劉妍 孟志剛 孫國(guó)清 王遠(yuǎn) 周燾 郭三堆　張銳

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

陸地棉GhPYR1基因的克隆和功能分析

劉妍 孟志剛 孫國(guó)清 王遠(yuǎn) 周燾 郭三堆張銳

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

植物激素脫落酸（Abscisic acid，ABA）在植物應(yīng)對(duì)干旱、鹽堿等逆境脅迫以及植物種子萌發(fā)、根伸長(zhǎng)、芽休眠等階段發(fā)揮重要作用。PYR/PYL/RCAR蛋白家族是ABA受體，與ABA結(jié)合后能夠啟動(dòng)ABA信號(hào)傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)ABA應(yīng)答基因的表達(dá)。利用電子克隆和RT-PCR技術(shù)從陸地棉中克隆了GhPYR1基因，其編碼的GhPYR1蛋白與擬南芥中AtPYR1蛋白相似度為73%。將GhPYR1蛋白序列與擬南芥14個(gè)PYR/PYL/RCAR家族成員蛋白序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)它與擬南芥PYR/PYL/RCAR蛋白亞家族III親緣關(guān)系最近。過(guò)表達(dá)GhPYR1基因的T3代擬南芥在外源ABA處理下，其種子萌發(fā)和初期根生長(zhǎng)均滯后于野生型，表現(xiàn)出對(duì)ABA更加敏感；高鹽和干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因種子的萌發(fā)抑制更強(qiáng)烈，但苗期脅迫處理下轉(zhuǎn)基因擬南芥的長(zhǎng)勢(shì)卻明顯優(yōu)于野生型；同時(shí)在外源ABA誘導(dǎo)條件下ABA應(yīng)答基因RD29A、RAB18的表達(dá)量較野生型有明顯提高。以上結(jié)果說(shuō)明GhPYR1基因編碼的蛋白是ABA的受體，過(guò)表達(dá)該基因能夠提高植物對(duì)ABA的敏感性和增強(qiáng)應(yīng)對(duì)逆境脅迫的能力。

陸地棉；GhPYR1基因；生物信息學(xué)分析；生理功能分析

植物激素脫落酸（Abscisic acid，ABA），在植物應(yīng)對(duì)干旱、鹽堿等非生物脅迫及植物種子成熟、休眠等發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［1，2］。2009年，Ma和Park［3，4］兩個(gè)實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)分別通過(guò)遺傳篩選和酵母雙雜交的方法，在擬南芥中證實(shí)了PYR/ PYL/RCAR蛋白是ABA的受體。擬南芥中該家族有14個(gè)成員，分別命名為PYR1和PYL1-13，它們都是可溶性蛋白質(zhì)，含有START（STAR-RELATED LIPID-TRANSFER）特征區(qū)域的蛋白質(zhì)，分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)［5］。PYR/PYL/RCAR家族蛋白是ABA信號(hào)通路的起點(diǎn)，而ABA信號(hào)通路是一個(gè)雙重負(fù)調(diào)控系統(tǒng)［6，7］，核心組分除PYR/PYL/RCAR外，還包括PP2Cs、SnRK2s。在通常情況下，未結(jié)合ABA的PYR/PYL/RCAR蛋白不與PP2C互作，PP2C通過(guò)解磷酸化抑制SnRK2的活性。當(dāng)應(yīng)答來(lái)自環(huán)境或發(fā)育的信號(hào)時(shí)，植物體內(nèi)ABA的含量增加，并與PYR/PYL/RCAR結(jié)合使其發(fā)生變構(gòu)［8-10］，然后與PP2C互作，抑制PP2C的磷酸酶活性［3，4］，從而使SnRK2被激活，活化的SnRK2磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子［11，12］，啟動(dòng)ABA應(yīng)答基因RD29A、RAB-18［13，14］等的表達(dá)。繼擬南芥之后，其他高等植物，如玉米、大豆、水稻、草莓、青蒿等［15-18］的ABA受體研究也逐步展開(kāi)，結(jié)果表明，在這些作物中過(guò)表達(dá)PYR/PYL/RCAR家族基因成員，能夠提高轉(zhuǎn)基因作物對(duì)ABA的敏感性、抗旱性和促進(jìn)果實(shí)成熟等。

本研究克隆了陸地棉中GhPYR1基因全長(zhǎng)，構(gòu)建了過(guò)表達(dá)載體，獲得了過(guò)表達(dá)GhPYR1基因的T3代擬南芥，并初步鑒定轉(zhuǎn)GhPYR1基因的擬南芥在種子萌發(fā)、根生長(zhǎng)期間對(duì)ABA、鹽堿和干旱的敏感性以及苗期耐逆性和ABA應(yīng)答基因的表達(dá)情況，旨在為解析ABA通路與植物逆境脅迫應(yīng)答的關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 陸地棉Gossypium hirsutum L. Y18、擬南芥Columbia Col-0由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 載體和菌株 Gateway入門(mén)載體Hbskb1-HI-380、Gateway目的載體pEarelyGate330、農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)均由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)和克隆載體pEASYTM-Blunt Zero購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器與試劑 熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司chromo4）；原平皓公司RNA提取試劑盒；東洋紡公司ReverTra Ace反轉(zhuǎn)錄試劑盒；天根公司Fast HiFidelity PCR Kit；Promega公司GoTag qPCR Master Mix；Invitrogen公司 Gateway LR Clonase ⅡEnzyme Mix；各化學(xué)試劑均購(gòu)于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取和cDNA和合成 以陸地棉Y18葉片為材料，使用改良的CTAB法提取棉花的基因組DNA；RNA的提取過(guò)程參照EASYspin RNA提取試劑盒，提取的RNA用ReverTra Ace反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系20 μL：先將RNA 11 μL、Oligo（dT）201 μL混合后，65℃ 5 min；再加入5×RT Buffer 4 μL、RNase inhibitor（10 U/μL）1 μL、ReverTra Ace 1 μL、dNTP Mix（10 mmol/L）2 μL。反應(yīng)條件：42℃ 30 min，99℃ 5 min，4℃ 5 min。

表1 引物序列表

1.2.2 陸地棉GhPYR1基因編碼區(qū)的克隆 因?yàn)槔酌傻率厦薜淖嫦缺还J(rèn)為是陸地棉（Gossypium hirsutum）D亞基因組的供體，所以在陸地棉基因組尚未公布的前提下，本研究以雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）的基因組序列為參考，以AtPYR1基因序列Blast雷蒙德氏棉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，并結(jié)合開(kāi)放閱讀框預(yù)測(cè)工具ORF Finder 預(yù)測(cè)得到可能的GrPYR1基因的編碼序列。在基因編碼區(qū)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物GhPYR1F/R（表1），以陸地棉D(zhuǎn)NA和cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為50 μL：Fast HiFidelity Polymerase 1 μL、5×Fast HiFidelity PCR Buffer 10 μL、10 mmol/L上下游引物各2 μL、模板DNA/cDNA 2 μL、ddH2O 33 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min?；厥占兓疨CR產(chǎn)物與克隆載體pEASYTM-Blunt Zero連接并轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)Trans-T1，挑取克隆子用GhPYR1F/R引物進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，將陽(yáng)性克隆子送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 GhRYR1基因的序列分析 將GhPYR1基因編碼的蛋白序列Blast Swiss-Prot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)；利用MEGA 5.0將GhPYR1和AtPYR1、AtPYL1-13蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；利用Protparam tool（http：//web.expasy.org/protparam/）在線(xiàn)程序?qū)hPYR1的基本性質(zhì)進(jìn)行分析。利用在線(xiàn)程序PSORT（http：//psort.hgc.jp/form.html）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.2.4 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建 在GhPYR1基因編碼序列的5'和3'端分別加上NotⅠ和SbfⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增獲得目的條帶，回收后連接到到pEASYTM-Blunt Zero克隆載體上，測(cè)序正確后與Gateway入門(mén)載體Hbskb1-HI-380同時(shí)進(jìn)行NotⅠ/ SbfⅠ雙酶切，回收目的片段經(jīng)T4連接酶連接后構(gòu)建GhPYR1-380入門(mén)載體。然后通過(guò)Gateway LR反應(yīng)構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體，反應(yīng)體系5 μL：入門(mén)載體GhPYR1-380 1 μL、目的載體pEarlyGate330 3 μL、Gateway LR Clonase Ⅱ Enzyme Mix 1 μL，輕輕混勻后，25℃孵育6 h后加1 μL Proteinase K Solution 1 μL結(jié)束反應(yīng)。產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)，進(jìn)行菌落PCR和測(cè)序鑒定，獲得陽(yáng)性克隆子，成功構(gòu)建植物表達(dá)載體pOEGhPYR1。

1.2.5 擬南芥轉(zhuǎn)化和鑒定 將表達(dá)載體pOEGhPYR1通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，將鑒定為陽(yáng)性的農(nóng)桿菌通過(guò)蘸花法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥植株。將T1代擬南芥種子在含50 mg/L 卡那霉素的MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，提取 T1代抗性植株的DNA進(jìn)行PCR鑒定，為保證檢測(cè)的正確性，每個(gè)抗性植株分別用兩對(duì)引物進(jìn)行鑒定，一對(duì)特異擴(kuò)增GhPYR1基因，另一對(duì)特異擴(kuò)增部分CaMV 35S 啟動(dòng)子和GhPYR1基因，引物序列見(jiàn)表1。收獲PCR鑒定為陽(yáng)性的T1代植株種子，經(jīng)T2代繁殖及進(jìn)一步抗性篩選最終獲得純合T3代株系，并對(duì)T2、T3代轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因植株的生理實(shí)驗(yàn)分析 為了分析種子萌發(fā)時(shí)轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)ABA、高鹽及干旱的反應(yīng)情況，將野生型和轉(zhuǎn)基因植株的種子分別播種到MS及分別含0.5 μmol/L ABA、200 mmol/L甘露醇、100 mmol/L NaCl的MS固體培養(yǎng)基上。每種培養(yǎng)基上，野生型和轉(zhuǎn)基因植株的3個(gè)株系分別點(diǎn)40-50粒種子，每種處理做3個(gè)重復(fù)。然后4℃冰箱黑暗春化3 d，于氣候培養(yǎng)箱23℃/20℃，16 h光照/8 h黑暗條件下萌發(fā)5 d后進(jìn)行拍照和種子萌發(fā)率的統(tǒng)計(jì)分析。

為了分析外源ABA、高鹽及干旱條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥根生長(zhǎng)初期的生長(zhǎng)情況，首先將WT、OEGhPYR1-1、OEGhPYR1-2在MS上萌發(fā)7 d，7 d后將植株轉(zhuǎn)移至含5 μmol/L ABA、200 mmol/L甘露醇、100 mmol/L NaCl的MS固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，7 d后進(jìn)行拍照并統(tǒng)計(jì)根長(zhǎng)。

1.2.7 ABA應(yīng)答基因的表達(dá)分析 將在MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)10 d的野生型和轉(zhuǎn)基因型擬南芥幼苗用10 μmol/L ABA 處理3 h。收集ABA處理前和ABA處理后的擬南芥材料后液氮速凍。提取擬南芥的RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行ABA應(yīng)答基因RD29A、RAB18的表達(dá)量分析，內(nèi)參對(duì)照選擇擬南芥GAPDH基因。本實(shí)驗(yàn)所用引物見(jiàn)表1。反應(yīng)體系20 μL：GoTag qPCR Master Mix（2×）10.0 μL、cDNA 2 μL、上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL、ddH2O 7.2 μL，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)定3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃ 2 min；98℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。統(tǒng)計(jì)每個(gè)反應(yīng)的熒光強(qiáng)度達(dá)到閾值時(shí)對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)（Ct）。目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 GhPYR1基因克隆、序列分析及載體構(gòu)建

分別以陸地棉D(zhuǎn)NA和cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均獲得大小約600 bp左右、單一、清晰的條帶（圖1-A和B）。測(cè)序結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)618 bp，編碼205個(gè)氨基酸殘基，ORF區(qū)無(wú)內(nèi)含子。將GhPYR1基因序列Blast陸地棉基因組，結(jié)果顯示GhPYR1基因在陸地棉A基因組和D基因組的第3號(hào)染色體上各有一個(gè)拷貝，說(shuō)明克隆得到GhPYR1基因。將GhPYR1序列Blast Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)，顯示GhPYR1具有PYR/PYL/RCAR蛋白家族的特征結(jié)構(gòu)域（圖2-A），且與擬南芥AtPYR1有最高相似度，為73%（圖2-B）。

圖1 GhPYR1基因的克隆及載體

利用MEGA 5.0軟件分析GhPYR1和擬南芥中14個(gè)PYR/PYL/RCAR家族成員，并進(jìn)行NJ進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果（圖3）表明，擬南芥的PYR/PYL/ RCAR家族被分成了3個(gè)亞家族，而GhPYR1與擬南芥第Ⅲ亞家族的親緣關(guān)系最近。利用Protparam tool在線(xiàn)程序分析GhPYR1的基本性質(zhì)，結(jié)果表明，其由205個(gè)氨基酸殘基組成，蛋白分子式為C1001H1584N280O318S7，分子量為22853.6 Da，等電點(diǎn)pI為5.47，親水性平均數(shù)為-0.364，屬于水溶性蛋白。利用在線(xiàn)程序PSORT預(yù)測(cè)GhPYR1的亞細(xì)胞定位特性，結(jié)果表明GhPYR1定位于細(xì)胞質(zhì)的分值為0.65，而定位于葉綠體基質(zhì)、葉綠體類(lèi)囊體膜、葉綠體類(lèi)囊體間隙的分值均為0.2，因此推測(cè)GhPYR1主要分布于細(xì)胞質(zhì)中。

將GhPYR1基因首先克隆到pEASYTM-Blunt Zero載體上，隨后經(jīng)NotⅠ和SbfⅠ雙酶切與載體Hbskb1-HI-380連接，構(gòu)建成功GhPYR1-380入門(mén)載體（圖1-C和D）。最后入門(mén)載體GhPYR1-380與目的載體pEarelyGate330在定量后進(jìn)行LR反應(yīng)，構(gòu)建成功表達(dá)載體pOEGhPYR1（圖1-E和F）。

2.2 轉(zhuǎn)GhPYR1基因擬南芥獲得

將pOEGhPYR1載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，PCR鑒定（圖4-A）為陽(yáng)性后，利用蘸花法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR鑒定結(jié)果如圖4-B所示。每個(gè)抗性植株分別用兩對(duì)引物進(jìn)行鑒定，產(chǎn)物大小分別為615 bp和826 bp，野生型受體擬南芥無(wú)特異擴(kuò)增。經(jīng)鑒定最終獲得T1代轉(zhuǎn)株GhPYR1基因擬南芥陽(yáng)性植株39株。收獲T2代擬南芥種子進(jìn)行篩選后得到各個(gè)株系的擬南芥單株，經(jīng)PCR鑒定（圖4-C）后進(jìn)行繁代，收獲得到T3代種子后進(jìn)行抗性篩選，選擇在篩選平板上不分離的株系進(jìn)行PCR鑒定后（圖4-D），最終獲得3個(gè)純合轉(zhuǎn)基因株系，分別命名為OEGhPYR1-1、OEGhPYR1-2、OEGhPYR1-3。

圖2 GhPYR1蛋白Blast NCBI Swiss-Prot結(jié)果

圖3 GhPYR1與擬南芥14個(gè)PYR/PYL/RCAR蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析

2.3 轉(zhuǎn)GhPYR1基因擬南芥的生理鑒定

2.3.1 T3代轉(zhuǎn)GhPYR1基因擬南芥的種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn) 以野生型擬南芥為對(duì)照，在MS和分別含0.5 μmol/L ABA、100 mmol/L NaCl、200 mmol/L 甘露醇的MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖5所示。圖5-A顯示，在MS培養(yǎng)基上，野生型和轉(zhuǎn)基因型擬南芥表現(xiàn)一致，均能正常萌發(fā)，長(zhǎng)出綠色的子葉，萌發(fā)率在95%-98%之間（表2）；而在含0.5 μmol/L ABA MS的培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型之間表型表現(xiàn)出顯著差異，野生型種子大多數(shù)能正常萌發(fā)，并長(zhǎng)出綠色的子葉，5 d萌發(fā)率在90%以上，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系則表現(xiàn)為萌發(fā)滯后，同期觀察長(zhǎng)出綠色子葉的種子數(shù)量很少，萌發(fā)率在75%-87%之間（圖5-B，表2），野生型和轉(zhuǎn)基因株系間存在極顯著差異（圖6）。在含100 mmol/L NaCl的培養(yǎng)基上，所有擬南芥的萌發(fā)率都下降，但野生型相對(duì)下降幅度較小，5 d萌發(fā)率仍維持在80%以上，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系則大幅度下降，5 d萌發(fā)率僅有5%-8%左右（圖5-C，表2），野生型和轉(zhuǎn)基因株系間存在極顯著差異（圖6）。類(lèi)似地，在含200 mmol/L 甘露醇培養(yǎng)基上，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的5 d萌發(fā)率下降至6%-14%（圖5-D，表2），與野生型之間同樣表現(xiàn)出極顯著差異（圖6）。干旱、高鹽等生理逆境會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)脫水［19］進(jìn)而植物通過(guò)增加ABA的合成和ABA代謝的調(diào)整使得植物體內(nèi)ABA的含量上升［20］，上述結(jié)果表明，轉(zhuǎn)GhPYR1基因擬b .5 b .5南芥植株比野生型對(duì)ABA更敏感，而ABA含量的增加，無(wú)論是外源的，還是內(nèi)源的，都會(huì)影響擬南芥種子的萌發(fā)，使其萌發(fā)率下降，萌發(fā)期滯后。

圖4 農(nóng)桿菌及轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定

圖5 T3代轉(zhuǎn)GhPYR1基因擬南芥的種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)

圖6 不同處理下野生型和轉(zhuǎn)基因型擬南芥的萌發(fā)率

表2 不同處理下野生型和轉(zhuǎn)基因型擬南芥萌發(fā)率/%

2.3.2 轉(zhuǎn)GhPYR1基因擬南芥苗期耐逆實(shí)驗(yàn) 擬南芥在MS平板上萌發(fā)生長(zhǎng)7 d后，轉(zhuǎn)移至分別含5 μmol/L ABA、100 mmol/L NaCl、200 mmol/L甘露醇的MS固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)7 d，生長(zhǎng)狀況如圖7-9圖所示。在5 μmol/L 外源ABA處理下（圖7-A），轉(zhuǎn)GhPYR1基因的擬南芥植株的平均根長(zhǎng)不足5 cm，而野生型擬南芥的平均根長(zhǎng)在6.5 cm以上，極顯著于轉(zhuǎn)基因擬南芥（圖7-B）。這一結(jié)果表明ABA具有抑制擬南芥根生長(zhǎng)的特性，而且，轉(zhuǎn)基因擬南芥的根生長(zhǎng)被抑制程度更深，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因擬南芥比野生型對(duì)ABA更加敏感。

圖7 苗期野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥在外源ABA條件下生長(zhǎng)情況

在100 mmol/L NaCl處理下，轉(zhuǎn)GhPYR1基因的擬南芥植株生長(zhǎng)狀況優(yōu)于野生型（圖8-A），轉(zhuǎn)基因擬南芥的平均根長(zhǎng)在4.4 cm以上，而野生型的在3.7 cm左右，顯著短于轉(zhuǎn)基因擬南芥（圖8-B）。結(jié)果表明，在種子萌發(fā)后期根的生長(zhǎng)過(guò)程中，過(guò)表達(dá)GhPYR1基因的擬南芥較野生型更能適應(yīng)高鹽環(huán)境。同樣地，在模擬干旱條件下，GhPYR1基因過(guò)表達(dá)植株根的生長(zhǎng)優(yōu)于野生型（圖9-A），轉(zhuǎn)基因擬南芥的平均根長(zhǎng)在6.8 cm以上，而野生型的根長(zhǎng)在6.0 cm左右，差異極顯著于轉(zhuǎn)基因擬南芥（圖9-B）。上述結(jié)果表明，100 mmol/L NaCl和200 mmol/L甘露醇均為擬南芥苗期生長(zhǎng)的逆境，會(huì)抑制擬南芥的生長(zhǎng)，但轉(zhuǎn)基因擬南芥相對(duì)生長(zhǎng)狀況要優(yōu)于野生型，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因擬南芥具有較強(qiáng)的耐逆性。

圖8 苗期野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥在高鹽條件下生長(zhǎng)情況

圖9 苗期野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥在模擬干旱條件下的生長(zhǎng)情況

2.4 ABA應(yīng)答基因的表達(dá)分析

為了探明ABA與受體結(jié)合后，是否能啟動(dòng)下游應(yīng)答基因的表達(dá)，利用qRT-PCR的方法，分析了在外源ABA處理前和處理后，野生型和轉(zhuǎn)GhPYR1基因擬南芥中ABA應(yīng)答基因RD29A和RAB18B的表達(dá)量變化，結(jié)果如圖10所示。在ABA處理前，轉(zhuǎn)GhPYR1基因的擬南芥中RA29A基因的表達(dá)量略高于野生型，是野生型的1.81倍，RAB18基因的表達(dá)量略低于野生型，無(wú)明顯差異；在ABA處理后，轉(zhuǎn)GhPYR1基因的擬南芥和野生型中，RD29A基因的表達(dá)量都有所增加，野生型中增加了20%，而轉(zhuǎn)基因中增加了622%，達(dá)到處理前野生型的8.08倍；類(lèi)似地，RAB18基因的表達(dá)量在處理后的野生型和轉(zhuǎn)GhPYR1基因擬南芥中均有所增加，在野生型中增加了56%，在轉(zhuǎn)基因中增加了457%，達(dá)到處理前野生型的5.38倍。這些結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)GhPYR1基因的擬南芥中，ABA通路的活性要高于野生型，特別是經(jīng)ABA處理后，活性大幅提升，應(yīng)答基因大量表達(dá)，以使植物應(yīng)對(duì)干旱、高鹽等逆境。

圖10 野生型和轉(zhuǎn)基因型擬南芥中ABA應(yīng)答基因表達(dá)量比較

3 討論

ABA通路在植物應(yīng)對(duì)干旱、鹽堿等非生物脅迫及植物種子成熟、休眠等發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。植物遭遇干旱、鹽堿等逆境脅迫時(shí)，體內(nèi)ABA含量增加，ABA受體通過(guò)與ABA結(jié)合感知這一信號(hào)，從而激活A(yù)BA通路，提高植物體內(nèi)耐逆相關(guān)基因表達(dá)，從而使植物度過(guò)逆境脅迫期。因此，提高植物對(duì)ABA信號(hào)的敏感性，有助于植物對(duì)逆境脅迫作出快速及時(shí)的反應(yīng)，提高植物的抗逆性。

本研究通過(guò)同源克隆的方法，從陸地棉中克隆了GhPYR1基因。該基因在陸地棉中只有一個(gè)外顯子，ORF長(zhǎng)618 bp，編碼205個(gè)氨基酸殘基，編碼序列含有PYR/PYL/RCAR蛋白家族的特征結(jié)構(gòu)域，與擬南芥中AtPYR1蛋白相似度為73%，與擬南芥中的AtPYR1、AtPYL1、AtPYL2及AtPYL3關(guān)系最近，同屬于第Ⅰ亞家族，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)其最可能分布于細(xì)胞質(zhì)。過(guò)表達(dá)GhPYR1基因的擬南芥在添加外源ABA的情況下表現(xiàn)出種子休眠期延長(zhǎng)，萌發(fā)滯后，苗期生長(zhǎng)發(fā)育遲緩的現(xiàn)象，說(shuō)明其對(duì)ABA的敏感性增強(qiáng)，這一結(jié)果和在擬南芥中過(guò)表達(dá)青蒿的PYR/PYL/RCAR家族基因AaPYL9，提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥種子在萌發(fā)時(shí)對(duì)ABA的敏感性［17］相一致。

種子萌發(fā)包括吸脹、萌動(dòng)和萌發(fā)等連續(xù)的生理過(guò)程，是一個(gè)需水較多的生理時(shí)期。干旱、鹽堿等逆境，由于缺水會(huì)抑制種子萌發(fā)，導(dǎo)致萌發(fā)滯后等現(xiàn)象發(fā)生，這是植物的一種自我保護(hù)手段，而ABA通路應(yīng)該是參與這一自我保護(hù)調(diào)控過(guò)程的主要因子。干旱、鹽堿等逆境會(huì)誘導(dǎo)植物體內(nèi)ABA含量增加，從而激活和增強(qiáng)ABA通路，引起下游耐逆基因的大量表達(dá)，同時(shí)抑制萌動(dòng)、萌發(fā)等相關(guān)基因的表達(dá)。本研究中擬南芥種子萌發(fā)時(shí)添加外源ABA的實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了植物在種子萌發(fā)期對(duì)ABA信號(hào)的應(yīng)答，擬南芥將環(huán)境中ABA含量升高這一現(xiàn)象，解讀為存在干旱、鹽堿等逆境，從而啟動(dòng)植物體內(nèi)的逆境應(yīng)答反應(yīng)，而不是正常狀態(tài)下的萌發(fā)，因而出現(xiàn)了和干旱、鹽堿狀態(tài)下相似的表型。過(guò)表達(dá)GhPYR1基因的擬南芥，因?yàn)閷?duì)ABA的信號(hào)更加敏感，所以在相同濃度的外源ABA或逆境條件下，其種子的萌發(fā)被抑制得更為強(qiáng)烈。

在植物生長(zhǎng)期，ABA通路是植物應(yīng)對(duì)逆境的主要信號(hào)通路。本研究對(duì)苗期的擬南芥進(jìn)行干旱和高鹽處理，轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)出更好的生長(zhǎng)勢(shì)即說(shuō)明了這一點(diǎn)，因?yàn)樵谵D(zhuǎn)基因擬南芥中，ABA通路被激活的程度，要數(shù)倍強(qiáng)于野生型在同等條件下被激活的程度。RD29A基因的表達(dá)量，在逆境下野生型只增加20%，而在轉(zhuǎn)基因擬南芥中卻增加了622%，達(dá)到處理前野生型的8.08倍；RAB18B基因的表達(dá)量，在逆境下野生型中增加56%，而在轉(zhuǎn)基因中則增加了457%，是處理前野生型的5.38倍。也正因?yàn)檗D(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)ABA更敏感，所以在只添加ABA的模擬逆境環(huán)境下，轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長(zhǎng)勢(shì)要弱于野生型，因?yàn)閿M南芥將環(huán)境中的ABA信號(hào)，解讀為逆境信號(hào)，而同等信號(hào)強(qiáng)度下，轉(zhuǎn)基因擬南芥激活的ABA通路的基因表達(dá)要數(shù)倍于野生型，而對(duì)應(yīng)的它抑制的與促進(jìn)植物生長(zhǎng)有關(guān)的通路基因的表達(dá)，也應(yīng)數(shù)倍于野生型。而恰恰因?yàn)檫@只是一個(gè)模擬逆境的狀態(tài)，并不存在真實(shí)逆境對(duì)植物生長(zhǎng)的傷害，所以，ABA通路表達(dá)弱的野生型擬南芥反而長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于通路表達(dá)強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因擬南芥。

本研究結(jié)果證明了GhPYR1基因編碼的蛋白是ABA的受體，同時(shí)證明了過(guò)表達(dá)GhPYR1基因的擬南芥植株提高了對(duì)ABA的敏感性和增強(qiáng)了應(yīng)對(duì)逆境脅迫的能力，但同時(shí)也會(huì)抑制種子的萌發(fā)，所以將該基因用于植物基因工程，用以提高植物耐旱、耐鹽堿性的時(shí)候，最好避免使用CaMV 35S這種組成型表達(dá)的啟動(dòng)子，而代之以組織特異性或誘導(dǎo)表達(dá)型啟動(dòng)子，以期在提高目的基因在靶標(biāo)組織表達(dá)的同時(shí)，降低其對(duì)種子萌發(fā)的抑制。

4 結(jié)論

GhPYR1基因是擬南芥中AtPYR1基因的同源基因，在擬南芥中過(guò)表達(dá)GhPYR1基因能夠提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)ABA的敏感性。表現(xiàn)為在外源ABA存在、干旱和高鹽脅迫條件下，其種子的休眠期延長(zhǎng)，萌發(fā)率下降。同時(shí)，在苗期，轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)外源ABA敏感，更能適應(yīng)高鹽及干旱環(huán)境。在外源ABA條件下，ABA應(yīng)答基因的表達(dá)量提高，使得植物能夠?qū)BA信號(hào)做出及時(shí)反應(yīng)，以啟動(dòng)植物體內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，使植物安全度過(guò)逆境脅迫期。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning and Function Analysis of Gene GhPYR1 in Gossypium hirsutum L.

LIU Yan MENG Zhi-gang SUN Guo-qing WANG Yuan ZHOU Tao GUO San-dui ZHANG Rui
（Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

The phytohormone abscisic acid（ABA）plays an important role in response to drought， salinity and other abiotic stress. It is also a key regulator involved in different plant developmental stages such as seed germination， root elongation， and bud dormancy. The PYR/ PYL/RCAR protein family is the ABA receptor， which can initiate the ABA signaling pathway and induce the expression of ABA response genes. In this study， gene GhPYR1 was cloned from Gossypium hirsutum L. with electronic cloning and RT-PCR technology. GhPYR1 protein exhibited 73% sequence identity with Arabidopsis AtPYR1 protein. Protein sequence alignment among GhPYR1 and 14 family members of PYR/PYL/ RCAR in Arabidopsis as well as the construction of phylogenetic tree revealed that gene GhPYR1 was most closely related to subfamily III of PYR/PYL/RCAR protein in Arabidopsis. T3generation Arabidopsis over-expressing gene GhPYR1were more sensitive to exogenous ABA， as its seed germination and early root growth lagged behind than wild type. The germination of transgenic seeds was more strongly inhibited by high salt and drought stress， however， the transgenic lines were significantly better than the wild ones in the seeding stage. Moreover， the ABA-responsive gene RD29A and RAB18 in transgenic Arabidopsis were significantly induced by ABA compared to the wild type. The above results show that the protein encoded by gene GhPYR1 is the receptor of ABA and over-expression of GhPYR1 can improve the sensitivity of plant to ABA and enhance the ability to respond to stress in plants.

Gossypium hirsutum L.；GhPYR1 gene；bioinformatics analysis；physiological function analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.012

2015-05-13

“863”項(xiàng)目（2013AA102601）

劉妍，碩士研究生，研究方向：植物基因工程；E-mail：liuyan4368@sina.com

張銳，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：棉花基因工程；E-mail：zhangrui71@126.com