肖泳，唐吉旺，袁列江，林源，吳海智

(湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，湖南 長沙，410007)

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高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定茶葉中的草甘膦和氨甲基膦酸殘留

肖泳*，唐吉旺，袁列江，林源，吳海智

(湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，湖南 長沙，410007)

建立了高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定茶葉中的草甘膦(PMG)和氨甲基膦酸(AMPA)殘留量的測定方法。樣品采用超純水提取、氯甲酸-9-芴基甲酯衍生，再經(jīng)HLB柱凈化后上機測定，并以內(nèi)標法定量。結(jié)果表明：草甘膦和氨甲基膦酸在0.001～0.5 mg/L內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.999 9和0.999 8，平均回收率和相對標準偏差分別為78.2 %～103.4 %和2.1 %～6.2 %，方法的定量下限分別為1.0 μg/kg和7.5 μg/kg。該方法基質(zhì)干擾小、靈敏度高、準確可靠，適用于茶葉中草甘膦及氨甲基膦酸殘留量的定量檢測。

草甘膦；氨甲基膦酸；茶葉；高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜

草甘膦(glyphosate，也簡稱PMG)，是一種廣效型的有機磷除草劑，因其高效、低成本，得以普遍推廣使用，茶葉地也不例外。PMG及其主要代謝產(chǎn)物氨甲基膦酸(aminomethylphosphonic acid，AMPA)易被茶葉的葉片吸收，導(dǎo)致茶葉中草甘膦殘留量超標，影響消費者的食用安全及茶葉的出口貿(mào)易。

目前，PMG和AMPA殘留的檢測方法有氣相色譜法[1-2]、液相色譜法[3-9]、離子色譜法[10-14]、氣相色譜-質(zhì)譜法[15-17]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[18-25]；常用的提取溶劑有純水、水/二氯甲烷、NaOH溶液等，CAO等[24]研究發(fā)現(xiàn)，純水的提取效果最好；凈化常用的固相萃取柱有C18柱、CAX陽離子交換柱、MAX陰離子交換柱等，ZHOU等[4,24]研究表明C18柱對板栗、稻米樣品具有較好的凈化作用。針對茶葉樣品中PMG和AMPA殘留的檢測，現(xiàn)有國標主要采用SN/T 1923—2007，該標準采用的是CAX陽離子交換柱，實驗發(fā)現(xiàn)，洗脫時由于洗脫液中水占比例大，不易濃縮蒸干，需耗費大量的時間和精力；艾普銳生物科技有限公司研制的IPRE Qclean PMG 藍柱和紅柱[26]，可吸附雜質(zhì)，起到濃縮和較好的凈化作用。基于已有的實驗研究，本試驗優(yōu)化、對比研究了4種不同的前處理方式，旨在建立一種高效、靈敏的茶葉中PMG和AMPA殘留量檢測的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法。

1　材料與方法

1.1儀器與設(shè)備

Thermo Scientific TQS Quantum U1tra-AM高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀；SK-1快速混勻儀，常州澳華儀器有限公司；MTN-2800W氮吹儀，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；超聲波清洗器，杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司；Millipore Elix? Essential 3超純水儀，法國默克密理博公司；TG16-WS臺式高速離心機，長沙維爾康湘鷹離心機有限公司；Minispin迷你高速離心機，Eppendorf 中國有限公司。

1.2試劑與材料

草甘膦(純度99.9 %)，F(xiàn)luka公司；氨甲基膦酸(純度99.0 %)，Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；草甘膦-13C215N(PMG(IS)，(純度98 %)，F(xiàn)luka公司；氯甲酸-9-芴基甲酯(FMOC-Cl，純度99.0 %)，F(xiàn)luka公司；HLB固相萃取小柱(60 mg/3 mL)，Waters公司；C18-SPE小柱(200 mg/3 mL)，Agela公司；四硼酸鈉(Na2B4O7，分析純)，上海強順化學(xué)試劑有限公司。

1.3標準溶液及衍生試劑的配制

準確稱取10 mg的PMG和AMPA標準品，用水定容至50 mL，配成質(zhì)量濃度為200 μg/mL的混合標準儲備液，使用時用水逐級稀釋至所需濃度；準確稱取5 mg的PMG(IS)，用水定容至50 mL，配成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標準儲備液，再用水稀釋成1 μg/mL的標準工作液；用乙腈將衍生試劑FMOC-Cl配成質(zhì)量濃度分別為0.5、2、25 g/L的工作液。

1.4樣品前處理

稱取2.0 g粉碎均勻的茶葉樣品置于50mL具塞離心管中，加入1.0 μg的PMG(IS)標準工作液，混勻靜置10 min，加入20 mL超純水，混勻并超聲提取30 min，離心，取上清液過0.45 μm水系濾膜，待凈化衍生。

方法一：取200 μL上述提取液，加質(zhì)量分數(shù)5%NaOH水溶液調(diào)pH值至7～9(用pH試紙，約加5 μL)，加水至600 μL，加200 μL 5%硼酸鹽緩沖溶液，混勻，再加入200 μL衍生試劑，充分混勻，衍生一定的時間，高速離心后取上清液過0.45 μm有機濾膜，上機測定。

方法二：取C18固相萃取小柱，用3 mL甲醇、3 mL水活化，棄去透過液。緩慢加入1 mL上述提取液，收集透過液，再加入1.5 mL水洗脫并收集，混勻后加5%NaOH水溶液調(diào)pH值至7～9(用pH試紙，約加5 μL)，加水定容至3 mL，混勻。取600 μL凈化液加200μL 5%硼酸鹽緩沖溶液，混勻，再加入200 μL衍生試劑，充分混勻，衍生一定的時間，高速離心后取上清液過0.45 μm有機濾膜，上機測定。

方法三：按方法一衍生一定的時間后，加入甲酸(約50 μL)調(diào)pH值至3，混勻，高速離心取上清液備用；取HLB固相萃取小柱，用3 mL甲醇、3 mL質(zhì)量分數(shù)2%的甲酸水溶液活化，將備用液過柱，加入3 mL水淋洗并減壓抽干2～3 min，再加入3 mL正己烷淋洗并減壓抽干2～3 min，用6 mL 5%的氨水-甲醇溶液洗脫，收集洗脫液于40 ℃緩慢氮吹至干，加1 mL質(zhì)量分數(shù)10%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)溶解殘渣，過0.45 μm有機濾膜，上機測定。

方法四：取C18固相萃取小柱，按方法二處理，衍生一定的時間后按方法三處理。

1.5液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜條件

1.5.1色譜條件

色譜柱：色譜柱:Thermo Hypersil Gold 柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；柱溫：40 ℃；進樣體積：10 μL；流速：0.5 mL/min；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～1.0 min,10～40% B；1.0～4.5 min,40%～95% B；4.5～5.0 min,95% B；5.0～5.1 min,95%～10% B；5.1～7.0 min,10 % B。

1.5.2質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離源(ESI)；掃描極性：正離子；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；毛細管溫度：350 ℃；蒸發(fā)溫度：300 ℃；鞘氣壓力45.0 Arb；輔助氣壓力：10.0 Arb；噴霧電壓：3 500 V；其他質(zhì)譜條件見表1。

表1　PMG、PMG(IS)和AMPA的保留時間及多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)

注：*定量離子。

2　結(jié)果與分析

2.1衍生反應(yīng)條件的優(yōu)化

選用PMG、 AMPA、PMG(IS)混合標準溶液(最終濃度均為10 ng/mL)進行試驗，衍生試劑的濃度分別為0.5、2、25 g/L，按試驗方法一進行衍生凈化，衍生時間分別為衍生20 min(超聲)，衍生1、2、3、5、24 h(超聲20 min)，試驗結(jié)果如圖1～圖3所示。

圖1　衍生試劑濃度和衍生時間對PMG衍生效率的影響Fig.1　Effect of derivative reagent concentration andderivatization time on the derivative efficiency of PMG

圖2　衍生試劑濃度和衍生時間對PMG(IS)衍生效率的影響Fig.2　Effect of derivative reagent concentration andderivatization time on the derivative efficiency of PMG(IS)

圖3　衍生試劑濃度和衍生時間對AMPA衍生效率的影響Fig.3　Effect of derivative reagent concentration andderivatization time on the derivative efficiency of AMPA

由圖1～圖3可知，當衍生時間為1 h(超聲20 min)時， PMG、PMG(IS)、AMPA均衍生完成，此后隨著時間的增加，衍生產(chǎn)率變化不明顯；當衍生試劑濃度為0.5 g/L和2 g/L時，PMG、PMG(IS)、AMPA的衍生產(chǎn)率基本接近，當選擇25 g/L濃度時，三者的衍生產(chǎn)率均明顯高于低濃度時；通過內(nèi)標法計算，無論選取何種濃度的衍生試劑、衍生多久的時間，標準溶液中PMG/PMG(IS)、AMPA/PMG(IS)的峰面積比值間均無顯著性差異。因此，為保證衍生反應(yīng)充分，選取衍生時間為1 h(超聲20 min)。

考慮到茶葉樣品色素雜質(zhì)較多，基質(zhì)較復(fù)雜，在選擇衍生試劑濃度時，進一步選取茶葉加標樣品進行試驗(最終加標濃度均為5 ng/mL)，按方法三進行衍生凈化，衍生時間為1 h(超聲20 min)，其樣品加標圖譜如圖4～圖6所示。

圖4　衍生試劑0.5 g/L時PMG、AMPA的定量離子色譜圖Fig.4　The quantitative ion chromatogram of PMG and AMPA in 0.5 g/L of derivative reagent

圖5　衍生試劑2 g/L時PMG、AMPA的定量離子色譜圖Fig.5　The quantitative ion chromatogram of PMG and AMPA in 2g/L of derivative reagent

圖6　衍生試劑25 g/L時PMG、AMPA的定量離子色譜圖Fig.6　The quantitative ion chromatogram of PMG and AMPA in 25g/L of derivative reagent

由圖4～圖6可知，隨著衍生試劑濃度的增加，PMG、 AMPA衍生產(chǎn)物的響應(yīng)逐漸提高，且當衍生試劑濃度為25 g/L時，AMPA的峰形更好，基質(zhì)干擾更小。因此，結(jié)合圖1～圖6，選擇衍生試劑濃度為25 g/L。

2.2凈化方式的選擇

選取空白茶葉樣品進行加標，按前處理中方法一、二、三、四進行提取、凈化、測定，最終加標濃度分別為10、50、100 ng/mL，每個水平重復(fù)5次；對于標準溶液，分別吸取一定體積的混合標準工作液，調(diào)pH值至7～9后加水至0.6 mL，按方法一、三進行衍生、凈化、測定，最終濃度分別為1、2、5、10、50、100、200、500 ng/mL，再采用內(nèi)標法，分別以定量離子的峰面積比值對濃度繪制標準曲線，所有樣品、標樣中內(nèi)標物質(zhì)的最終濃度均為10 ng/mL；對于方法的定量限，通過稱取2.0 g空白樣品加標測試，計算得出4種前處理方法的PMG、AMPA的定量下限(LOQ，S/N=10)。4種前處理方法的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、加標回收率、精密度、定量限見表2。

表2　四種前處理方法的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、加標回收率、精密度(RSD)及定量限

由表2可知，在1 ～ 500 ng/mL內(nèi)，PMG和AMPA均呈良好的線性關(guān)系，其R2均超過0.999；對于PMG，茶葉加標樣品經(jīng)4種前處理方法處理后，其加標回收率均超過了90%，且其RSD均小于10%，定量限均為1.0 μg/kg，說明這4種方法均能用于茶葉樣品中PMG的檢測；對于AMPA，方法三回收率最高，且定量限低于其他方法，說明HLB柱能有效降低茶葉樣品的基質(zhì)干擾，增強靈敏度，而C18柱對茶葉樣品的除雜效果不明顯；通過批量試驗發(fā)現(xiàn)，茶葉提取液衍生后顏色較深，直接上機會造成離子源污染，需經(jīng)常清洗離子源，且由于待測溶液中含有較高濃度的緩沖鹽，易導(dǎo)致離子源噴針堵塞，而衍生后的樣液經(jīng)HLB柱凈化后基本無色，且能除去樣液中的緩沖鹽，有效降低儀器的損耗。

綜合試驗結(jié)果表明，茶葉中PMG和AMPA的最佳衍生凈化方法為：樣品經(jīng)純水提取后采用25 g/L的衍生試劑衍生反應(yīng)1 h(超聲20 min)，再經(jīng)HLB柱凈化后上機測定。該方法在1 ～ 500 ng/mL內(nèi)，PMG和AMPA均呈良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.999 9和0.999 8；在加標10～100 ng/mL內(nèi)，PMG的平均回收率為93.8%～103.4%，RSD為2.1% ～ 5.9%，其定量限為1.0 μg/kg；AMPA的平均回收率為78.2%～84.3%，RSD為3.4%～6.2%，其定量限為7.5 μg/kg，均能夠滿足GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》的檢測要求。

2.3實際樣品的測定

按所建立的方法對15批次茶葉樣品中PMG和AMPA的實際殘留量進行測定，并對其中一個批次的茶葉樣品進行加標(加標濃度為0.01 μg/mL)，以用于過程控制。結(jié)果表明，所測樣品中有2份檢出了PMG和AMPA，PMG含量分別為0.57、0.040 mg/kg，AMPA含量分別為0.11、0.015 mg/kg；實際樣品及其加標圖譜如圖7所示，經(jīng)計算PMG的回收率為98.5%，AMPA的回收率為82.1%，表明該批樣品測定結(jié)果穩(wěn)定、可靠。

圖7　實際樣品及其加標樣品中PMG和AMPA的定量離子色譜圖Fig.7　The quantitative ion chromatograms of PMG and AMPA in the actual and standard samples

3　結(jié)語

本文建立了高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法檢測茶葉中草甘膦及氨甲基膦酸殘留量的檢測方法，方法以內(nèi)標法定量，采用純水提取、氯甲酸-9-芴基甲酯試劑衍生，再經(jīng)HLB柱凈化后上機測定。結(jié)果表明，方法具有基質(zhì)干擾小、靈敏度高、準確可靠等特點，適用于茶葉中草甘膦及氨甲基膦酸殘留量的定量檢測，可為茶葉的安全監(jiān)管及質(zhì)量控制提供技術(shù)支持。

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Determination of glyphosate and aminomethylphosphonic acid residues in tea using high performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry

XIAO Yong*，TANG ji-wang，YUAN Lie-jiang，LIN Yuan，WU hai-zhi

(Hunan Province Produce Commodity Quality Supervision Testing & Research Institute, Changsha 410007，China)

A method was developed for the determination of glyphosate (PMG) and aminomethylphosphonic acid (AMPA) residues in tea using high performance liquid chromatography-mass spectrometry / mass spectrometry. The sample was extracted with water and 9-Fluorenylmethyl chloroformate derivatives, and purified by HLB solid phase extraction cartridge and then determined, and quantified by internal standard method. The results showed that the linearity of PMG and AMPA were in the concentration range from 0.001 to 0.5 mg/L, the correlation coefficient (R2) were 0.9999 and 0.9998, the average recoveries ranged from 78.2% to 103.4%, and the relative standard deviations ranged from 2.1% to 6.2%; the lower limit of quantification of the method were 1.0 ug/kg and 7.5 ug/kg, respectively. This method had less matrix interference, high sensitivity. It is accurate and reliable, suitable for the quantitative detection of PMG and AMPA residues in tea.

glyphosate；aminomethylphosphonic acid；tea；HPLC-MS/MS

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609037

碩士(本文通訊作者，E-mail：xy882008@163.com)。

2016-01-27，改回日期：2016-03-02