異始終不顯著.

如圖2所示,PM2.5單純顆粒物染毒后上清IL-6含量與同濃度的PM2.5完全顆粒物相比差異不顯著;PM2.5水溶性組分染毒后上清中IL-6含量與同濃度PM2.5完全顆粒物相比差異顯著,在100μg/mL及以上濃度染毒時上清中IL-6含量顯著低于同濃度PM2.5完全顆粒物;PM2.5脂溶性組分在100μg/mL染毒濃度時上清中IL-6含量顯著低于同濃度PM2.5完全顆粒物,其余濃度染毒時上清中IL-6含量與同濃度PM2.5完全顆粒物相比差異不顯著.

2.2.2 不同濃度PM2.5各樣本染毒24h后對A549細胞TNF-α分泌量的影響 用PM2.5各染毒樣本對A549細胞染毒后,各溶劑對照組及各不同處理組的細胞培養(yǎng)上清中能檢測到TNF-α的含量幾乎為零.

2.2.3 PM2.5各樣本染毒24h后對A549細胞IL-6mRNA相對表達量的影響 以GAPDH為內參,用相對熒光定量PCR法測定的各染毒樣本染毒后細胞IL-6mRNA相對表達量如圖3所示,除PM2.5水溶性組分和PM2.5脂溶性組分外,其余染毒樣本在50μg/mL及以上染毒濃度時都顯著增加了A549細胞IL-6mRNA的相對表達量,其中PM2.5完全顆粒物和PM2.5單純顆粒物高濃度染毒時IL-6mRNA的表達量可達溶劑對照組的50倍以上.

圖3顯示,PM2.5單純顆粒物在50μg/mL及以上染毒濃度時其對應細胞IL-6mRNA相對表達量顯著高于同濃度的PM2.5完全顆粒物;而PM2.5水溶性組分和PM2.5脂溶性組分在染毒濃度為50μg/mL及以上時其IL-6mRNA相對表達量顯著低于同濃度組的PM2.5完全顆粒物.

2.2.4 PM2.5各樣本染毒24h后對A549細胞TNF-α mRNA相對表達量的影響 以GAPDH為內參,用相對熒光定量PCR法測定的各處理組TNF-α mRNA相對表達量如圖4所示,除PM2.5脂溶性組分外,其余樣本染毒組TNF-α mRNA相對表達量都顯著高于溶劑對照組,而PM2.5脂溶性組分各染毒濃度TNF-α mRNA相對表達量顯著低于溶劑對照組.

圖4顯示,PM2.5單純顆粒物染毒后在10μg/mL及以上染毒濃度時TNF-α mRNA相對表達量顯著高于同濃度的PM2.5完全顆粒物; PM2.5水溶性組分在染毒濃度為10μg/mL時其TNF-α mRNA相對表達量顯著高于同濃度PM2.5完全顆粒物,在染毒濃度為100μg/mL及以上時TNF-α mRNA相對表達量顯著低于同濃度的PM2.5完全顆粒物;PM2.5脂溶性組分在染毒濃度為10μg/mL及以上時TNF-α mRNA相對表達量顯著低于同濃度PM2.5完全顆粒物.

2.3 不同濃度PM2.5各樣本染毒24h后對A549細胞DNA損傷的影響

不同濃度PM2.5各樣本對A549細胞基因組DNA造成的氧化損傷情況如圖5所示,相比于溶劑對照組,除PM2.5水溶性組分外,其余樣本在染毒濃度為100μg/mL及以上時細胞基因組DNA堿基缺失增加顯著.

此外,圖5顯示,PM2.5水溶性組分在染毒濃度為100μg/mL及以上時其造成的DNA損傷程度顯著低于同濃度PM2.5完全顆粒物,PM2.5脂溶性組分在染毒濃度為100μg/mL時其造成的DNA損傷程度顯著低于同濃度PM2.5完全顆粒物,PM2.5單純顆粒物與PM2.5完全顆粒物相比造成的DNA損傷程度差異不顯著.

3 討論

PM2.5成分復雜,其主要由可溶性鹽、金屬元素、有機物質、碳質成分和生物組分等組成[24-25].根據PM2.5各組分樣品的制備過程及前期研究結果易知PM2.5水溶性組分主要為PM2.5完全顆粒物中的可溶性鹽、可溶性金屬離子等成分,PM2.5脂溶性組分主要為其中的有機物質,PM2.5單純顆粒物主要為其中的碳質組分.本研究制備了PM2.5完全顆粒物、PM2.5水溶性組分、PM2.5脂溶性組分和PM2.5單純顆粒物,并從細胞活力、炎性損傷和DNA損傷3個方面對比研究了各不同組分樣本對肺上皮細胞的影響,以探究PM2.5顆粒物不同成分可能對細胞造成的毒性作用.為便于與其他科研工作者的研究結果比較及結合MTS測定結果(從圖1可以看出,染毒48h及以后細胞增長速度已經較慢,24h時細胞增長速度較快,生長狀況較好),本研究中除MTS外,其余實驗皆染毒24h.本研究中,除PM2.5水溶性組分外,其余組分高濃度(200, 400μg/mL)染毒時都在較短時間(6h)內即對肺上皮細胞生長表現(xiàn)出毒性作用,而低濃度(10, 50μg/mL)染毒組在較短時間時對細胞生長可表現(xiàn)出毒性作用,隨著染毒時間的延長,其毒性作用逐漸減弱或消失;但隨著染毒時間的延長,高濃度染毒組對應的細胞活力跟溶劑對照組相比差距越來越大.另外,從存活率的結果來看,PM2.5脂溶性組分和PM2.5單純顆粒物在高濃度染毒時其對應細胞的存活率顯著低于PM2.5完全顆粒物,而PM2.5水溶性組分對應的細胞存活始終顯著高于PM2.5完全顆粒物.目前關于PM2.5不同組分樣本在不同時間點對細胞活力影響的研究還比較少,本研究結果顯示,除PM2.5水溶性組分外,其余PM2.5各樣本低劑量時對細胞在短時間內產生毒性作用,高劑量時則具有時間反應關系,這可能由于低劑量染毒時顆粒物對細胞影響不是很大,雖然剛開始時可以表現(xiàn)出抑制細胞生長的作用,但隨著染毒時間的延長細胞逐漸分解掉部分影響細胞活力的物質或逐漸適應不太惡劣的生長環(huán)境,而高劑量染毒組始終給細胞造成了一種極為惡劣的生長環(huán)境,因而細胞活力相比于溶劑對照組越來越弱.

IL-6和TNF-α是兩種重要的炎性相關細胞因子,TNF-α作為前炎癥因子,在炎癥起始階段起著重要作用[26],其作用于肺上皮細胞、內皮細胞或成纖維母細胞后可促使后者分泌粘附分子和IL-6、IL8等細胞因子[27],IL-6一方面可表現(xiàn)趨化作用,趨化免疫細胞從而調節(jié)炎癥反應;另一方面也可以作為一種抗炎因子,調節(jié)顆粒物暴露后引起的肺部炎癥及纖維化過程[28].有研究認為IL-6可以通過抑制TNF-α、IL-1等促炎因子產生,進而抑制炎癥反應無限擴大[29-30].本研究用ELISA法和RT-QPCR法分別檢測了染毒后細胞培養(yǎng)上清中IL-6和TNF-α的蛋白含量和染毒后胞內IL-6和TNF-α mRNA的表達量.ELISA檢測結果顯示除PM2.5水溶性組分外,其余染毒樣本較高染毒濃度(100μg/mL及以上)顯著增加了細胞培養(yǎng)上清中IL-6的分泌量,從100μg/mL染毒組的對比結果來看,PM2.5完全顆粒物和PM2.5單純顆粒物升高細胞培養(yǎng)上清中IL-6分泌量的作用可能強于PM2.5脂溶性組分;各染毒樣本對細胞染毒后并未在細胞培養(yǎng)上清中檢測到TNF-α的存在,可能是上清中TNF-α濃度低于試劑盒檢測下限所致.在RT-QPCR檢測結果中,結合IL-6分泌情況推測IL-6mRNA測定結果可能是因為在染毒24h時PM2.5脂溶性組分染毒組對應的細胞IL-6mRNA表達量已經開始下降;TNF-α mRNA檢測結果顯示,除PM2.5脂溶性組分外,其余染毒樣本都顯著升高了細胞內TNF-α mRNA相對表達量.此前已有國內外研究人員[19,23,31]研究證實PM2.5完全顆粒物可以顯著升高細胞培養(yǎng)上清中IL-6濃度和/或胞內IL-6mRNA表達量,該研究與之基本相一致;此前亦有研究人員[23,31-32]證實PM2.5完全顆粒物可以顯著升高細胞培養(yǎng)上清中TNF-α濃度和/或胞內TNF-α mRNA表達量,本研究中包括PM2.5完全顆粒物在內某些樣本染毒后胞內TNF-α mRNA相對表達量確有顯著升高,與前人研究結果相一致,但各樣本染毒后并未在細胞培養(yǎng)上清中檢測到TNF-α的存在,在進行RT-QPCR反應時,相同模板TNF-α mRNA對應的Ct值均不同程度大于IL-6mRNA對應的Ct值,因而胞內TNF-α的mRNA表達量必然低于IL-6,此前有研究[19]表明粗顆粒物和細顆粒物對細胞染毒24h后上清中TNF-α分泌量都低于染毒后5h上清中分泌量,因此推測該研究中未在上清中檢測到-α可能由于24h時細胞分泌到胞外的TNF-α量已經較少及高濃度染毒時細胞死亡較多所致.從炎性因子和上述MTS測定結果來看,PM2.5單純顆粒物可能比PM2.5完全顆粒物有著更強的抑制細胞生長和促進炎性因子表達的作用,本研究中各樣本間的比較皆是在同質量濃度下的比較,同質量的PM2.5單純顆粒物相比于PM2.5完全顆粒物有著更多數量的碳核心顆粒,因而推測在抑制細胞活力和促進細胞產生炎癥反應方面跟細胞接觸到的碳核心顆粒數量可能起著很大作用.

PM2.5可導致細胞內活性氧(ROS)的增加[33-34], DNA的氧化損傷與ROS氧化作用密切相關,氧化應激誘導的DNA損傷是城市顆粒物空氣污染的重要作用[35-36],DNA氧化損傷可以作為氧化應激及相關疾病的生物標志物[35],而且自由基相關的DNA和蛋白損傷被認為在癌癥、動脈粥樣硬化、關節(jié)炎和神經紊亂等年齡相關的疾病發(fā)展中起著重要作用[37].DNA氧化損傷后會產生鏈斷裂、各種糖修飾及單個無堿基位點(AP位點)等,其中AP位點是由ROS產生的DNA損傷的主要類型之一[38-39],該研究通過利用醛反應性探針特異性地與AP位點的開環(huán)上醛基反應,對各染毒樣本造成A549細胞DNA氧化損傷后形成的AP位點數進行了定量檢測,本研究提示PM2.5水溶性組分并沒有造成DNA堿基缺失的顯著增加,其較高染毒濃度(100μg/mL及以上)所造成的DNA堿基缺失程度弱于PM2.5完全顆粒物.

4 結論

4.1 除PM2.5水溶性組分外,其余染毒樣本都對A549細胞活力影響較大,且在高濃度染毒時始終對細胞生長表現(xiàn)出抑制作用,而低濃度染毒時則在較短時間對細胞生長表現(xiàn)出抑制作用,在較長染毒時間時抑制作用逐漸消失.

4.2 除PM2.5水溶性組分外,其余染毒樣本對應的A549細胞IL-6mRNA的相對表達量和/或IL-6蛋白的分泌都顯著升高,其中促進IL- 6mRNA相對表達量升高的作用依次為:PM2.5單純顆粒物>PM2.5完全顆粒物>PM2.5脂溶性組分;除PM2.5脂溶性組分外,其余染毒樣本都顯著升高了TNF-α mRNA的相對表達量,其中促進TNF-α mRNA相對表達量升高的作用依次為: PM2.5單純顆粒物>PM2.5完全顆粒物>PM2.5水溶性組分.

4.3 除PM2.5水溶性組分外,其余染毒樣本都顯著增加了A549細胞DNA堿基缺失,并且在此方面,PM2.5完全顆粒物、PM2.5單純顆粒物和PM2.5脂溶性組分差異很小.

4.4 總體上來看,PM2.5水溶性組分在抑制細胞活力、造成細胞炎性損傷及DNA損傷方面作用相對較小;PM2.5脂溶性組分與PM2.5完全顆粒物表現(xiàn)出的毒性作用幾乎一致.PM2.5單純顆粒物比PM2.5完全顆粒物可能有更大的毒性作用,可見作為載體的固體核心顆粒(PM2.5單純顆粒物)在對機體產生毒性作用時也起著相當大的作用.

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致謝：感謝環(huán)境科學研究院高健博士在PM2.5顆粒物采集中提供的幫助.

* 責任作者, 溫占波, 助理研究員, wenzhanbo@yeah.net;李勁松, 研究員, lij-s@163.com

Toxicological study at inflammatory factors and DNA damages effects of Beijing atmospheric PM2.5and its different fractions to pulmonary epithelial cells A549 of human

JIAO Zhou-guang1, FU Xu-lei2, WEN Zhan-bo1*, LI Jin-song1*, LI Na1, ZHANG Ke1, WANG Jie1, HU Ling-fei1

(1.State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Institute of Microbiology and Epidemiology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China；2.College of Food Science and Technology, Bohai University, Jinzhou 121013, China)., 2016,36(5)：1579~1588

In order to investigate the toxicity effect of atmospheric PM2.5and its different fractions to human pulmonary epithelial cells A549 with respect to the relationship between PM2.5dosage and cell response, the water-soluble, fat-soluble, pure particle fractions of PM2.5(designated WSP2.5, FSP2.5and PPP2.5, respectively) prepared from original PM2.5samples (designated OP2.5) and OP2.5were to treat A549 cells at different PM concentrations (10, 50, 100, 200, 400μg/mL, respectively). The MTS method was used to test the cell viability at 6h, 10h, 24h, 48h and 72h post-treatment, while ELISA and RT-QPCR were employed to detect the production of inflammatory cytokines IL-6 and TNF-α and the AP-sites counting was conducted to determine the level of intracellular DNA damage at 24h post-treatment. WSP2.5had very limited effect to inhibit cell growth and induce inflammatory damages and DNA base deletion. FSP2.5, PPP2.5and OP2.5at high concentrations showed the inhibitory effect to cell growth across treatment; when cells were treated with low concentrations of FSP2.5, PPP2.5or OP2.5, the inhibition of cell growth occurred within a short period and then disappeared over time. FSP2.5, PPP2.5andOP2.5treatment significantly induced the production of IL-6at both mRNA and protein levels, while WSP2.5, PPP2.5andOP2.5treatment significantly induced the mRNA expression of TNF-α. FSP2.5, PPP2.5and OP2.5treatment also induced the considerable DNA base deletion. In a word, not only the complex components adsorbed on the solid core granules of PM2.5, but also the solid core granules themselves contributed to the cytotoxicity effects.

PM2.5；fractions；A549 cells；cell viability；inflammatory cytokines；DNA damage

X503.1

A

1000-6923(2016)05-1579-10

焦周光(1990-),男,河北邯鄲人,碩士研究生,主要從事生物氣溶膠與健康,大氣顆粒物相關毒理學研究.

2015-10-18

國家自然科學基金課題(41205102)