戴園園，柏友萍，葉合雙，許曉東，張 晶，崔建飛，李 萌，卓 顏

（池州學(xué)院體育學(xué)院，安徽池州 247100）

不同強度運動對青春期肥胖大鼠Vaspin的影響

戴園園，柏友萍，葉合雙，許曉東，張 晶，崔建飛，李 萌，卓 顏

（池州學(xué)院體育學(xué)院，安徽池州 247100）

目的：探討不同強度運動對青春期肥胖大鼠Vaspin表達(dá)的影響.方法：建模7周后，取32只高脂誘導(dǎo)的肥胖傾向大鼠，隨機分為4組，每組8只，分別為安靜對照組（OC）、低強度運動組（OL）、中強度運動組（OM）、高強度運動組（OH）.OL、OM、OH分別以15－18m／min、21－25m／min和28－32m／min以及坡度均為0°的強度運動，1h／d，5次／周，干預(yù)8周.8周后采集麻醉后大鼠血液及內(nèi)臟脂肪組織，用qRT－PCR測脂肪組織Vaspin mRNA基因表達(dá)，免疫組化測脂肪組織Vaspin蛋白表達(dá)，ELISA測血漿Vaspin濃度.結(jié)果：8周不同強度運動干預(yù)后，大鼠體重、內(nèi)臟脂肪重量、體脂率較OC均下降明顯（P＜0.01），體重OL與OH差異顯著（P＜0.05），OL的內(nèi)臟脂肪重量和體脂率較OM、OH均有差異（P＜0.05、P＜0.01）；內(nèi)臟脂肪組織Vaspin mRNA基因表達(dá)量OC與OH存有顯著差異（P＜0.05）；OL、OM、OH的Vaspin蛋白表達(dá)較OC呈漸進式上升，強度越大，表達(dá)越明顯；血漿Vaspin濃度OH較OC上調(diào)明顯（P＜0.05）.結(jié)論：實施8周不同強度運動后，較好地降低了青春期肥胖大鼠體重、內(nèi)臟脂肪重量和體脂率，運動強度越大，效果越顯著.不同強度運動干預(yù)顯著上調(diào)了Vaspin mRNA基因表達(dá)量、Vaspin蛋白表達(dá)及血漿Vaspin濃度，運動強度越大，上調(diào)幅度越明顯.

運動強度；青春期肥胖；脂肪組織；Vaspin

超重和肥胖會給青少年生理功能帶來諸多不良效應(yīng)，肥胖學(xué)生的身體素質(zhì)呈明顯下降趨勢［1］.脂肪組織不僅可以維持能量平衡，還可以分泌多種脂肪因子，這些脂肪因子在肥胖的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用［2］.絲氨酸蛋白酶抑制劑（Visceral adipose tissue－derived serine protease inhibitor，Vaspin）是日本學(xué)者Hida［3］于2005年從OLETF大鼠白色脂肪組織中發(fā)現(xiàn)的一種與肥胖密切相關(guān)的脂肪因子.近年來，對于Vaspin的研究較為普遍，但是它在肥胖個體中扮演著怎樣的角色還沒有取得一致的結(jié)論.運動能夠較好地預(yù)防和對抗肥胖及與肥胖相關(guān)的代謝疾病，但運動對脂肪因子Vaspin的影響仍存在一些爭議，有關(guān)不同強度運動對肥胖受試者Vaspin的作用尚且模糊，仍需進一步的研究.

本文通過對青春期肥胖大鼠實施不同強度運動，探討對其內(nèi)臟脂肪組織Vaspin mRNA基因表達(dá)、Vaspin蛋白表達(dá)及血漿Vaspin濃度的影響，為進一步了解Vaspin的生理機制提供參考.

1　材料與方法

1.1材料

實驗對象為3周齡的雄性SD幼鼠（許可證號碼：SCXK（滬）2012－0002，合格證號：2007000546402）110只，體重75.52±7.64g，清潔級.隨機選取12只SD幼鼠作為對照組普通飼料喂飼，剩余幼鼠高脂飼料喂飼，自由飲食飲水.第一階段4周采用高脂飼料喂飼（飼料成分：碳水化合物45.2%，脂肪16.2%，蛋白質(zhì)18.8%）；第二階段3周喂40%脂肪供能高脂飼料（配比g／100g：普通飼料54.6g，豬油16.9g，蔗糖14g，酪蛋白低，正式干預(yù)前進行2－3次／天適應(yīng)跑臺練習(xí)，訓(xùn)練3天.OL、OM、OH運動方式以Bedford［5］設(shè)計的運動動物模型為依據(jù)進行改進，坡度均為0°，采用循環(huán)訓(xùn)練法，周一、周四休息，5次／周，共干預(yù)8周.具體運動方案如表2.

1.3血漿Vaspin的采集與測定

干預(yù)8周后，將大鼠禁食12h，禁水6h.使用麻醉劑水合氯醛（8%）注射腹腔，在無菌狀態(tài)下剖開腹腔，采集腹主動脈血，并迅速分離血漿，保存于－80℃冰箱待測Vaspin濃度.采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測血漿Vaspin濃度，基本操作步驟如下：（1）取凍血漿于室溫下均勻且充分解凍，從4℃冰箱取出Vaspin試劑盒于室溫下平衡20min后，再從鋁箔袋中取出預(yù)先包被的Vaspin板條，標(biāo)準(zhǔn)品孔設(shè)置為雙孔，各加50μl的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品；（2）設(shè)樣本孔為單孔，加10μl的待測樣本，再加40μl的樣本稀釋液（空白孔除外）；（3）在標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中各加入100μl的辣根過氧化物酶（HRP）檢測抗體（空白孔不加），反應(yīng)孔用封板膜封住，置于37℃恒溫箱孵育1h；（4）用自動洗板機重復(fù)洗板5次，設(shè)置為每次每孔注入350μl的洗液，浸泡1min；（5）每孔加入50μl的底物α和β，37℃避光溫育15min；（6）每孔加入50μl的終止液，立即在雙波長為450nm （620nm參比）的雙波長中測定各孔的OD值.

在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，得出Vaspin回歸方程y＝0.151x＋0.081.把方程代入Excel工作表中，得到相應(yīng)的濃度值，此濃度值再乘以5為樣本實際濃度.10.2g，預(yù)混料2.1g，麥芽糊精2.2g）.建立肥胖模型期間每天定時觀察飲水量、飲食量和排泄量，每周定時測一次體重和身長.7周建模成功后（造模成功標(biāo)準(zhǔn)為肥胖組體重＞20%的對照組體重［6］），選取32只造模成功大鼠，隨機分為4組，每組8只.對照組體重378.92±24.70（g），體長21.17±0.41（cm），肥胖成功體重標(biāo)準(zhǔn)為454.70（g），肥胖傾向組體重469.82±19.25（g），體長22.54±0.65（cm）.實驗期間動物分籠喂飼，飼養(yǎng)房條件：溫度18℃－22℃，濕度50%－70%，光照12h／天.所有幼鼠與飼料均購自中國上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司.本實驗的主要試劑與儀器見表1.

表1　主要試劑與主要儀器

1.2運動方案設(shè)計與實施

造模成功大鼠32只，隨機分入4組，每組8只.分別為靜止對照組（OC）、低強度運動組（OL）、中強度運動組（OM）、高強度運動組（OH）.進食量每天均控制在28g／只.本次運動強度等級設(shè)計為高、中、

表2　具體運動時間與速度 m／min×min

表3　Vaspin標(biāo)準(zhǔn)品OD值和對應(yīng)濃度值

1.4脂肪組織采集和Vaspin mRNA、蛋白表達(dá)的測定

1.4.1脂肪組織采集 取內(nèi)臟脂肪組織（附睪及腎周圍的脂肪組織），稱脂肪重量，取部分脂肪組織置于Trizol中，保存于－80℃冰箱，待測Vaspin mRNA.每組中剩下2只，用麻醉劑水合氯醛溶液（8%）注射腹腔，麻醉成功后無菌狀態(tài)下剖開腹腔，從左心室灌注甲醛溶液（4%），于右心耳流出，用來固定大鼠.取內(nèi)臟脂肪組織置于甲醛和蔗糖混合溶液中（4%），固定2周測免疫組化.

1.4.2Vaspin蛋白表達(dá)測定 取固定后的少許內(nèi)臟脂肪組織，加膠包埋至－20℃冰凍切片機內(nèi)進行切片，切片機調(diào)至40um，然后將切好后的組織放入PBS溶液中，撈片至玻璃片上.操作步驟如下：過氧化氫與純甲醇混合溶液浸泡30min→含0.3%Triton－x 100－PBS中浸泡60min→滴加小牛血清→室溫孵育20min→擦干轉(zhuǎn)入一抗（Vaspin）4℃孵育36h→常溫下孵育2h→PBS溶液沖洗后擦干轉(zhuǎn)入二抗孵育2h→擦干轉(zhuǎn)入三抗室溫孵育2h→擦干依次滴加A、B、C試劑，顯色3－15min并觀察顯色→蒸餾水沖洗、脫水、透明、封片→轉(zhuǎn)入顯微鏡下觀察Vaspin在脂肪組織中的顯色并采集圖片.

1.4.3Vaspin mRNA測定 根據(jù)GenBank提供的SD大鼠Vaspin cDNA序列設(shè)計引物（具體如表4），委托上海生工技術(shù)有限公司合成.總RNA提?。嚎俁NA是從浸泡于Trizol中的脂肪組織中提取出來，一定濃度的RNA通過反轉(zhuǎn)錄酶和隨機的六聚體引物被反轉(zhuǎn)錄成cDNA.Vaspin基因由熒光定量PCR系統(tǒng)檢測，2個單位的RT反應(yīng)通過SYBR Green QPCR在26μl PCR中被放大.樣本在序列檢測器中孵育，當(dāng)溫度達(dá)到95℃并持續(xù)2min時產(chǎn)生一次預(yù)變，隨后進行40次的PCR循環(huán)，每次循環(huán)條件分別是95℃持續(xù)15sec、60℃持續(xù)1min.Vaspin熔解曲線為Tm 82℃，溫度間隔0.3℃，5sec／each.采用2－△△Ct法來進行相對定量，△Ct＝Ct（target）－Ct（β－Actin）；△△Ct＝△Ct（treated）－△Ct（control）.2－△△Ct表示劑量組目的基因的表達(dá)量為對照的倍數(shù).

表4　大鼠內(nèi)臟脂肪組織Vaspin mRNA引物序列

1.5統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0數(shù)據(jù)軟件包處理.實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（M±SD）表示.采用單因素方差分析（one－way ANOVA）中的兩兩比較（LSD）對實驗相關(guān)指標(biāo)之間差異性進行檢驗，P＞0.05為無顯著性差異，P＜0.05為差異有顯著性，P＜0.01為差異有非常顯著性.

2　結(jié)果

2.1不同強度運動后肥胖相關(guān)指標(biāo)的變化

由表5得知：8周不同強度運動干預(yù)后，大鼠體重（麻醉后）、內(nèi)臟脂肪重量、體脂率（體脂率＝內(nèi)臟脂肪重量／體重×100%）較OC均下降明顯（P＜0.01）；OL的內(nèi)臟脂肪重量和體脂率較OM、OH均有差異（P＜0.05、P＜0.01）；體重OL與OH差異明顯（P＜0.05）.其他指標(biāo)雖有相應(yīng)的變化，但各組之間無明顯差異（P＞0.05）.

2.2不同強度運動后Vaspin mRNA的變化

由表6可知：8周不同強度運動后，OL、OM、OH組的Vaspin mRNA均較OC組呈進行式上升，OC與OH存有顯著差異（P＜0.05）

2.3不同強度運動后內(nèi)臟脂肪組織Vaspin的蛋白表達(dá)

內(nèi)臟脂肪組織Vaspin蛋白表達(dá)采用免疫組化測定，用標(biāo)記的特異性Vaspin抗體為一抗對脂肪組織內(nèi)Vaspin抗原的分布進行組織和細(xì)胞原位檢測.白色脂肪細(xì)胞類似于圓形或卵圓形，內(nèi)有單一的大脂滴，占細(xì)胞體積的90%，細(xì)胞核位于細(xì)胞邊緣.圖A為脂肪細(xì)胞在尼氏染色切片上，脂滴被酒精和二甲苯溶解，細(xì)胞呈空泡狀，胞核扁圓形，被脂滴推擠到細(xì)胞一側(cè)，部分胞核呈錐形；圖B為未加一抗（Vaspin）的免疫組化染色，細(xì)胞呈空泡狀，胞核沒有顯示，胞質(zhì)呈薄層線狀，切片上沒有明顯著色.其他組加一抗（Vaspin）后免疫陽性反應(yīng)表現(xiàn)為：OC組大鼠內(nèi)臟脂肪細(xì)胞體積較大，著色較深，呈淡棕色，Vaspin蛋白表達(dá)呈陽性，表達(dá)較明顯；OL、OM、OH組內(nèi)臟脂肪細(xì)胞體積減小，免疫組化細(xì)胞染色較OC組深，呈棕黃色，Vaspin蛋白表達(dá)呈強陽性，表達(dá)較多，且隨著運動強度的增加，內(nèi)臟脂肪細(xì)胞顏色與表達(dá)量呈現(xiàn)進行式上調(diào).

表6　不同強度運動后Vaspin mRNA的變化（M±SD）（n＝6）Table 6 Laboratory parameters change after different exercise intensity in Vaspin mRNA（M±SD）（n＝6）

注：A圖常規(guī)染色（免疫組化，×200）；B圖未加一抗（免疫組化，×400）；其他圖滴加一抗（免疫組化，×400）

2.4不同強度運動后血漿Vaspin濃度的變化

由表7可知：8周不同強度運動后，血漿Vaspin濃度隨運動強度的增大而上升，其中，OH較OC上調(diào)明顯（P＜0.05）.

3　討論

3.1不同強度運動對青春期肥胖大鼠肥胖指標(biāo)的影響

表7　不同強度運動后血漿Vaspin濃度、Vaspin mRNA的變化（M±SD）（n＝6）Table 7 Laboratory parameters change after different exercise intensity in plasma concentration of Vaspin（M±SD）（n＝6）

運動能夠有效降低體重，減少脂肪堆積.Levin BE［7］等實驗結(jié)果顯示：4周的跑臺運動能夠使肥胖大鼠的體重較對照組顯著下調(diào).日本愛知大學(xué)運動醫(yī)療中心提出：運動強度為40%－60%最大攝氧量（VO2max），每次運動2.5小時有較好地減肥效果.本實驗室的研究結(jié)果也顯示：60%－70%F.C.運動強度能有效降低體重、體脂肪，減肥減重效果明顯［8－9］.美國運動醫(yī)學(xué)會［10］明確建議：每個成年人每周至少進行5 次150min中等強度運動，或3次75min較大強度運動，或中等結(jié)合較大強度的運動.本次實驗結(jié)果顯示：8周不同強度運動干預(yù)后，大鼠體重、內(nèi)臟脂肪重量和體脂率均呈現(xiàn)大幅度下降，且運動強度越大，減肥效果更明顯.在人體減肥過程中，肥胖者由于脂肪的過度堆積導(dǎo)致心血管系統(tǒng)功能降低，體能下降，較大強度運動可能會引起劇烈的生理反應(yīng).本次研究過程中也發(fā)現(xiàn)，高強度運動組的肥胖大鼠疲勞出現(xiàn)的早，并伴隨著強烈的抵觸情緒，運動后較中低強度運動大鼠恢復(fù)速率慢.因此，肥胖者減肥健身選擇中低強度的運動為宜.

3.2實施不同強度運動對青春期肥胖大鼠Vaspin的影響

3.2.1內(nèi)臟脂肪組織Vaspin mRNA與Vaspin蛋白的影響 Vaspin是最近被識別的一種與肥胖相關(guān)的脂肪因子，具有重要的生理功能.Kloting等［11］在肥胖受試者的皮下及內(nèi)臟脂肪組織中均檢測到Vaspin mRNA，且與體脂率具有明顯的相關(guān)性，而在正常受試者（具有較低體脂率特點）中卻沒有檢測到.Gonz′alez等［12］對不同生理狀態(tài)下的大鼠進行研究發(fā)現(xiàn)，大鼠Vaspin mRNA表達(dá)在出生后45天達(dá)到頂峰.動物實驗表明［13］：運動可促使OLETF大鼠內(nèi)臟脂肪組織Vaspin mRNA的表達(dá)下降，但具體的作用機制需進一步的論證.Youn等［14］研究指出，4周運動干預(yù)后，Vaspin mRNA水平明顯上調(diào).還有研究表明：體重、內(nèi)臟脂肪重量和體脂率的降低對Vaspin mRNA的表達(dá)具有很好地預(yù)測效果.本次研究顯示：8周不同強度運動顯著降低了體重、內(nèi)臟脂肪重量及體脂率，增加了Vaspin mRNA的表達(dá)，且運動強度越大，表達(dá)越強烈.Vaspin作為胰島素敏感型的脂肪細(xì)胞因子，它的升高可能是短暫補償機制的一種表現(xiàn).Gonz′alez等［12］研究還發(fā)現(xiàn)，切除腦垂體后的大鼠Vaspin mRNA的表達(dá)顯著低于控制組，該實驗證實生長激素對于大鼠白色脂肪組織Vaspin mRNA的表達(dá)具有一定的刺激作用.從本次8周不同強度運動干預(yù)的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，Vaspin mRNA均呈現(xiàn)上升趨勢，且明顯高于正常對照組，這可能是因為本次實驗對象正處于青春發(fā)育期，其垂體分泌的生長激素較為旺盛，這成為Vaspin mRNA上調(diào)的關(guān)鍵因素.

蛋白質(zhì)的定性是探究疾病發(fā)生發(fā)展不可或缺的手段，為尋求治療的新靶點提供可靠思路.Tan等［15］發(fā)現(xiàn)超重多囊卵巢綜合癥婦女網(wǎng)膜脂肪組織的Vaspin蛋白表達(dá)水平較對照組高.劉師偉等［16］發(fā)現(xiàn)肥胖女性脂肪組織Vaspin的蛋白表達(dá)明顯增高，提示雌激素能刺激Vaspin蛋白的表達(dá).本次研究通過不同強度運動對青春期雄性大鼠進行干預(yù)，其Vaspin蛋白表達(dá)較對照組呈上調(diào)趨勢，提示不同強度運動可以通過調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞蛋白表達(dá)來對抗肥胖，且隨著運動強度的增加，調(diào)節(jié)效果更明顯.此外，Vaspin蛋白表達(dá)可能受到生長激素與性激素的雙重刺激，從而導(dǎo)致Vaspin蛋白的上調(diào).不同強度運動與激素是如何介導(dǎo)或調(diào)節(jié)青春期肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織Vaspin蛋白表達(dá)仍需進一步的研究.

3.2.2血漿Vaspin濃度的影響 Andreas Oberbach等［17］在研究運動與抗氧化劑對血漿Vaspin濃度的影響中發(fā)現(xiàn)：專業(yè)運動員、先前接受訓(xùn)練和沒受過訓(xùn)練的受試者，血漿Vaspin濃度沒有明顯不同；劇烈運動和經(jīng)過四周訓(xùn)練且未服用抗氧化劑的受試者，血漿Vaspin濃度明顯下降.Martos－Moreno等［18］研究報道：在通過改變生活方式而導(dǎo)致體重下降后，Vaspin濃度沒有任何變化.但是，Lee等［19］報道：肥胖兒童通過短期生活方式的改變而導(dǎo)致體重顯著下降后，胰島素抵抗和Vaspin水平顯著降低.以上各研究結(jié)果之間為什么會出現(xiàn)差異仍然不清楚，可能是因為研究對象的年齡不同，不同的成長階段會影響生長激素的分泌.據(jù)報道，生長激素水平能夠強烈影響血漿Vaspin濃度［11］.本次研究顯示：通過實施8周不同強度運動干預(yù)后，血漿Vaspin濃度均高于對照組，且隨著運動強度的增大而呈高表達(dá)趨勢.這可能是因為我們的研究對象正處于青春發(fā)育期，生長激素分泌旺盛，影響著血漿Vaspin表達(dá)規(guī)律和循環(huán)水平.

4　結(jié)論

實施8周不同強度運動干預(yù)后，顯著降低大鼠體重、內(nèi)臟脂肪重量、體脂率，運動強度越大，效果越明顯.不同強度運動干預(yù)顯著上調(diào)了Vaspin mRNA基因表達(dá)量、Vaspin蛋白表達(dá)及血漿Vaspin濃度，運動強度越大，上調(diào)幅度越明顯.不同強度運動對于Vaspin的作用機制以及不同強度運動是如何介導(dǎo)或調(diào)節(jié)Vaspin來對抗肥胖仍需進一步研究.

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Effect of Different Exercise Intensity on Vaspin Adolescent Obesity in Rats

DAI Yuan－yuan， BAI You－ping， YE He－shuang， XU Xiao－dong，ZHANG Jing， CUI Jian－fei， LI Meng， ZHUO Yan
（Physical Education Institute，College of Chizhou，Chizhou 247100，China）

Objective：In order to investigate the effect of Vaspin adolescent obesity rats in different intensity exercise.Methods：High fat fed rat model after 7weeks，take 32obesity rats were randomly divided into 4 groups，8rats in each group，respectively，the control group（OC），low intensity exercise group（OL），moderate intensity exercise group（OM），high intensity exercise group（OH）.OL，OM，OH in animal treadmill running speed respectively for 15－18m／min，21－25m／min，28－32m／min，at an incline of 0 degrees，1h／day，5times／week，for 8consecutive weeks.Anesthetized rats blood and visceral adipose tissue after 8weeks，expression by qRT－PCR measurement of adipose tissue Vaspin mRNA，immunohistochemistry was used to measure the expression of Vaspin protein in fat cells，measurement of plasma Vaspin concentration by ELISA.Results：The 8week exercise intervention，body weight，visceral fat weight and FAT%in adolescent rats were significantly lower than OC（P＜0.01）；Body weight in OL and OH were different（P＜0.05）；OM，OH rats，visceral fat weight and FAT%were lower than OL（P＜0.05，P＜0.01）；In the Vaspin mRNA，the OC and OH groups were significant difference（P＜0.05）；The different intensity exercise prompted the expression Vaspin protein showed upward trend for OC，exercise intensity bigger and more obvious.In the concentration of plasma Vaspin，the level of OH was higher than OC（P＜0.05）.Conclusion：8weeks of exercises of different intensity significantly reduce body weight，visceral fat weight and FAT%，exercise intensity bigger and more obvious.Three different intensity exercise prompted the expression Vaspin mRNA，Vaspin protein in visceral adipose tissue of rat and the level of plasma Vaspin to show upward trend，exercise intensity bigger and more obvious.

Q44

A

1001－2443（2016）03－0289－06

10.14182／J.cnki.1001－2443.2016.03.015

2015－03－29

安徽省高校自然科學(xué)基金重點項目（No.KJ2013A138）.

戴園園（1989－），女，碩士，助教，研究方向：健身運動處方的生理機制.

引用格式：戴園園，柏友萍，葉合雙，等.不同強度運動對青春期肥胖大鼠Vaspin的影響［J］.安徽師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2016，39（2）：289 －294.

Key wods：exercise intensity；adolescent obesity；adipose tissue；Vaspin