王丹妮，邱偉強(qiáng)，陳舜勝，宋雪

(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)

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冷藏條件下縊蟶、文蛤ATP關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的變化及降解途徑的探究

王丹妮，邱偉強(qiáng)，陳舜勝*，宋雪

(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)

為了研究冷藏條件下，縊蟶、文蛤三磷酸腺苷(ATP)及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的變化和降解途徑。采用高效液相色譜法對貯藏在4 ℃下的縊蟶和文蛤的9種ATP關(guān)聯(lián)物進(jìn)行測定，分別為：三磷酸腺苷 (adenosine triphosphate，ATP)，二磷酸腺苷 (adenosine diphosphate，ADP)，單磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)，肌苷酸(inosine monphosphate，IMP)，腺嘌呤核苷(adenosine，AdR)，次黃嘌呤核苷(inosine，HxR)，次黃嘌呤(hypoxanthine，Hx)，黃嘌呤(xanthine，Xt)和腺嘌呤(adenine，Ad)。研究發(fā)現(xiàn)，在4 ℃下，從縊蟶和文蛤中檢測到的產(chǎn)物都為ATP、ADP、AMP、IMP、AdR、HxR、Hx和Xt，未測到Ad。 ATP的初始值分別為1.033和0.824 μmol/g，試驗(yàn)前4 d下降較快，之后緩慢下降；ADP呈下降趨勢；AMP、IMP、AdR和HxR含量先上升后下降；Xt呈上升趨勢；縊蟶中Hx呈上升趨勢，文蛤則先上升后下降。根據(jù)ATP關(guān)聯(lián)物的變化，推測2種貝類的代謝途徑為ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx→Xt和ATP→ADP→AMP→AdR→HxR→Hx→Xt，因文蛤中IMP含量極少，所以推測文蛤以第2條途徑為主。結(jié)合感官評價和TVB-N實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2種貝類的Kax值與感官評分和TVB-N均存在顯著相關(guān)性，Kax值可用于2種貝類的鮮度評價。

縊蟶；文蛤；ATP關(guān)聯(lián)產(chǎn)物；降解途徑；高效液相色譜

縊蟶(Sinonovaculaconstricta)，和文蛤(Meretrixmeretrix)分別屬于軟體動物門(Mollusca)、雙殼綱(Bivalvia)、簾蛤目(Veneroida)中的竹蟶科(Solenidae)和簾蛤科(Veneridae)[1-2]。作為我國重要的海產(chǎn)雙殼類，2014年我國蟶類、蛤類分別占貝類總產(chǎn)量的5.9%和29.5%[3]。目前貝類以鮮銷為主，加工業(yè)還很薄弱，由于收獲季集中，采捕期短，保鮮?；畈划?dāng)時，會造成變質(zhì)，帶來巨大損失[4]。為了更有效地利用貝類，客觀評價其鮮度就顯得尤為重要。K值是將核苷酸的分解代謝產(chǎn)物作為鮮度指標(biāo)的一種評價方法[5]，廣泛應(yīng)用于魚類。由于人們對貝類核苷酸的分解途徑和產(chǎn)物仍存在爭議，普遍認(rèn)為魚類和貝類核苷酸的分解途徑和產(chǎn)物不同，所以K值是否能夠客觀評價貝類鮮度，仍有待探究。近年來，對扇貝、牡蠣等貝類的ATP及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物變化和降解途徑的研究較多，而縊蟶和文蛤研究較少，探究縊蟶和文蛤核苷酸的降解途徑有利于深入了解雙殼貝類核苷酸分解變化過程，為以后探究其他貝類的核苷酸降解途徑提供一種方法，并對貝類的加工利用帶來一定的指導(dǎo)。

本試驗(yàn)采用高效液相色譜法，以縊蟶和文蛤?yàn)樵囼?yàn)對象，測定4 ℃貯藏期間，2種貝類ATP及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的變化，推測其降解途徑，并探究其適用于評價2種貝類鮮度K值的可行性。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

縊蟶、文蛤，購買于上海古棕路水產(chǎn)品批發(fā)市場，均為新鮮健康活體(縊蟶長：5.5～6.7 cm，寬：1.7～2.2 cm；文蛤長：3.5～4.2 cm，寬：2.5～2.7 cm)，在鹽度為2.7%的鹽水中吐沙24 h，蒸餾水清洗，然后快速去半殼，殺死，2只作為一個樣本，取3個平行，裝入PE袋，置于4 ℃冰箱中待處理。

甲醇(色譜純)，德國Merck公司；KH2PO4、K2HPO4(色譜純)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；H3PO4、NaOH、高氯酸(優(yōu)級純)，上海國藥集團(tuán)；ATP、ADP、AMP、IMP、GMP、HxR、AdR、Hx、Xt、Ad標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)，美國Sigma-Aldrich公司。

1.2儀器與設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜系統(tǒng)，美國Waters有限公司；KUBOTA 520離心機(jī)，日本島津有限公司； 酸度計(jì)(pH計(jì))，瑞士METTLER TOLEDO公司；H-2050R臺式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；全自動凱氏定氮儀KJELTEC 8400，瑞典FOSS公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取10種標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g于燒杯中，充分溶解，超純水定容至50 mL容量瓶中，并依次稀釋得到100，50、25、10和5 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度。

1.3.2樣品處理

從第0天(新鮮狀態(tài))到第12天，每天取4 ℃貯藏條件下的縊蟶和文蛤約3 g，于冰浴條件下剪碎(每個樣品3個平行)，加入10% PCA 15 mL，研磨搗碎，然后5 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至燒杯中，置于4 ℃下，將所得沉淀物加入5% PCA 10 mL，研磨搗碎，5 000 r/min離心10 min，合并上清液，用2 mol/L KOH和H3PO4調(diào)節(jié)pH值至5.7，靜置于4 ℃下，然后超純水定容至50 mL容量瓶中。取樣品溶液2 mL過0.22 μm濾膜于進(jìn)樣瓶中，待高效液相儀器(HPLC)分析。

1.3.3色譜條件

參照邱偉強(qiáng)等[6]的方法并稍作修改。色譜柱：島津ODS-3 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；流動相A：15 mmol/L KH2PO4和15 mmol/L K2HPO4(體積比1∶1)溶液，流動相B：純甲醇溶液；緩沖液pH值：5.7；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長254 nm；測定時間35 min；梯度洗脫方法： 0～8 min，流動相A為100%； 8～10 min，流動相B線性增加至3%； 10～15 min，流動相B線性增加至6%； 15～23 min，流動相B線性增加至15%； 23～28 min，流動相B線性增加至30%； 28～30 min， 流動相A回到初始梯度狀態(tài)100%。

1.3.4感官評定實(shí)驗(yàn)

試驗(yàn)篩選8名感官評定人員，制定感官評價表(表1)。評定標(biāo)準(zhǔn)：最高為5分，最低為0分，設(shè)置外觀、氣味、肉質(zhì)的權(quán)重分別為0.4，0.3和0.3。每個指標(biāo)的平均分乘以權(quán)重，然后相加之和為感官評分[7-9]。評分越高，鮮度越好。5～4分為新鮮可食，4～3分為可接受，3～0為不可接受。

表1　雙殼貝類感官評價表

1.3.5揮發(fā)性鹽基氮的測定

按SC / T3032—2007[10]規(guī)定的方法測定。

1.3.6ATP關(guān)聯(lián)產(chǎn)物含量計(jì)算

用EXCLE2010，origin，SPSS等軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。高效液相測得ATP及其代謝產(chǎn)物的面積，通過標(biāo)準(zhǔn)品線性關(guān)系計(jì)算得出相應(yīng)的濃度值cm，用式(1)分別計(jì)算出待測樣品中9種ATP關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的含量。

(1)

式中：x，待測樣品中9種ATP關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的含量，μmol/g；cm，標(biāo)準(zhǔn)品線性關(guān)系計(jì)算得到的相應(yīng)的濃度值，μg/mL；mx，待測樣品的總質(zhì)量，g；Mx，9種ATP關(guān)聯(lián)物的摩爾質(zhì)量，g/mol。

2　結(jié)果與分析

2.1高效液相色譜法測定ATP及關(guān)聯(lián)物標(biāo)準(zhǔn)品

試驗(yàn)采用反相液相色譜法，為了排除2種貝類在試驗(yàn)過程中可能產(chǎn)生GMP，造成干擾[6]，在9種ATP關(guān)聯(lián)產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品中加入GMP標(biāo)準(zhǔn)品。1.3.3色譜條件下，以標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液作為檢測對象，對濃度梯度為5，10、25、50、100和200 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，每個梯度進(jìn)樣3次，以保留時間作為定性依據(jù)，繪制10種標(biāo)準(zhǔn)品濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖1　9種ATP關(guān)聯(lián)物及GMP標(biāo)準(zhǔn)品(100 μg/mL)的高效液相色譜圖Fig.1　Chromatogram of the standard solution of 9 ATP-related compounds and GMP(100 μg/mL)

2.2縊蟶、文蛤體內(nèi)ATP及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的變化及分解途徑

2.2.1ATP及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的含量變化

縊蟶和文蛤在鮮活狀態(tài)下立即殺死，最初ATP的含量分別為1.033 μmol/g和0.824 μmol/g。于4 ℃下貯藏3 d，ATP快速下降，第3天縊蟶和文蛤ATP分別下降至0.205 μmol/g和0.172 μmol/g，比鮮活狀態(tài)時分別下降了80%和79%，下降幅度較大，如圖2，圖3所示。

圖2　在4 ℃下縊蟶貯藏期間ATP關(guān)聯(lián)物含量變化Fig.2　Changes in contents of ATP-related compounds in Sinonovacula constricta during storage at 4 ℃

圖3　在4 ℃下文蛤貯藏期間ATP關(guān)聯(lián)物含量變化Fig.3　Changes in contents of ATP-related compounds in Meretrix meretrix during storage at 4 ℃

這種現(xiàn)象與魚類ATP降解現(xiàn)象相似，劉壽春等[11]在冷藏羅非魚片中發(fā)現(xiàn)，ATP含量在前2 d下降了近80%。ATP快速下降的原因，可能因?yàn)樨愵愺w內(nèi)三磷酸腺苷酶活性較強(qiáng)，WATABE等[12]認(rèn)為在死后的最初階段，因?yàn)榧〖?xì)胞中Ca2+對肌漿網(wǎng)的吸附能力下降，導(dǎo)致其大量進(jìn)入細(xì)胞液中，肌原纖維中的Ca2+的濃度增加，使得肌原纖維ATP酶被激活，從而引起ATP快速下降。初始ADP含量分別為1.074，0.694 μmol/g，呈下降趨勢。

2種貝類，初始AMP含量較少，縊蟶為0.563 μmol/g，文蛤?yàn)?.552 μmol/g，表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢。縊蟶中有蓄積現(xiàn)象，在貯藏第5天達(dá)到最大值1.627 μmol/g，文蛤在第2天達(dá)到最大值1.250 μmol/g，隨后快速下降。湯水粉[13]在研究真鯛(Pagrosomusmajor)、鰤魚(Seriolaquinqueradiata)、紅甘魚(Kanpachi)、鱸魚(Lateolabraxjaponicus)和草魚(Ctenopharyngodonidellus)的ATP關(guān)聯(lián)物變化時，發(fā)現(xiàn)ATP轉(zhuǎn)變成IMP的過程十分迅速，AMP含量沒有顯著增加且含量較低，這與2種貝類檢測到的結(jié)果不同，WANG等[14]在牡蠣(Ostreagigasthunberg)的閉殼肌，外套膜、鰓和其余部位中發(fā)現(xiàn)了與2種貝類相同的現(xiàn)象，這可能是貝類區(qū)別于魚類的特性?？O蟶在貯藏第4天檢測到IMP，含量為0.081 μmol/g，之后先上升后下降，最大值為0.133 μmol/g，于第12天消失。在第3天測到AdR，初始值0.067 μmol/g，呈先上升后下降趨勢，最大值為0.165 μmol/g，在第10天消失；IMP的含量與AdR相近。文蛤中只檢測到了極少量的IMP，AdR先上升后下降，最大值為0.624 μmol/g，遠(yuǎn)高于縊蟶(圖2、圖3)。這說明2種貝類中同時存在IMP和AdR2種分解產(chǎn)物，因種類不同而導(dǎo)致含量不同，但變化趨勢相同。AMP和IMP不僅是ATP降解過程的中間產(chǎn)物，還具有重要的呈味作用，與魚類主要以IMP呈味不同，縊蟶和文蛤中IMP含量較少，AMP含量較高，因此核苷酸與谷氨酸和天門冬氨酸相乘產(chǎn)生的鮮味效果，為貝類主要鮮味來源[15]。

貯藏期間，縊蟶HxR含量較高，于第2天出現(xiàn)，第12天消失，先上升后下降。在第6天，當(dāng)IMP和AdR緩慢下降時，HxR仍持續(xù)上升至第9天，說明HxR的合成速率大于HxR的分解速率，最大值為0.682 μmol/g。文蛤不同于縊蟶，僅在第6到第9天檢測到HxR，最大值為0.262 μmol/g，但Hx含量高，說明HxR快速分解為Hx。2種貝肉中HxR合成與分解速率不同，可能與貝肉中酶的活性相關(guān)。由于貝類初菌數(shù)較高，灘涂養(yǎng)殖的縊蟶和文蛤菌落總數(shù)均可達(dá)105CFU/g[16]，一些低溫菌在冷藏條件下十分活躍，造成了后期HxR快速下降?？O蟶體內(nèi)在第6天檢測到Hx，Hx呈直線上升趨勢，文蛤第2天檢測到Hx，呈先上升后下降趨勢。Xt由黃嘌呤氧化酶作用于Hx產(chǎn)生，隨著貯藏時間的增加，2種貝類體內(nèi)的Xt含量都不斷上升。

2.2.2兩種雙殼貝類核苷酸分解途徑探究

一般來說，核苷酸分解前期ATP→ADP→AMP的過程是相同的。而AMP因物種不同，而分解成不同的產(chǎn)物，已知的有3條途徑：AMP→IMP→HxR，AMP→AdR→HxR，AMP→AdR→Ad[16-17]。魚類中，通常核苷酸的降解途徑為AMP→IMP→HxR→Hx[18]；蝦中，邱偉強(qiáng)等[6]推測斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)和羅氏沼蝦(Macrobrachuimrosenbergii)核苷酸的降解途徑為AMP→IMP→HxR(1%)和AMP→AdR→HxR(99%)；蟹類中，湯水粉等[19]從梭子蟹(Portunustrituberculatus)體內(nèi)檢測到大量的IMP；對于貝類，SAITO[5]推測庫頁島厚蛤蜊(Spisulasachalinensis)和蝦夷扇貝(Pectenyessoensis)中降解途徑為AMP→AdR→HxR；劉亞[20]對馬氏珠母貝(Pinctadamartensi)檢測時，認(rèn)為其降解途徑為AMP→IMP→HxR和AMP→AdR→HxR。

試驗(yàn)在縊蟶和文蛤體內(nèi)檢測到了IMP和AdR，都未檢測到Ad，根據(jù)降解產(chǎn)物推測， AMP可能的分解途徑為AMP→IMP→ HxR和AMP→AdR→ HxR。AMP經(jīng)AMP脫氨酶作用，水解脫氨轉(zhuǎn)變?yōu)镮MP，再經(jīng)核苷酸酶催化成HxR；或AMP經(jīng)核苷酸酶作用，加水脫磷酸生成AdR，AdR在腺苷脫氨酶作用下生成HxR(圖4)。HxR繼而脫去1-磷酸核糖，生成Hx[21]。

圖4　AMP經(jīng)IMP或AdR生成HxR的結(jié)構(gòu)式變化Fig.4　Chemical structure changes of HxR generated by AMP though IMP or AdR

縊蟶AMP含量下降的同時，IMP和AdR緩慢上升一段后快速下降，在第5～6天， 產(chǎn)物僅為AMP，IMP、AdR、HxR，AMP下降的含量為0.274 μmol/g與IMP、AdR和HxR上升的總量0.272 μmol/g幾乎相同?？赏茰yAMP降解成了IMP、AdR和HxR。因此縊蟶的AMP降解途徑為： AMP→IMP→HxR和AMP→AdR→HxR。

文蛤AMP含量在第2天由峰值快速下降，同時AdR出現(xiàn)，并快速上升，第4天AMP的下降速率減慢，AdR的上升速率也變慢(圖3)，說明AMP與 AdR的變化可能存在相關(guān)性，AdR是由AMP分解成的產(chǎn)物。HxR的含量較少，Hx的含量較多，推測AdR經(jīng)HxR快速變?yōu)镠x，這種現(xiàn)象可能與文蛤中的腺苷脫氨酶及核苷磷酸化酶的活性較強(qiáng)有關(guān)[22]。由于在文蛤中檢測到極少量的IMP，AdR最大值遠(yuǎn)大于IMP，所以文蛤核苷酸的降解途徑雖為2條，但以AMP→AdR→HxR為主。

2.3鮮度評價

魚類中核苷酸分解途徑是ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx，隨著鮮度下降，反應(yīng)向右進(jìn)行，但是ATP及分解產(chǎn)物的總量基本恒定。K值[23]是后期產(chǎn)物與ATP分解產(chǎn)物總量的百分比，隨著腐敗程度加深，后期產(chǎn)物含量增多，K值變大，鮮度變小，由此來反映魚類的鮮度。

(2)

計(jì)算縊蟶和文蛤8種ATP關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的總量，發(fā)現(xiàn)ATP，ADP、AMP、IMP、AdR、HxR、Hx和Xt的總量基本恒定，后期略有下降，其中2種貝類的Xt含量較高，最高可占ATP關(guān)聯(lián)物總量的29%，因K值中不包括AdR和Xt，所以對K值進(jìn)行補(bǔ)充，計(jì)算經(jīng)過AdR和Xt修正的Kax值。

(3)

當(dāng)2種貝類的感官評分在5～4分(新鮮可食)，Kax值基本為0%，感官評分為3時(不可食用)，此時Kax值都約為35%，后期當(dāng)感官評分為2～0分(腐敗)時，Kax值在50%～100%范圍內(nèi),Kax值越大，鮮度越小。TVB-N值與蛋白質(zhì)分解以及細(xì)菌繁殖有關(guān)，低溫貯藏會抑制細(xì)菌的大量繁殖，但后期由于內(nèi)外環(huán)境作用，TVB-N含量迅速增加?？O蟶和文蛤的TVB-N一品級最大值為10.8。2種貝類在此范圍內(nèi)的Kax值均為0%～20 %，同時將2種貝類Kax值的變化趨勢與相應(yīng)的感官評分和TVB-N進(jìn)行相關(guān)性計(jì)算(圖5，圖6)，發(fā)現(xiàn)縊蟶Kax值與感官評分、TVB-N值的相關(guān)系數(shù)分別為-0.987，0.989(P<0.01)，文蛤分別為-0.968，0.926(P<0.01)，說明Kax值與感官評分、TVB-N均存在極顯著相關(guān)性，Kax值能夠反映縊蟶和文蛤的鮮度情況。

圖5　在4 ℃貯藏期間縊蟶和文蛤的Kax和感官評分的變化Fig.5 Changes in Kax and Sensory of Sinonovacula constricta and Meretrix meretrix. during storage at 4 ℃

圖6　在4 ℃貯藏期間縊蟶和文蛤的Kax和TVB-N的變化Fig.6　Changes inKax and TVB-N of Sinonovacula constricta and Meretrix meretrix. during storage at 4 ℃

3　結(jié)論

試驗(yàn)通過測定ATP及關(guān)聯(lián)物的種類及含量變化，推測縊蟶、文蛤核苷酸的代謝途徑有2條：ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx→Xt和ATP→ADP→AMP→AdR→HxR→Hx→Xt。文蛤主要以后者AMP→AdR→HxR進(jìn)行代謝。

Kax值的變化與感官評分和TVB-N值均存在極顯著相關(guān)性，Kax指標(biāo)可用于縊蟶和文蛤的鮮度評價。

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Changes of ATP- related compounds and degradation pathways inSinonovaculaconstrictaandMeretrixmeretrixduring chilled storage

WANG Dan-ni, QIU Wei-qiang, CHEN Shun-sheng*, SONG Xue

(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306,China)

The changes of ATP-related compounds and freshness evaluation were investigated inSinonovaculaconstricta,Meretrixmeretrixduring 4 ℃storage. The investigation was performed using HPLC- DAD. Nine kinds of compounds were identified: adenosine triphosphate (ATP), adenosine diphosphate (ADP), adenosine monophosphate (AMP), inosinic acid (IMP), adenosine (AdR), inosine (HxR), hypoxanthine (Hx), xanthine (Xt), adenine (Ad). It was found that initial values of ATP in two shellfish samples stored at 4 ℃ were 1.033 μmol/g，0.824 μmoL/g, respectively. However, they were rapidly declined at the beginning of the four day, and then the decrease was slowed down. ADP were declining, AMP, IMP, AdR, HxR all showed first increased and then decreased. Xt were rising. Hx inS.constrictawere rising but inM.meretrixwas first increased and then decreased. Ad were not detected in two shellfishes.M.meretrixhad little IMP. According to changes in ATP-related compounds, it was speculated the degradation pathways of two shellfishes might be: ATP → ADP → AMP → IMP → HxR → Hx→ Xt , ATP → ADP → AMP → AdR → HxR → Hx → Xt. Combined with sensory evaluation and TVB-N，Kax-value was highly significantly correlated with sensory scores and TVB-N values. Kax-value could be used to review the fresh degree of two species of shellfishes.

Sinonovaculaconstricta;Meretrixmeretrix; ATP-related compounds; degradation pathway; high performance liquid chromatography(HPLC)

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609039

碩士研究生(陳舜勝教授為通訊作者,E-mail：sschen@shou.edu.cn)。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.31471685)；上海市科委工程中心建設(shè)：上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心(11DZ2280300)；上海海洋大學(xué)科技發(fā)展專項(xiàng)(A2-0209-15-200008)

2015-12-22，改回日期：2016-03-03