Us11的表達(dá)及其多克隆抗體的制備

童海燕李國(guó)毅，2湯穎

（1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，哈爾濱 150001；2.同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院，上海 200085）

Us11的表達(dá)及其多克隆抗體的制備

童海燕1李國(guó)毅1，2湯穎1

（1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，哈爾濱 150001；2.同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院，上海 200085）

已有研究發(fā)現(xiàn)單純皰疹病毒1（HSV-1）感染后，病毒的Us11 蛋白在拮抗宿主先天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。通過(guò)合成HSV-1的Us11基因，克隆表達(dá)制備針對(duì)Us11的多克隆抗體，為研究Us11的功能以及與宿主蛋白的相互作用提供的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。通過(guò)人工合成Us11基因并以其為模板擴(kuò)增，回收Us11基因片段，克隆至原核和真核表達(dá)載體；誘導(dǎo)表達(dá)Us11蛋白并純化，制備Us11兔源多克隆抗體；轉(zhuǎn)染質(zhì)粒至293T細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞表達(dá)的蛋白進(jìn)行間接免疫熒光（IFA）和免疫印跡（WB）檢測(cè)。成功構(gòu)建pCold-Us11和pFLAG-Us11質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)可溶性Us11蛋白表達(dá)，純化的Us11蛋白免疫動(dòng)物獲得針對(duì)Us11的多克隆抗體。IFA和Western blot結(jié)果顯示，制備的抗血清能特異性檢測(cè)到pFLAG-Us11轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞表達(dá)的Us11蛋白。

Us11；原核表達(dá)；真核表達(dá)；多克隆抗體

單純皰疹病毒1型（herpes simplex virus type 1，HSV-1）是一種全世界流行的皰疹性疾病病原體［1］。HSV-1基因組152 kb的雙鏈DNA，編碼76個(gè)以上的病毒蛋白。HSV-1主要感染人的口腔、皮膚黏膜、眼粘膜及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起齦口炎、唇皰疹、咽炎、角膜炎和皰疹性腦炎，而HSV-1引發(fā)的腦炎對(duì)人類健康危害最為嚴(yán)重［2］。近年來(lái)我國(guó)HSV-1感染發(fā)病率迅速上升，由其所引起的單純皰疹病毒性腦炎（herpes simplex encephalitis，HSE）約占腦炎病例的5%-20%，占病毒性腦炎病例的20%-68%［3］。然而，HSV-1引發(fā)腦炎的病理機(jī)制尚不十分清楚。已有研究表明HSV-1 感染后，病毒Us11 蛋白在拮抗宿主先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Us11能拮抗I 型干擾素刺激產(chǎn)生的抗病毒蛋白PKR、2'-5'寡腺苷酸合成酶；此外HSV-1 Us11 蛋白能隔離dsRNA，阻斷了dsRNA激活PKR［2，4，5］。為了研究HSV-1利用Us11拮抗宿主抗病毒免疫應(yīng)答的機(jī)制，本研究分別構(gòu)建Us11原核和真核表載體統(tǒng)，原核表達(dá)Us11蛋白并制備Us11兔源多克隆抗體，通過(guò)間接免疫熒光（IFA）、免疫印跡（Western blot）實(shí)驗(yàn)鑒定Us11真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞并表達(dá)Us11蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)菌、細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）由本實(shí)驗(yàn)室保存；293T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；新西蘭大耳白實(shí)驗(yàn)兔購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑與耗材 原核表達(dá)載體pCold I和真核表達(dá)載體pFLAG 7.1由本實(shí)驗(yàn)室保存；Us11基因、核苷酸引物和序列測(cè)定由上海桑尼生物完成；Taq DNA聚合酶、T4連接酶、限制性內(nèi)切酶、DNA純化試劑盒、DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量marker購(gòu)自TaKaRa（大連）公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker（普通及預(yù)染）購(gòu)自Fermentas公司；異丙基-β-D 硫代半乳糖苷（IPTG）購(gòu)自Sigma公司；弗氏完全佐劑（FCA）和弗氏不完全佐劑（FICA）購(gòu)自Sigma公司；質(zhì)粒小量/大量抽提試劑盒購(gòu)自Axygen公司；His標(biāo)簽蛋白純化預(yù)裝柱購(gòu)自GE公司；3 kD蛋白超濾管購(gòu)自Millipore 公司；羊抗兔IgG-HRP、羊抗兔IgGFITC購(gòu)自CTL公司；West Pico化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自Thermo scientific公司；Lipofectamine? 3000購(gòu)自Invitrogen公司，其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 HSV-1 Us11基因擴(kuò)增 通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查詢Human herpesvirus 1 strain F Us11基因（GenBank：GQ999614.1），根據(jù)序列合成Us11全長(zhǎng)基因。

根據(jù)合成的Us11基因序列，在全長(zhǎng)Us11兩端設(shè)計(jì)PCR引物序列，引物5'末端引入酶切位點(diǎn)。引物序列如下：

上游引物：5'-GGCAAGCTT atgagccagacccaacccccg-3'（下劃線為Hind III 酶切位點(diǎn)），下游引物：5'-GGCGAATTCctatacagacccgcgagccg-3'（下劃線為EcoR I酶切位點(diǎn)）。

以合成的Us11基因?yàn)槟０?，擴(kuò)增Us11基因用于表達(dá)載體克隆。PCR反應(yīng)體系為：95℃5 min；95℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，切膠回收目的片段。

1.2.2 pCold -Us11原核表達(dá)載體構(gòu)建 將pCold I載體和Us11回收片段分別用Hind III、EcoR I雙酶切，回收純化后使用T4 DNA連接酶連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后涂布于LB/Amp 平板培養(yǎng)，挑取克隆進(jìn)行PCR、酶切和測(cè)序鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒命名為pCold-Us11。

1.2.3 Us11蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主表達(dá)菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種至LB/Amp液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日以1∶100比例轉(zhuǎn)接至新鮮LB/AMP培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2-3 h，OD600值到達(dá)0.6時(shí)取出，冷卻至15℃時(shí)加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，15℃振蕩培養(yǎng)24 h。誘導(dǎo)后的菌液冷卻后離心收集菌體，PBS（0.1 mmol/L PMSF）重懸，在冰浴中超聲波破碎，12 000 r/min 4℃離心后分別收集裂解后的沉淀和上清，加入5X電泳上樣緩沖液，100℃煮沸5 min后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分析目的蛋白可溶性表達(dá)情況。同時(shí)設(shè)置pCold I空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）宿主菌和BL21（DE3）空菌同步誘導(dǎo)作為對(duì)照。

將重組菌單克隆按上述方法接種擴(kuò)大培養(yǎng)，超聲波裂解菌體后獲得上清，按照HisTrap FF Crude操作手冊(cè)純化蛋白，然后使用3 kD蛋白超濾管3 500 r/min 4℃濃縮蛋白。濃縮蛋白通過(guò)SDS-PAGE鑒定并使用分光光度計(jì)測(cè)定濃度，分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 Us11兔源多克隆抗體的制備 取純化后Us11蛋白，加入等體積的佐劑，充分乳化，皮下多點(diǎn)注射免疫健康的新西蘭大耳白兔，每只每次免疫蛋白量為100 μg?；A(chǔ)免疫使用福氏完全佐劑，加強(qiáng)免疫使用福氏不完全佐劑，每次免疫間隔2周，共免疫3次。第3次免疫后2周，對(duì)兔子心臟采血，分離血清，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 pFLAG-Us11真核表達(dá)載體的構(gòu)建和擴(kuò)增 將pFlag 7.1載體和Us11回收片段分別用Hind III 、EcoR I雙酶切，回收純化后使用T4 DNA連接酶連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后涂布于LB/Amp 平板培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR、酶切和測(cè)序鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒命名為pFLAG-Us11。

挑取重組菌單克隆接種至LB/Amp液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，收獲菌體使用質(zhì)粒大量提取試劑盒提取pFLAG-Us11質(zhì)粒，分裝-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 IFA檢測(cè)293T細(xì)胞表達(dá)Us11蛋白 將293T細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70% 時(shí)將pFLAG-Us11質(zhì)粒按照Lipofectamine? 2000操作手冊(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，質(zhì)粒 500 ng/孔。培養(yǎng)48 h后取出細(xì)胞板，用PBS溫和清洗細(xì)胞，加入4%多聚甲醛4℃固定細(xì)胞30 min，清洗后用0.1% TritonX-100室溫透化細(xì)胞5 min，清洗細(xì)胞棄多余液體。以制備的Us11兔抗血清為一抗，按1∶1 000稀釋加入細(xì)胞37℃孵育1 h。PBS清洗細(xì)胞4遍，以羊抗兔IgG-FITC為二抗，1∶1 000稀釋加入細(xì)胞37℃孵育1 h。PBS清洗細(xì)胞4遍，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。

1.2.7 Western blot檢測(cè)pFLAG-Us11轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)Us11蛋白 將293T細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%時(shí)將pFLAG-Us11質(zhì)粒按照Lipofectamine? 2000操作手冊(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，質(zhì)粒 500 ng/孔。培養(yǎng)48 h后取出細(xì)胞板，用PBS溫和清洗細(xì)胞，加入RIPA裂解液充分反應(yīng)后吸取裂解液4將293T細(xì)胞 12 000 r/min離心10 min。獲取上清蛋白液進(jìn)行SDS-PAGE，取下凝膠在在半干轉(zhuǎn)印儀中轉(zhuǎn)移至PVDF膜，恒壓20 V轉(zhuǎn)移20 min。取出PVDF膜在含5%脫脂乳的TBST中4℃封閉過(guò)夜。次日用PBST洗兩遍，Us11兔抗血清用封閉液按1∶500稀釋后加到PVDF膜上，室溫緩慢搖晃2 h。取出膜用PBST搖晃洗滌3遍，每次10 min。1∶5 000稀釋的羊抗兔IgG-HRP作為二抗，室溫緩慢搖晃1 h，同樣用PBST搖晃洗滌3遍，最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，在膠片上曝光。

2 結(jié)果

2.1 pCold-Us11原核表達(dá)載體構(gòu)建和鑒定

根據(jù)GenBank收錄的Human herpesvirus 1 strain F Us11基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，從合成的基因模板擴(kuò)增出Us11全長(zhǎng)475 bp（圖1），連接到pCold I載體。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定和Hind III 、EcoR I雙酶切鑒定（圖1）。重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示，Us11基因序列和GenBank中的Human herpesvirus 1 strain F Us11序列一致。證明pCold I-Us11原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖1 Us11基因擴(kuò)增和pCold-Us11原核表達(dá)載體酶切鑒定

2.2 Us11蛋白的原核表達(dá)、純化及其抗血清的制備

在IPTG誘導(dǎo)下，pCold I-Us11在BL21（DE3）中可溶性表達(dá)，目的蛋白17.4 kD（圖2）。大量表達(dá)后經(jīng)過(guò)鎳離子柱純化并進(jìn)行濃縮，蛋白液濃度為1.6 mg/mL。收獲的Us11蛋白和佐劑充分乳化后多點(diǎn)免疫大耳白兔，免疫3次后采集抗血清，用于真核表達(dá)載體pFLAG-Us11轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)鑒定分析。

圖2 pCold I-Us11在BL21（DE3）中的表達(dá)

2.3 pFLAG-Us11真核表達(dá)載體構(gòu)建和鑒定

將PCR擴(kuò)增出的Us11全長(zhǎng)基因片段連接到pFlag7.1載體，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定和Hind III 、EcoR I雙酶切鑒定（圖3）。重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示，Us11基因序列和GenBank中的Human herpesvirus 1 strain F Us11序列一致。證明pFlag7.1-Us11真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖3 pFLAG-Us11真核表達(dá)載體酶切鑒定

2.4 pFlag7.1-Us11轉(zhuǎn)染細(xì)胞鑒定

鑒定正確的重組菌單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，大量抽提質(zhì)粒后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，以制備的Us11兔血清為一抗進(jìn)行FIA檢測(cè)，用熒光顯微鏡觀察，可見(jiàn)轉(zhuǎn)染pFLAG-Us11重組質(zhì)粒的細(xì)胞綠色熒光彌散分布整個(gè)胞漿，而轉(zhuǎn)染pFlag7.1空載體的細(xì)胞未見(jiàn)免疫熒光（圖4）。同時(shí)，將pFLAG-Us11質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)后裂解獲取上清，SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，以制備的Us11兔血清為一抗進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果（圖5）顯示，重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物在17.4 kD處產(chǎn)生特異性條帶，而對(duì)照組無(wú)免疫印跡。實(shí)驗(yàn)表明，上述制備的Us11兔多抗能鑒定pFLAG-Us11在細(xì)胞中的真核表達(dá)。

圖4 IFA檢測(cè)Us11蛋白真核表達(dá)

圖5 Western blot檢測(cè)Us11蛋白真核表達(dá)

3 討論

HSV-1原發(fā)感染后機(jī)體很快產(chǎn)生特異性的免疫力，清除大部分病毒從而使癥狀消失。也有少數(shù)病毒可長(zhǎng)期潛伏在神經(jīng)節(jié)中的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，但不產(chǎn)生臨床癥狀［2，3，6］，當(dāng)機(jī)體免疫力低下時(shí)，病毒引起復(fù)發(fā)性局部皰疹。疫苗和抗病毒藥物依然是預(yù)防和治療HSV-1感染的最佳選擇，但HSV-1的疫苗研制多處于研究階段［5，7-9］。葛蘭素史克公司（Glaxo Smith Kline，GSK）研制的HSV糖蛋白D（gD-2）的亞單位疫苗實(shí)驗(yàn)表明只對(duì)HSV-1和HSV-2血清陰性的女性有效，而對(duì)男性和HSV-1血清陽(yáng)性的女性群體免疫效果不佳。Chiron公司研發(fā)的HSV-2糖蛋白B（gB-2）和gD-2聯(lián)合亞單位疫苗因免疫后雖然能產(chǎn)生抗體，但不能抑制對(duì)HSV-2的感染，最終停止了研究［5，6，10］。廣泛使用阿昔洛韋（acyclovir，ACV）導(dǎo)致HSV耐藥毒株自1982年就已出現(xiàn)，在免疫系統(tǒng)正常的HSV患者中感染ACV耐藥毒株比例在0.6%以下，而免疫缺陷的患者中ACV耐藥毒株比例高達(dá)3%-6%，骨髓移植受體HSV患者的耐藥毒株比例達(dá)14%。目前仍無(wú)用于臨床安全有效的HSV-1疫苗，其重要原因是HSV-1感染宿主后的致病機(jī)制及病毒逃避宿主免疫反應(yīng)的機(jī)制還不完全清楚［7］。

類似于大多數(shù)病毒，HSV-1進(jìn)化出多種策略對(duì)抗宿主的先天免疫反應(yīng)，如干擾IFN信號(hào)途徑和IFN刺激基因的抗病毒功能，抑制病毒感染細(xì)胞的凋亡利于病毒復(fù)制等機(jī)制［11］。在HSV-1復(fù)制周期早期階段病毒能夠抑制干擾素刺激基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的積聚，這是通過(guò)早期蛋白ICP0抑制IRF3介導(dǎo)的ISGs的轉(zhuǎn)錄激活［12］。值得注意的是，HSV-1感染晚期，能夠在IFN處理的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制而不會(huì)激活RNase L介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)途徑。HSV-1 感染后Us11 蛋白能抑制2'-5'寡腺苷酸合成酶（2'-5'OAS）的合成，2'-5'OAS/RNase L途徑是IFNs刺激的經(jīng)典抗病毒先天免疫反應(yīng)。Us11蛋白R(shí)NA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是抑制OAS必需的。已有研究報(bào)道Us11能抑制PKR和PACT介導(dǎo)的抗病毒途徑，其中研究較多的是HSV-1拮抗I 型IFN刺激產(chǎn)生的抗病毒蛋白PKR、2'-5'寡腺苷酸合成酶。PKR是宿主重要抗病毒蛋白，能抑制HSV-1的復(fù)制［13］。目前研究表明，HSV-1抑制PKR的抗病毒功能至少涉及兩種機(jī)制。HSV-1 L蛋白ICP34.5 能提高蛋白磷酸酶1（PP1）的表達(dá)，阻斷PKR介導(dǎo)的磷酸化eIF2進(jìn)程，從而干擾PKR-eIF2抗病毒途徑。此外，HSV-1 Us11 蛋白能隔離dsRNA，阻斷dsRNA激活PKR。Us11 和ICP34.5 蛋白在對(duì)抗IFNs的抗病毒功能中發(fā)揮作用。而且Us11還能抑制 2'-5'寡腺苷酸合成酶抗病毒系統(tǒng)［14，15］。Us11能結(jié)合RNA，干擾TLR3和RLR對(duì)dsRNA的識(shí)別作用。

4 結(jié)論

本研究運(yùn)用分子生物學(xué)方法，表達(dá)了Us11蛋白并免疫兔子制備了多克隆抗體，并使用該抗體對(duì)Us11的真核表達(dá)進(jìn)行了鑒定，為深入研究HSV-1 Us11拮抗宿主先天免疫反應(yīng)提供有價(jià)值的技術(shù)手段和實(shí)驗(yàn)材料。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Expression of Protein Us11 and Preparation of Polyclonal Antibodies

TONG Hai-yan1LI Guo-yi1，2TANG Ying1
（1. The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150001；2. Oriental Hospital Affiliated to Tongji University，Shanghai 200085）

The previous studies have discovered that protein Us11 of HSV-1（herpes simplex virus 1）played an important role in antagonistic host innate immune responses after HSV-1 infection. By synthesizing the gene Us11 of HSV-1，the polyclonal antibodies for Us11 were cloned and prepared，which provided the solid experimental basis for studying the functions of Us11 and the interactions between Us11 and host protein. The artificially-synthesized gene Us11 was as template and amplified，and then the recycled gene fragments of Us11 were cloned into the prokaryotic and eukaryotic expression vectors. Further，the induced expressed Us11 protein was purified，and polyclonal antibodies for rabbit were prepared. The recombinant plasmid was transfected into 293T cells；the expressed protein was detected by indirect immunofluorescence（IFA）and Western blot（WB）. Plasmid pCold-Us11 and pFLAG-Us11 were successfully constructed，soluble Us11 protein expression was achieved，and the polyclonal antibodies targeting for Us11 was acquired by immunizing animal with purified Us11 protein. The results from IFA and WB revealed that prepared antiserum may specially detect the Us11 protein expressed in transfected 283T cells by pFLAG-Us11.

Us11；prokaryotic expression；eukaryotic expression；polyclonal antibody

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.033

2015-05-28

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（D201219）

童海燕，碩士研究生，研究方向：中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染；E-mail：tonghaiyan1215@163.com

湯穎，副教授；研究方向：中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染；E-mail：hydtangying@hotmail.com