家蠅伴侶蛋白CCTδ基因克隆、序列分析及表達(dá)模式的研究

陶如玉 趙學(xué)軍 楊尉錦 吳建偉 國果

（貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550004）

家蠅伴侶蛋白CCTδ基因克隆、序列分析及表達(dá)模式的研究

陶如玉 趙學(xué)軍 楊尉錦 吳建偉 國果

（貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550004）

旨在對(duì)家蠅伴侶蛋白CCTδ基因進(jìn)行cDNA克隆、序列分析，并對(duì)其時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行初步探索。采用EST測(cè)序技術(shù)從已構(gòu)建的家蠅幼蟲cDNA質(zhì)粒文庫中篩選到家蠅CCTδ基因，以該基因的cDNA文庫質(zhì)粒為模板，通過PCR的方法進(jìn)行擴(kuò)增。運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)該基因及其編碼蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。取家蠅不同生活史時(shí)期蟲體（卵、各齡幼蟲、蛹、雄雌成蟲），3齡幼蟲不同組織部位（體壁、氣管、唾液腺、脂肪體、馬氏管及中腸），采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析CCTδ基因在家蠅不同發(fā)育階段和組織部位的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，得到了1 600 bp左右的特異性家蠅CCTδ基因片段；CCTδ基因ORF全長(zhǎng)1 602 bp，編碼533個(gè)氨基酸，理論分子量57.16 kD，等電點(diǎn)為7.50；二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和不規(guī)則卷曲為主；進(jìn)化樹分析顯示其具有較好的保守性，與中華按蚊的遺傳距離較近。時(shí)空表達(dá)譜顯示：該基因在家蠅不同發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)，以蛹期表達(dá)量最高；在3齡幼蟲不同組織中，以氣管表達(dá)量最高。成功克隆了家蠅CCTδ基因并初步探索了其時(shí)空表達(dá)模式。

家蠅；CCTδ基因；生物信息學(xué)分析；表達(dá)模式

分子伴侶蛋白是由多個(gè)亞基環(huán)腔折疊形成的一種蛋白質(zhì)，是細(xì)胞必不可少的成分，能協(xié)助新生的多肽鏈折疊并組裝成穩(wěn)定的有生物活性的結(jié)構(gòu)［1］，蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，以及降解錯(cuò)誤折疊和聚集蛋白的復(fù)性［2，3］，但自身并不發(fā)生任何變化［4］。分子伴侶蛋白一般具有特異性、功能贅余性及高度保守性等特點(diǎn)，參與肌動(dòng)蛋白、微管蛋白的正確折疊與組裝，促進(jìn)細(xì)胞骨架的形成［5，6］。CCTδ屬于類分子伴侶超家族，可行使熱休克蛋白的功能，在進(jìn)化上高度保守，廣泛存在于真核生物中。熱休克蛋白是具有重要生理功能的蛋白質(zhì)家族，在維持機(jī)體蛋白正常結(jié)構(gòu)與功能方面起著重要作用［7］。

家蠅（Musca domestica）是一種世界性分布的衛(wèi)生昆蟲，其幼蟲到成蟲生活環(huán)境惡劣，但自身卻很少染病。研究顯示，家蠅雖不具有高等生物所具有的獲得性免疫系統(tǒng)，卻能對(duì)病原生物感染做出快速有效的免疫應(yīng)答，這與其強(qiáng)大的先天性免疫系統(tǒng)密切相關(guān)。本課題組前期已經(jīng)對(duì)家蠅的伴侶蛋白TCPⅠ基因進(jìn)行了序列分析并建立了原核表達(dá)體系［8，9］。本研究克隆家蠅的另一個(gè)伴侶蛋白CCTδ基因，并初步探討其時(shí)空表達(dá)模式，旨在為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 家蠅由貴州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度28℃，相對(duì)濕度65%，光照周期10 L∶14 D，3齡幼蟲均重26.5 mg。

1.1.2 主要試劑 總RNA提取試劑盒（RNAiso PLUS）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA標(biāo)志物（DL2000 DNA Marker）、瓊脂糖等購置于TaKaRa公司；其余試劑購于Invitrogen上海生工生物公司。

引物合成：基因擴(kuò)增引物合成由Invitrogen上海生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 家蠅CCTδ基因的識(shí)別及序列測(cè)定 對(duì)測(cè)定得到的家蠅3 齡幼蟲EST序列進(jìn)行Blastx 分析，從中篩選獲得編碼家蠅CCTδ基因的文庫質(zhì)粒，命名為家蠅CCTδ。

1.2.2 CCTδ基因的生物信息學(xué)分析

1.2.2.1 理化性質(zhì)分析 用DNASTAR5.0 軟件分析cDNA序列和開放閱讀框；利用瑞士生物信息學(xué)研究所的蛋白分析專家系統(tǒng)（Expert Protein Analysis System，ExPASy）提供的生物信息學(xué)工具Protparam，分析預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的氨基酸殘基性質(zhì)、分子量及理論等電點(diǎn)等；ProtScale 分析蛋白質(zhì)的疏水性質(zhì)。采用Signal P分析信號(hào)肽序列。利用丹麥科技大學(xué)（DTU）的CBS服務(wù)器上的TMHMM Server v. 2.0程序進(jìn)行蛋白序列跨膜區(qū)分析。

1.2.2.2 結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測(cè) 運(yùn)用PBIL LYONGERLAND信息庫對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，主要用Hopfield神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（HNN）預(yù)測(cè)。

1.2.2.3 CCTδ基因系統(tǒng)進(jìn)化分析 采用鄰接法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹。該樹比對(duì)來自BLAST分析得到不同物種的CCT的氨基酸序列，并計(jì)算了它們之間序列的相似性，利用MEGA6.0軟件對(duì)這些CCT分子進(jìn)行了分子系統(tǒng)學(xué)分析，在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹的基礎(chǔ)上研究了CCTδ的分類歸屬及其與其它昆蟲CCT基因之間的進(jìn)化關(guān)系。

1.2.3 CCTδ 基因的擴(kuò)增 根據(jù)已獲得的CCTδ編碼序列，利用DNA Club和Primer5.0設(shè)計(jì)引物。上游引物：5'-ATGGCACCGAAAGCAGGAAACGTT-3'，下游引物：5'-TTAAGAAATAGTATTGACAATATCGTCG -3'。以篩選到的家蠅3齡幼蟲cDNA文庫中CCTδ基因的質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，60℃ 1 min，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析CCTδ基因表達(dá)模式提取家蠅不同發(fā)育時(shí)期（卵，1、2、3齡幼蟲，蛹，雄成蟲以及雌成蟲），以及不同組織（3齡幼蟲體壁、氣管、唾液腺、脂肪體、馬氏管及中腸）的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄以獲得總cDNA，根據(jù)擴(kuò)增得到的CCTδ基因的cDNA序列在其保守序列區(qū)設(shè)計(jì)特異引物，上游引物序列為5'-CCTCGGTTGTTGTTATTGC-3'。下游引物序列為5'-AGATGGCTGTGGGATGG-3'。內(nèi)參根據(jù)家蠅GAPDH序列設(shè)計(jì)，上游引物為5'-CATCATCTCCGCTCCATC-3'。下游引物為5'-AAGCCATACCAGTGAGTTTACC-3'。實(shí)時(shí)熒光定量PCR按照RealMasterMIX（SYBR Green）試劑盒說明書進(jìn)行操作，同時(shí)設(shè)置無模板陰性對(duì)照，每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)重復(fù)。采取兩步PCR法：95℃預(yù)變性10 s；95℃變性10 s，58℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)在ABI 7500 fast定量PCR儀上進(jìn)行，數(shù)據(jù)采用2-△△Ct方法分析。

2 結(jié)果

2.1 CCTδ基因編碼蛋白的理化性質(zhì)

CCTδ基因編碼的蛋白與家蠅TCP-1蛋白的相似性為99%，從比對(duì)的高同源性判斷該基因是家蠅的CCTδ蛋白。ORF全長(zhǎng)1 602 bp，編碼533個(gè)氨基酸（圖1），預(yù)測(cè)分子量為57.16 kD，理論等電點(diǎn)（pI值）7.50；Signal P 4.1預(yù)測(cè)該蛋白N端無信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白。蛋白序列跨膜區(qū)分析顯示無明顯跨膜區(qū)，不可能是膜上的受體或定位于膜上。根據(jù)氨基酸分值越低親水性越強(qiáng)和分值越高疏水性越強(qiáng)的規(guī)律可知，該基因編碼的蛋白多肽鏈第478位具有最低的分值-2.800（最強(qiáng)的親水性），第106位具有最高的分值3.100（最強(qiáng)的疏水性），整個(gè)多肽鏈表現(xiàn)為親水性（圖2）。該蛋白的533個(gè)氨基酸中強(qiáng)堿性氨基酸（K、R）有64個(gè)，強(qiáng)酸性氨基酸（D、E）有63個(gè)，疏水氨基酸（A、I、L、F、W、V）有218個(gè)，不帶電荷的極性氨基酸有（N、C、Q、S、T、Y）123個(gè)。屬于親水性的堿性蛋白。

2.2 CCTδ的二級(jí)結(jié)構(gòu)

二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和不規(guī)則卷曲為主（圖3），α-螺旋占53.85%，不規(guī)則卷曲占31.14%，延伸鏈占15.01%。

2.3 CCTδ蛋白進(jìn)化樹分析

利用GenBank 數(shù)據(jù)庫已有的昆蟲CCT蛋白的氨基酸序列：XP004530495（地中海實(shí)蠅，Ceratitis capitata）、XP011212093.1（桔小實(shí)蠅，Bactrocera dorsalis）、ETN59839.1（中華按蚊，Anopheles darlingi）、XP001652354.1（埃及伊蚊，Aedes aegypti）、AHB3-3471.1（東亞飛蝗，Locusta migratoria）、XP006607-767.1（大蜜蜂，Apis dorsata）、XP011056947.1（巴拿巴切葉蟻，Acromyrmex echinatior）、EHJ77689.1（大紅斑蝶，Danaus plexippus）、NP001040108.1（家蠶，Bombyx mori），采用NJ法構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果（圖4）顯示，昆蟲CCTδ在進(jìn)化上具有較好的保守性，相比其他物種而言，家蠅CCTδ在進(jìn)化上與同屬于雙翅目的中華按蚊的遺傳距離較近。

2.4 CCTδ基因擴(kuò)增鑒定

CCTδ基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后，獲得了1 602 bp左右的特異條帶（圖5）。

2.5 CCTδ基因表達(dá)模式分析

2.5.1 不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況 在家蠅的卵、1齡幼蟲、2齡幼蟲、3齡幼蟲、蛹和雌雄蠅各生長(zhǎng)階段中，CCTδ基因均有不同程度表達(dá)，但在蛹期及雌蟲中的表達(dá)量高，在2齡幼蟲及雄蟲中的表達(dá)量最低（圖6）。

2.5.2 不組織部位的表達(dá)情況 家蠅CCTδ基因在不同組織中亦有表達(dá)，以氣管表達(dá)量最高，唾液腺次之，在脂肪體和體壁中表達(dá)量均較低（圖7）。

3 討論

CCT 蛋白屬于Hsp60家族II類亞族，是由8個(gè)亞基組成的聚合體，存在于古細(xì)菌［10］和真核細(xì)胞質(zhì)［11-13］。它能確保一些參與細(xì)胞生存及生長(zhǎng)的蛋白正確折疊，包括微管蛋白、肌動(dòng)蛋白［14］、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白、POLO樣激酶1、細(xì)胞周期素E和VHL腫瘤抑制蛋白等。相關(guān)研究表明，CCT除了在細(xì)胞正常生理活動(dòng)發(fā)揮作用外，還與一些疾病的病理過程有關(guān)，如神經(jīng)系統(tǒng)疾病、分子病、腫瘤及免疫系統(tǒng)疾病等，具有較好的應(yīng)用前景［15］。然而，關(guān)于家蠅CCT蛋白的研究很少。

本研究克隆了CCTδ基因完整編碼序列，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并初步探索其時(shí)空表達(dá)模式。CCTδ基因編碼的蛋白與家蠅TCP-1蛋白的相似性為99%，從比對(duì)的高同源性判斷該基因是家蠅的CCTδ蛋白。通過分子進(jìn)化分析該基因與同屬于雙翅目的中華按蚊的遺傳距離較近。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析CCTδ基因在不同時(shí)期均有表達(dá)，以蛹期表達(dá)量最高，提示CCTδ基因參與了家蠅的個(gè)體發(fā)育。相關(guān)研究表明，雞的CCT基因在性未成熟及成熟階段均在卵巢組織中有表達(dá)［16-18］，分子伴侶蛋白可激活信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞由G1期快速過渡，最終促進(jìn)細(xì)胞增殖［19］。CCTδ基因在雌成蟲期表達(dá)量高，提示該基因在卵泡的發(fā)育過程中起重要作用。3齡幼蟲的不同組織中以氣管表達(dá)量最高，唾液腺次之，這可能是因?yàn)闅夤艿酿つび性S多排列整齊的微絨毛，分子伴侶蛋白CCT是肌動(dòng)蛋白及微管蛋白生物合成的特異性底物，也是上皮組織微絨毛所必需［20］。唾液腺可分泌唾液及消化酶消化食物，大量消化酶的合成需要大量CCTδ協(xié)助消化酶前體正確折疊和運(yùn)輸。因此，推測(cè)CCTδ基因在家蠅發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

圖1 CCTδ蛋白開放閱讀框cDNA序列及對(duì)應(yīng)編碼的氨基酸序列

圖2 CCTδ基因編碼蛋白疏水性分析

圖3 CCTδ基因二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

4 結(jié)論

本研究以CCTδ基因的cDNA文庫質(zhì)粒為模板，通過PCR的方法進(jìn)行擴(kuò)增，得到了特異性家蠅CCTδ基因片段。運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析了該基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了CCTδ基因在家蠅不同發(fā)育階段和組織部位的表達(dá)情況。

［1］Min W， Angileri F， Luo H， Lauria A. A human CCT5 gene mutation causing distal neuropathy impairs hexadecamer assembly in an archaeal model［J］. Scientific Reports， 2014， 4：6688.

［2］Kim YE， Hipp MS， Bracher A， et al. Molecular chaperone functions in protein folding and proteostasis［J］. Annu Rev Biochem， 2013，82：323-355.

［3］Nie ZQ， Wu YG， Meng JZ. The function and application of molecular chaperonin［J］. Chinese Bull Life Sci， 2006， 18（1）：84-89.

［4］吳成龍， 張文兵， 麥康森， 等. 皺紋盤鮑伴侶蛋白CCTζ的分子克隆及其在不同鋅含量日糧處理下的表達(dá)分析［J］. 水生生物學(xué)報(bào)， 2012， 36（3）：393-402.

［5］Roobol A， Roobol J， Carden MJ， et al. The chaperonin CCT interactswith and mediates the correct folding and activity of three subunits of translation factor elF3：b， i and h［J］. Biochem J， 2014， 458（2）：213-224.

圖4 CCTδ蛋白進(jìn)化樹分析

圖5 家蠅CCTδ基因cDNA片段的擴(kuò)增

圖6 CCTδ基因在不同時(shí)期的相對(duì)表達(dá)分析

圖7 CCTδ基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)分析

［6］段芳蕾， 孫興旺， 曹靈. 真核細(xì)胞伴侶素CCT 及其與細(xì)胞骨架的關(guān)系［J］. 中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)， 2011， 33：822-825.

［7］王芳， 陳炯， 史雨紅， 等. 梅氏新貝尼登蟲熱休克蛋白60 基因的克隆、序列分析及應(yīng)激表達(dá)分析［J］. 動(dòng)物學(xué)研究， 2012，33（6）：603-608.

［8］趙學(xué)軍， 國果， 修江帆， 等. 家蠅伴侶蛋白CCTη基因序列分析與表達(dá)模式［J］. 中國公共衛(wèi)生， 2015， 31（8）：1043-1046.

［9］ 趙學(xué)軍， 國果， 吳沁怡， 等. 家蠅伴侶蛋白TCP-1基因的序列分析、克隆及誘導(dǎo)表達(dá)［J］. 生物技術(shù)通報(bào)， 2014（10）：151-155.

［10］ Chen HY， Zhang CX， Ma XK， et al. Heat shock proteins of the hyperthermophilic archaea［J］. Chinese Journal of Biotechnology，2008， 24（12）：2011-2021.

［11］ Feder ME， Hofmann GE. Heat-shock proteins， molecular chaperones， and the stress response：evolutionary and ecological physiology［J］. Annual Review of Physiology， 1999， 61：243-282.

［12］ Wang W， Vinocur B， Shoseyov O， et al. Role of plant heatshock proteins and molecular chaperones in the abiotic stress response［J］. Trends in Plant Science， 2004， 9（5）：244-252.

［13］Hartl FU. Molecular chaperones in cellular protein folding［J］. Nature， 1996， 381（13）：571-579.

［14］McCallum CD， Do H， Johns AE， et， al. The Interaction of the Chaperonin Tailless Complex Polypeptide 1（TCP1）Ring Complex（TRiC）with ribosome-bound nascent chains examined using photo-cross-linking［J］. The Journal of Cell Biology， 2000，149（3）：591-601.

［15］Mansilla MJ， Montalban X， Espejo C. Heat shock protein70：Roles in multiple sclerosis［J］. Molecular Medicine， 2012， 18：1018-1028.

［16］Wei Q， Zhu G， Cui X， et al. Expression of CCT6A mRNA in chicken granulosa cells is regulated by progesterone［J］. Gen Comp Endocrinol， 2013， 189：15-23.

［17］李楠， 王麗麗， 曹嫦妤， 等. 雞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶Calnexin基因的生物信息學(xué)與組織表達(dá)譜分析［J］. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2014，34（8）：1304-1313.

［18］王麗麗， 李楠， 曹嫦妤， 等. 雞鈣離子結(jié)合分子伴侶Calreticulin 的結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測(cè)及組織表達(dá)特性［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014， 47（19）：3875-3882.

［19］胡瑩瑩， 韓艷艷， 趙佳維， 等. 上調(diào)分子伴侶mortalin經(jīng)由MAPK-ERK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖［J］. 解剖學(xué)報(bào)， 2014， 45（3）：338-343.

［20］Saegusa K， Sato M， Sato K， et al. C. elegans chaperonin CCT/TRiC is required for actin and tubulin biogenesis and microvillus formation in intestinal epithelial cells［J］. Mol Biol Cell， 2014，20， E13-09-0530.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Cloning，Bioinformatic Analysis and Expression Patterns of Chaperonin Gene CCTδ from Musca domestica

TAO Ru-yu ZHAO Xue-jun YANG Yu-jin WU Jian-wei GUO Guo
（Basic Medical College，Guizhou Medical University，Guiyang 550004）

This work aims to clone，have bioinformatic analysis and explore the expression patterns of chaperonin gene CCTδ from Musca domestica. We screened and isolated the gene CCTδ from the built cDNA plasmid library of M. domestica larva by EST sequencing，and having the plasmid as template，the amplification was conducted by PCR. Further，with bioinformatics we analyzed the structures and functions of gene CCTδ and the encoded protein，and constructed phylogenetic tree. We collected the bodies at different developmental stages of M. domestica life history（eggs，varied-instar larvae，pupae，female and male adults），and chose 6 tissues of 3-instar larvae（body wall，trachea，salivary glands，fat body，markov tube，and midgut），thus the expression patterns of gene CCTδ at different developmental stages and tissues of M. domestica were detected by real-time quantitative PCR. An about 1 600 bp specific fragment of housefly's gene CCTδ was acquired by PCR amplification. The open reading frame of gene CCTδ was 1 602 bp that encoded a putative protein with 533 amino acids. The predicted molecular weight of the protein was 57.16 kD and pI was 7.50. The secondary structures were mainly composed of α-helix and random coil. Comparative analysis of the phylogenetic tree showed that it was conservative，and the genetic distance was closer with Anopheles darlingi. The spatial and temporal expression patterns of gene CCTδ revealed that gene CCTδ expressed in each developmental stage of M. domestica，while the highest at pupa stage；and it expressed the highest in trachea among various tissues of 3-instar larvae. Conclusively，in this study，the gene CCTδ of M. domestica was successfully cloned，and the spatial and temporal expression patterns of gene CCTδ were preliminarily explored.

Musca domestica；CCTδ gene；bioinformatic analysis；expression pattern

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.019

2015-08-17

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81160204，81360254），貴州省衛(wèi)生廳基金項(xiàng)目（gzwjkj2014-2-100），國家科技部支撐計(jì)劃課題子課題（2011BAC06B12），貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目（黔科合J字［2012］2038號(hào)）

陶如玉，女，碩士研究生，研究方向：昆蟲分子免疫；E-mail：494858079@qq.com

國果，女，博士，研究方向：昆蟲分子免疫；E-mail：guoguojsc@163.com