陳 思， 張小軍， 嚴(yán)忠雍， 李佩佩， 方 益

(浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316100)

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鰹魚(yú)骨硫酸軟骨素提取工藝研究

陳 思， 張小軍*， 嚴(yán)忠雍， 李佩佩， 方 益

(浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316100)

[目的]以鰹魚(yú)骨為原料，對(duì)魚(yú)骨硫酸軟骨素提取方法進(jìn)行研究。[方法]以硫酸軟骨素提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化鰹魚(yú)骨硫酸軟骨素的提取條件。[結(jié)果]在酶添加量2.5%(木瓜蛋白酶:胰蛋白酶為1∶2)、料液比1∶20、提取溫度80 ℃、pH 6.5下浸提24 h、超聲處理30 min，魚(yú)骨硫酸軟骨素的提取率達(dá)2.86%，純度為90.0%。理化分析顯示，鰹魚(yú)骨硫酸軟骨素顏色潔白，水分含量9.2%，氨基己糖含量30.1%，氮含量3.05%，葡萄糖醛酸含量26.9%。通過(guò)紅外光譜分析，確定樣品為硫酸軟骨素C。[結(jié)論]利用優(yōu)化工藝提取鰹魚(yú)骨中的硫酸軟骨素具有可行性，在鰹魚(yú)加工副產(chǎn)物的高值化利用中具有一定的應(yīng)用前景。

鰹魚(yú)骨；硫酸軟骨素；提??；酶解；超聲

硫酸軟骨素(chondroitin sulfate，簡(jiǎn)稱(chēng)CS)是關(guān)節(jié)軟骨處蛋白多糖形成所必需的一類(lèi)糖氨聚糖，廣泛分布于人和動(dòng)物的骨骼、軟骨、肌腱、韌帶和血管壁等組織中[1]。硫酸軟骨素具有增強(qiáng)機(jī)體免疫、抗關(guān)節(jié)炎[2-4]、調(diào)節(jié)血管生成、降血脂[5]、抗病毒[6]、抗凝血[7-9]、抗腫瘤[10-11]等生物活性，主要作為處方藥用于治療風(fēng)濕和類(lèi)風(fēng)濕疾病[12]。此外，硫酸軟骨素在醫(yī)藥、保健食品、美容化妝品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。硫酸軟骨素主要從豬、牛、羊等畜類(lèi)軟骨組織中提取獲得，來(lái)源和工藝[13]較為單一。近年來(lái)，海洋生物作為新的藥用資源日漸受到重視，已從孔鰩[14]、魷魚(yú)[15]、鯊魚(yú)[16]、鮟鱇魚(yú)[17]中提取硫酸軟骨素，但對(duì)于其他海洋魚(yú)類(lèi)硫酸軟骨素的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。鰹魚(yú)(Katsuwonuspelamis)，屬硬骨魚(yú)綱 (Osteichthyes)鱸形總目(Pereiformes)鯖科(Scombridae)鰹屬(Katsuwonus)，海洋中上層魚(yú)類(lèi)，在我國(guó)東海和南海的捕撈量大。鰹魚(yú)除鮮銷(xiāo)外，主要加工成冷凍魚(yú)片或罐裝食品銷(xiāo)售，加工過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物占總重量的50%～70%[18]。魚(yú)骨占副產(chǎn)物的比例較大，有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。筆者以鰹魚(yú)骨為原料，在選擇復(fù)合蛋白酶的基礎(chǔ)上，對(duì)魚(yú)骨硫酸軟骨素的提取效率進(jìn)行研究，以期為鰹魚(yú)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物的高值化利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器鰹魚(yú)骨，舟山水產(chǎn)公司提供；硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；木瓜蛋白酶、胰蛋白酶，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純，購(gòu)于華東醫(yī)藥公司。

723分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠；pH計(jì)，杭州華光無(wú)線電廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州科工貿(mào)有限公司；恒溫水浴箱，上海醫(yī)療器械五廠；AVATAR-360型紅外光譜儀，美國(guó)尼高力公司；攪拌機(jī)，杭州儀表電機(jī)廠；離心沉淀機(jī)，上海醫(yī)用分析儀器廠；冷凍干燥儀，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器公司。

1.2方法

1.2.1原料處理。新鮮鰹魚(yú)骨將余肉剔凈，濕骨60 ℃烘干后粉碎成粉末，4 ℃干燥保存。

1.2.2提取工藝流程。魚(yú)骨干品→木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和蒸餾水提取→離心得上清液→sevag法除蛋白→70%乙醇沉淀→沉淀冷凍干燥→硫酸軟骨素粗品。

1.2.3酶解工藝條件的確定。對(duì)復(fù)合酶的比例和pH進(jìn)行優(yōu)化。取3份各10g鰹魚(yú)骨樣品，按2.0%的比例添加木瓜蛋白酶，按1∶30(M/V)的料液比加入蒸餾水，分別調(diào)節(jié)pH為5.0、6.0、7.0，于50 ℃浸提24h，超聲輔助處理30 min，測(cè)得提取液CS總含量分別為90.7、123.9、185.4 mg。另取3份樣品，采用胰蛋白酶提取，調(diào)節(jié)pH為5.0、6.0、7.0，測(cè)得提取液CS總含量分別為88.5、164.6、116.7 mg。

1.2.4提取率影響因素的確定。①料液比。取鰹魚(yú)骨10 g，酶添加量2.0%(木瓜蛋白酶∶胰蛋白酶為1∶2)，提取溫度50 ℃，pH 6.5下浸提24 h，超聲輔助處理30 min，料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，過(guò)濾后測(cè)定液體中硫酸軟骨素的總含量。②提取溫度。取鰹魚(yú)骨10 g，酶添加量2.0%(木瓜蛋白酶∶胰蛋白酶為1∶2)，按1∶30的料液比加入蒸餾水，pH 6.5下浸提24 h，超聲輔助處理30 min，提取溫度分別為40、50、60、70、80 ℃，過(guò)濾后測(cè)定液體中硫酸軟骨素的總含量。③提取時(shí)間。取鰹魚(yú)骨10 g，酶添加量2.0%(木瓜蛋白酶∶胰蛋白酶為1∶2)，按1∶30的料液比加入蒸餾水，提取溫度50 ℃，pH 6.5下浸提24 h，超聲輔助提取時(shí)間分別為10、20、30、40 min，過(guò)濾后測(cè)定液體中硫酸軟骨素的總含量。④酶添加量。取鰹魚(yú)骨10 g，按1∶30的料液比加入蒸餾水，提取溫度50 ℃，pH 6.5下浸提24 h，超聲輔助處理30 min，酶添加量分別為1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%(木瓜蛋白酶∶胰蛋白酶為1∶2)，過(guò)濾后測(cè)定液體中硫酸軟骨素的總含量。1.3測(cè)定項(xiàng)目與方法①氨基己糖含量。采用衛(wèi)生部頒布藥品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法[19]，并對(duì)關(guān)鍵的兩步：乙?；惋@色操作分別進(jìn)行改進(jìn)[20]，做到冰浴乙?；瑫r(shí)計(jì)時(shí)，顯色隨加隨計(jì)時(shí)。氨基己糖含量×2.82即為CS的含量。②葡萄糖醛酸含量。按照文獻(xiàn)[21]方法進(jìn)行測(cè)定。③氮含量。按照微量凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定。④水分含量。按照常壓干燥法進(jìn)行測(cè)定。⑤紅外光譜分析。在400～4000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)掃描，KBr壓片測(cè)定。

2　結(jié)果與分析

2.1酶解工藝條件的確定由圖1可知，木瓜蛋白酶在pH 7.0下提取效果最好，而胰蛋白酶在pH 6.0時(shí)提取率最高。在此單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步比較復(fù)合酶比例(木瓜蛋白酶∶胰蛋白酶=1∶2、1∶1、2∶1)和pH(6.0、6.5、7.0)對(duì)鰹魚(yú)骨CS提取效果的影響。結(jié)果顯示，復(fù)合酶比例1∶2、pH為6.5時(shí)CS總含量最高，達(dá)205.1 mg。

圖1　復(fù)合酶比例和pH對(duì)硫酸軟骨素提取率的影響Fig.1　Effects of compound enzyme ratio and pH on the extraction rate of the chondroitin sulfate

2.2硫酸軟骨素提取率影響因素的優(yōu)化

2.2.1料液比。由圖2可知，鰹魚(yú)骨中硫酸軟骨素的提取量隨料液比的增大變化較為明顯，當(dāng)料液比從1∶10提高到1∶20時(shí)，CS含量增加，但當(dāng)料液比大于1∶20時(shí)，CS含量逐漸降低。因此，選擇料液比1∶20左右較為合適。

圖2　料液比、溫度、時(shí)間和酶添加量對(duì)硫酸軟骨素提取率的影響Fig. 2　Effects of solid-liquid ratio,temperature,time and enzyme adding amount on the extraction rate of the chondroitin sulfate

2.2.2提取溫度。由圖2可知，隨著提取溫度的升高，硫酸軟骨素的提取量不斷增加，當(dāng)提取溫度為70 ℃時(shí)CS含量達(dá)到最大，而后下降。研究表明，蛋白酶的最適溫度并非保證最好的提取效果，一定的高溫反而有利于CS從魚(yú)骨組織中溶出?？紤]到90 ℃以上的高溫可能對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)和活性有一定的影響，因此，選擇60～80 ℃作為提取的最適溫度。

2.2.3提取時(shí)間。由圖2可知，隨著提取時(shí)間的增加，硫酸軟骨素的提取量相應(yīng)增加；當(dāng)超聲提取時(shí)間由10 min延長(zhǎng)至30 min，CS提取率增加趨勢(shì)明顯；當(dāng)超聲提取時(shí)間為40 min時(shí)，CS含量有所下降。因此，選擇超聲輔助提取時(shí)間30 min左右為宜。

2.2.4酶添加量。由圖2可知，酶添加量在2.5%時(shí)硫酸軟骨素的提取量最高。隨著酶添加量的增加，CS含量變化趨勢(shì)平緩，可見(jiàn)酶添加量對(duì)CS的提取影響并不顯著。

2.3正交試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇料液比、提取溫度、超聲時(shí)間3個(gè)對(duì)硫酸軟骨素提取率影響顯著的因素，以CS提取率為指標(biāo)，按L9(33)進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素水平見(jiàn)表1。

表1　正交試驗(yàn)因素水平

由表2可知，超聲輔助提取硫酸軟骨素的過(guò)程中，提取溫度對(duì)硫酸軟骨素的提取率影響最大，其次是超聲時(shí)間，料液比的影響最小。最佳組合為A2B3C2，即在酶添加量2.5%(木瓜蛋白酶∶胰蛋白酶為1∶2)、料液比1∶20、提取溫度80 ℃、pH 6.5下浸提24 h、超聲處理30 min的最佳工藝條件下，硫酸軟骨素的提取率最高。在此最佳工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，可從鰹魚(yú)骨中提取到28.60 mg/g硫酸軟骨素，提取率達(dá)2.86%。

2.4理化性質(zhì)分析取100 g鰹魚(yú)骨按照優(yōu)化的工藝提取硫酸軟骨素，測(cè)定所得CS的各項(xiàng)指標(biāo)，其結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，鰹魚(yú)骨硫酸軟骨素各項(xiàng)指標(biāo)均符合衛(wèi)生部頒布藥品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的硫酸軟骨素指標(biāo)[19]。

表2硫酸軟骨素提取正交試驗(yàn)結(jié)果

Table 2Results of orthogonal test for the extraction of chondroitin sulfate

試驗(yàn)號(hào)TestNo.因素FactorABC提取率Extractionrate∥%11111.6121222.0831332.1642122.1252232.3062312.1373131.9783211.9293322.53k11.951.901.89k22.182.102.24k32.142.272.14R0.230.370.36

表3　硫酸軟骨素的理化性質(zhì)

圖3　硫酸軟骨素提取率的紅外光譜Fig.3　 Infrared spectrum of the extraction rate of chondroitin sulfate

2.5紅外吸收光譜由圖3可知，紅外光譜在3 430 cm-1附近有一寬的強(qiáng)吸收峰，為糖環(huán)上羥基(-OH)的伸縮振動(dòng)引起；在2 925 cm-1附近有糖分子中甲基(-CH3)伸縮振動(dòng)的特征峰；在1 631 cm-1附近有乙酰氨基(-NHCOCH3-)伸縮振動(dòng)的特征峰；在1 414 cm-1附近有羧基(-COO-)的C=O伸縮振動(dòng)；在1 236 cm-1附近有硫酸基(-O-SO3-)的S=O伸縮振動(dòng)；在1 069 cm-1附近有糖環(huán)醚(C-O-C)伸縮振動(dòng)的特征峰；在926 cm-1附近有吡喃環(huán)非對(duì)稱(chēng)環(huán)伸縮振動(dòng)的特征峰。表明樣品中含有硫酸軟骨素所有羥基、甲基、乙酰氨基、羧基、硫酸基和糖環(huán)等官能團(tuán)，以上紅外光譜特征與其他研究結(jié)果[17,22]一致，表明鰹魚(yú)骨硫酸軟骨素為硫酸軟骨素C。

3　結(jié)論

該研究通過(guò)系列優(yōu)化試驗(yàn)建立了鰹魚(yú)骨中硫酸軟骨素的提取工藝，為有效利用鰹魚(yú)加工副產(chǎn)物提供了新思路。樣品采用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合酶解，80 ℃水浸提24 h并輔以超聲提取， sevag法除蛋白，最后用70%乙醇沉淀獲得鰹魚(yú)骨硫酸軟骨素。該方法硫酸軟骨素提取率達(dá)2.86%，純度為90.0%，產(chǎn)品為白色粉末，水分含量9.2%，氨基己糖含量30.1%，氮含量3.05%，葡萄糖醛酸含量26.9%。紅外光譜特征顯示其為硫酸軟骨素C。

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Extraction Technology of Chondroitin Sulfate fromKatsuwonuspelamisBones

CHEN Si,ZHANG Xiao-jun*,YAN Zhong-yong et al

(Key Laboratory of Marine Aquaculture,Zhejiang Institute of Marine Fisheries,Zhoushan,Zhejiang 316100)

[Objective] To research the extraction methods for chondroitin sulfate (CS) withKatsuwonuspelamisbones as the raw materials. [Method] With the extraction rate of chondroitin sulfate as the evaluation index,the extraction condition for chondroitin sulfate was optimized by single factor test and orthogonal test. [Result] Under the conditions of 2.5% enzyme supplementation (papaini∶trypsin=1∶2),1∶20 solid-liquid ratio,80 ℃ extraction temperature,pH 6.5,extraction for 24 h,and ultrasonic treatment for 30 min,the extraction rate of chondroitin sulfate reached 2.86% and the purity was 90.0%. Physical and chemical analysis showed that chondroitin sulfate was white,containing 9.2% moisture,30.1% hexosamine,3.05% nitrogen,and 26.9% glucuronic acid. Infrared spectroscopic analysis showed that the sample was chondroitin sulfate C. [Conclusion] It is feasible to extract chondroitin sulfate fromKatsuwonuspelamisbones by the optimized method,showing some potential for value-add utilization inKatsuwonuspelamisprocessing wastes.

Katsuwonuspelamisbones; Chondroitin sulfate; Extraction; Enzymolysis; Ultrasound

浙江省公益技術(shù)研究項(xiàng)目(2014C32087)。

陳思(1984- )，女，浙江杭州人，工程師，博士，從事水產(chǎn)品加工及質(zhì)量安全方面的研究。*通訊作者，高級(jí)工程師，博士，從事水產(chǎn)品加工及質(zhì)量安全方面的研究。

2016-07-06

S 986

A

0517-6611(2016)24-069-03