QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定酵母抽提物中9種黃色合成色素

粟有志， 馬曉雯， 孟 茹*， 李 芳， 李艷美， 雷紅琴

(1.伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心，新疆伊寧 835000；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052)

黃色合成色素多數(shù)屬于偶氮類染料，主要用于紡織、制鞋、造紙等工業(yè)領(lǐng)域，具有致畸、致癌性、致突變等毒性作用。檸檬黃、日落黃、喹啉黃等屬于食品添加劑，可在特定食品中添加，但大部分黃色合成色素不允許用于食品。酵母抽提物是一種以酵母為原料經(jīng)自溶、精制等工藝而制得的營(yíng)養(yǎng)豐富的天然調(diào)味料，在調(diào)味品、方便面等食品行業(yè)中具有廣泛的用途[1]。為防止以非法添加黃色合成色素的方式偽造或以次充好酵母抽提物，建立酵母抽提物中黃色合成色素的檢測(cè)方法十分必要。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)黃色合成色素的檢測(cè)主要有酶聯(lián)免疫法[2]、分光光度法[3]、毛細(xì)管電泳法[4]、液相色譜法[5 - 8]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9 - 12]，常見(jiàn)于豆制品、飲料、化妝品等樣品，而酵母抽提物中黃色合成色素的檢測(cè)方法未見(jiàn)報(bào)道。目前，文獻(xiàn)報(bào)道黃色色素的前處理方法主要為固相萃取法，而本文采用簡(jiǎn)便、快捷的QuEChERS方法[13]前處理樣品，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)分析，建立了酵母抽提物中9種黃色合成色素的測(cè)定方法。該方法與文獻(xiàn)報(bào)道方法相比，簡(jiǎn)化了前處理步驟，其靈敏度和檢出限能夠滿足合成色素的殘留限量要求及檢測(cè)確證要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260-6460A液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)，Agilent公司)，配有電噴霧離子源(ESI)；Sigma3-18K型臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó)，Sigma公司)；T18基本型均質(zhì)器和MS3型渦旋振蕩器(德國(guó)，IKA)；N-EVAP-112型水浴氮吹儀(美國(guó)，Organomation公司)；Strata-X-AW固相萃取小柱(60 mg/3mL，美國(guó)Phenomenex公司)；Oasis WAX固相萃取小柱(規(guī)格均為60 mg/3mL，美國(guó)Waters公司)。

日落黃、酸性橙Ⅱ、橙黃G、酸性黃11、酸性黃36均購(gòu)自Dr.Ehrenstorfer公司；酸性黃151購(gòu)自Sigma公司；酸性橙56、酸性黃73、酸性黃79購(gòu)自TCI公司，所有標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于98%。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品1 g(精確至0.01 mg)，用水溶解并定容至1 L，配成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液：用水稀釋配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，各色素的最終濃度為：酸性黃151為1.0 mg/L，酸性黃36、酸性黃73、酸性橙Ⅱ?yàn)?.5 mg/L，酸性黃79、酸性橙56為15 mg/L，橙黃G為25.0 mg/L，日落黃為50 mg/L，酸性黃11為150 mg/L。乙腈、甲醇、丙酮、乙醇、甲酸、正己烷均為色譜純；N-丙基乙二胺(PSA)。C18粉、磺酸化聚苯乙烯/二乙烯苯(PCX)、聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)、酸性氧化鋁(ALA)、氨基(NH2)、石墨化炭黑(GCB)7種吸附劑，均購(gòu)自Agela公司。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

1.2 樣品前處理

稱取1 g樣品(精確至0.01 g)于50 mL具塞離心管，加入10 mL乙腈-甲醇(5∶5，V/V)，10 000 r/min均質(zhì)1 min，超聲30 min，10 000 r/min離心5 min，取上層清液7 mL于15 mL具塞離心管，加入乙腈飽和的正己烷5 mL渦旋30 s，靜置5 min，棄去正己烷層。加入吸附劑C18和PEP粉各0.1 g，搖勻，10 000 r/min離心5 min，取上清液5 mL于10 mL試管中，40 ℃水浴氮吹至干，用1 mL乙腈-水(1∶9,V/V)復(fù)溶。將溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，15 000 r/min離心10 min，上清液供HPLC-MS/MS測(cè)定。

1.3 HPLC-MS/MS條件

色譜柱：Zorbax Eclipse Plus C18柱(100×3.0 mm,1.8 μm)；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10.0 μL；流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為10 mmol/L NH4Ac溶液，流速：0.3 mL/min；梯度洗脫程序如下：0～3.5 min，10%～50%A；3.5～8.5 min，50%～70%A；8.5～9.0 min，70%～90%A；9.0～10.5 min，90%A；10.51～14.5 min，10%A。電離模式：電噴霧負(fù)離子源模式(ESI-)；多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流量：9.0 L/min；鞘氣溫度：300 ℃；鞘氣流速：11.0 L/min，毛細(xì)管電壓:3.5 kV；監(jiān)測(cè)離子對(duì)、碰撞能量、碎裂電壓等參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 9種黃色合成色素的質(zhì)譜分析參數(shù)

*quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

本文所檢測(cè)的9種黃色合成色素均為含有磺酸基的酸性化合物。在不接色譜柱的條件下對(duì)9種色素單一標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子全掃描，確定準(zhǔn)分子離子峰。利用Optimizer軟件對(duì)9種色素的子離子、碎裂電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳的儀器條件。參照歐盟指令657/2002/EEC決議中有關(guān)規(guī)定，本文選擇離子豐度最高、本底干擾最小的兩個(gè)離子對(duì)作為定性離子對(duì)，其中信號(hào)較大的離子對(duì)作為定量離子。通過(guò)比較不同無(wú)機(jī)相與有機(jī)相的組合比較分析發(fā)現(xiàn)，以乙腈-10 mmol/L NH4Ac溶液為流動(dòng)相時(shí)，9種色素的離子化效益較好。通過(guò)優(yōu)化的1.3中的梯度洗脫程序，9種目標(biāo)色素均可獲得較好的分離度和響應(yīng)信號(hào)。

2.2 提取溶劑的選擇

9種黃色合成色素極性均較強(qiáng)，易溶于水。實(shí)驗(yàn)比較了極性溶劑丙酮、水、乙醇、乙腈、甲醇、乙腈-甲醇(5∶5,V/V)、丙酮-甲醇(5∶5,V/V)對(duì)9種色素的提取效果。結(jié)果表明：水和甲醇提取時(shí)，酵母抽提物完全溶于提取劑，樣品易形成糊狀，給后續(xù)凈化帶來(lái)困難；乙腈、丙酮、乙醇、丙酮-甲醇(5∶5,V/V)提取時(shí)，部分色素的回收率達(dá)不到檢測(cè)要求；乙腈-甲醇(5∶5,V/V)提取時(shí)，9種色素提取的回收率為84%～101%，可滿足分析的要求。不同提取溶劑對(duì)酵母抽提物樣品中9種色素的提取效果見(jiàn)圖1。

2.3 凈化條件的選擇

本文比較了PSA、C18、PCX、PEP、NH2、ALA、GCB 7種吸附劑對(duì)樣品的凈化效果。結(jié)果表明：PCX、PSA、GCB、NH2、ALA凈化，部分色素的回收率達(dá)不到檢測(cè)要求，而采用C18和PEP，9種色素的回收率均可滿足檢測(cè)要求。7種吸附劑對(duì)9種合成色素的凈化效果見(jiàn)圖2。

同時(shí)本文還考察了Oasis WAX和Strata-X-AW兩款陰離子固相萃取小柱對(duì)9種色素的凈化效果。結(jié)果表明，兩款固相萃取小柱的回收率均可滿足檢測(cè)要求，但凈化后的9種色素的基質(zhì)效應(yīng)與C18和PEP共同凈化時(shí)無(wú)明顯差別。故本文最終選擇C18和PEP兩種吸附劑共同凈化樣品?？瞻捉湍赋樘嵛飿悠泛吞砑?種黃色合成色素的空白樣品，經(jīng)提取和凈化后的MRM色譜圖見(jiàn)圖3。

2.4 方法的線性關(guān)系、檢出限和定量限

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，樣品基質(zhì)對(duì)9種黃色合成色素均有一定的抑制作用，本文采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線以消除樣品基質(zhì)效應(yīng)。準(zhǔn)確稱取1 g樣品(精確到0.01 g)按照1.2和1.3前處理及儀器分析，當(dāng)各色素定性定量離子信噪比均小于3時(shí)，樣品確定為空白基質(zhì)；空白基質(zhì)按照1.2前處理，最后分別用1、1/2、1/5、1/10、1/20、1/50倍的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL溶解殘?jiān)?，配成基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。以峰面積(y)對(duì)合成色素的質(zhì)量濃度(x)作線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，9種色素在酵母抽提物基質(zhì)中的相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.994。方法的檢出限(S/N>3)為0.01～0.09 mg/kg，定量限(S/N>10)為0.02～3.00 mg/kg。9種黃色合成色素的線性方程、檢出限和定量限詳見(jiàn)表2。

2.5 方法的準(zhǔn)確度和精密度

選擇酵母抽提物空白樣品，以1、2、10 倍LOQ為加標(biāo)水平進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。按照1.2方法和1.3條件進(jìn)行前處理和測(cè)定，每個(gè)水平重復(fù)6次?；厥章屎拖鄬?duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表3。從表3可以看出，9種合成色素的回收率在75.5%～115.1%范圍，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.7%～17.6%，表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度均較好。

表2 9種黃色合成色素的線性方程、檢出限和定量限

表3 9種黃色合成色素的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.6 樣品測(cè)定

利用本方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室送檢的20種酵母抽提物進(jìn)行檢測(cè)，均未發(fā)現(xiàn)目標(biāo)分析物。

3 結(jié)論

本文建立了以甲醇-乙腈(5∶5,V/V)為提取劑，經(jīng)PEP和C18凈化，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定酵母抽提物中日落黃、橙黃G、酸性黃73、酸性橙Ⅱ、酸性橙56、酸性黃11、酸性黃36、酸性黃79和酸性黃151共計(jì)9種黃色合成色素的檢測(cè)方法。該方法操作簡(jiǎn)便、精密度好、回收率高，可為酵母抽提物中此類物質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控提供技術(shù)支持。