芪紅水煎液對免疫肝纖維化大鼠肝功能及肝纖維化標(biāo)志物的影響*

杜宇瓊 車念聰 張秋云 高連印 王金光 李文新

（首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100069）

芪紅水煎液對免疫肝纖維化大鼠肝功能及肝纖維化標(biāo)志物的影響*

杜宇瓊 車念聰 張秋云 高連印 王金光 李文新

（首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100069）

目的觀察芪紅水煎液對豬血清誘導(dǎo)的免疫肝纖維化模型大鼠的肝功能及血清肝纖維化標(biāo)志物的影響。方法模型制備采用腹腔注射無菌豬血清，每周2次，連續(xù)12周。成模后，用芪紅水煎液干預(yù)治療，秋水仙堿對照。實(shí)驗(yàn)結(jié)束血液生化檢測肝功能，放射免疫法檢測大鼠血清肝纖維化指標(biāo)。結(jié)果與正常組大鼠比較，模型組大鼠血清ALT、AST、ALP水平均顯著升高（均P＜0.01），說明造模成功。秋水仙堿組ALT、AST、ALP水平與模型組大鼠相比較差別均不大（均P＞0.05）；而芪紅水煎液組大鼠血清ALT、AST、ALP水平與模型組比較均改善（均P＜0.01）。與正常組大鼠比較，模型組大鼠HA、LN、PCⅢ、IV-C明顯升高（均P＜0.01），說明造模成功。秋水仙堿組血清HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ與模型組比較，均有不同程度降低（P＜0.01或P＜0.05），Ⅳ-C則差別不大（P＞0.05）。芪紅水煎液組血清HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ也有不同程度降低（P＜0.01或P＜0.05）。結(jié)論提示芪紅水煎液可以減輕肝細(xì)胞損傷，改善肝功能，保護(hù)肝組織，并降低肝纖維化程度，對肝纖維化有一定的防治作用。

肝纖維化芪紅水煎液藥效學(xué)大鼠

【Abstract】Objective：To explore the influence of Astragalus root combined with Polygonum Orientale L.decoction on liver function and hepatic fibrosis index of ratswith immunological liver fibrosis.M ethods：A ratmodel of hepatic fibrosis was constructed by using abdominal injection with pig serum，and treated with Astragalus root combined with Polygonum Orientale L.decoction.Liver function wasmeasured with automatic bio-chemical analyzer，and serum hepatic fibrosis index in ratswas detected by radioimmunoassay.Results：ALT，AST，HA，LN，Ⅳ-C and PC-Ⅲincreased obviously in hepatic fibrosis rats（P＜0.05）.Serum liver fibrosis indexes in Astragalus root combined with Polygonum Orientale L.decoction decreased obviously（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：Astragalus root combined with Polygonum Orientale L.decoction haS definite prevention to immune hepatic fibrosis，and can reduce fibrosis degree；meanwhile，it can effectively decrease liver cell injury and improve liver function.

【Key words】Hepatic fibrosis；Astragalus root combined with Polygonum Orientale L.decoction；pharmacodynamics；Rats

肝纖維化是由多種原因?qū)е碌母蝺?nèi)纖維結(jié)締組織異常沉積后，出現(xiàn)的肝臟功能或結(jié)構(gòu)改變的一種病理狀態(tài)，急性肝損害治療不及時(shí)往往后遺肝纖維化。芪紅水煎液是在肝病“虛、瘀”并存的病機(jī)［1］及錢英教授治療肝病必“體用同調(diào)”的理論指導(dǎo)下［2］，采用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)輔助分析，選用錢老抗肝纖維化方劑核心配伍水紅花子、黃芪進(jìn)行組方。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)水紅花子及黃芪單獨(dú)應(yīng)用具有一定的抗肝纖維化作用，但通過其聯(lián)合應(yīng)用，能否達(dá)到減毒增效的作用有待進(jìn)一步的研究。本研究以大鼠免疫肝纖維化模型為研究對象，給予芪紅水煎液治療，并與秋水仙堿治療組進(jìn)行比較，觀察芪紅水煎液的抗肝纖維化作用，為臨床用藥提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物清潔級(jí)Wistar大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，鼠齡45 d，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室，恒溫恒濕，自由進(jìn)食進(jìn)水，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，溫度（21±3）℃，濕度（50.2±2.0）%，12 h/12 h晝夜交替。

1.2藥物與試劑豬血清：由北京平睿生物有限公司提供，生產(chǎn)批號(hào)20140713。秋水仙堿：購于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院，生產(chǎn)批號(hào)400617，將秋水仙堿溶于蒸餾水配成1mg/100mL的溶液。水紅花子、黃芪均由同仁堂藥店提供，水煎制備成100%濃縮液，4℃保存?zhèn)溆?。血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷氨酰轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）試劑盒：由英科新創(chuàng)（廈門）科技有限公司提供。血清層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、透明質(zhì)酸（HA）、Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）試劑盒：由北方生物研究所提供。

1.3主要儀器日本奧林巴斯株式會(huì)社全自動(dòng)生化分析儀AU400、Biofuge 15r低溫高速離心機(jī)（HERAEUS）、HTEMRO超低溫冰箱（美國BEKCMAN公司）、XH6080放免儀。

1.4造模及分組正常組大鼠10只注射等量生理鹽水，時(shí)間同造模組。造模組大鼠30只腹腔注射豬血清0.5mL，每周2次，共12周。造模結(jié)束后，隨機(jī)抽取大鼠1只，處死并取肝組織進(jìn)行病理觀察，判定免疫肝纖維化模型是否成功［3］。

1.5分組及給藥40只大鼠進(jìn)行1周適應(yīng)性喂養(yǎng)后隨機(jī)分為正常組、模型組、秋水仙堿組、芪紅水煎液組。正常組予0.3 mL/100 g體質(zhì)量生理鹽水腹腔注射，每周2次，共12周；模型組不給予治療藥物，每日灌服蒸餾水1mL/100g，連續(xù)12周。治療組于造模的第2天開始灌服藥物，連續(xù)12周，其中秋水仙堿組，每日上午灌服秋水仙堿1次（0.1 mg/kg）；芪紅水煎液組每日上午灌服水煎濃縮液1次（2.5 g/kg）。

1.6標(biāo)本采集與檢測大鼠0.5%氯胺酮腹腔注射麻醉后，心尖部縱向刺入心室腔采血，4℃靜置30min后，4℃3000 r/min離心30min，分離血清，分裝，-20℃保存。全自動(dòng)生化儀檢測ALT、AST、ALP。放免法檢測血清纖維化4項(xiàng)指標(biāo)HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ，按檢測要求進(jìn)行嚴(yán)格操作［4］。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1各組大鼠血清肝功能指標(biāo)比較見表1。結(jié)果示，與正常組大鼠比較，模型組大鼠血清ALT、AST、ALP水平均顯著升高（均P＜0.01），說明造模成功。秋水仙堿組ALT、AST、ALP水平與模型組大鼠相比較差別均不大（均P＞0.05）；而芪紅水煎液組大鼠血清ALT、AST、ALP水平與模型組比較均改善（均P＜0.01）。

表1　各組大鼠血清肝功能指標(biāo)比較（U/L，

表1　各組大鼠血清肝功能指標(biāo)比較（U/L，

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別n ALP ALT AST正常組8 69.30±27.24模型組8 91.20±27.00△△秋水仙堿組8 88.70±21.55 42.60±4.93 109.38±37.19 66.76±16.70△△145.00±35.73△△68.70±8.27 168.20±44.61芪紅水煎液組8 61.10±15.07 43.50±8.21**99.61±22.32*

2.2各組大鼠血清肝纖維化指標(biāo)比較見表2。結(jié)果示，與正常組大鼠比較，模型組大鼠HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C明顯升高（均P＜0.01），說明造模成功。秋水仙堿組血清HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ與模型組比較，均有不同程度降低（P＜0.01或P＜0.05），Ⅳ-C則差別不大（P＞0.05）。芪紅水煎液治療組血清HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ也有不同程度降低（P＜0.01或P＜0.05）。

表2　各組大鼠血清肝纖維化指標(biāo)含量比較（

表2　各組大鼠血清肝纖維化指標(biāo)含量比較（

組　別n HA（μg/L）LN（ng/mL）　Ⅳ-C（μg/L）PCⅢ（μg/L）正常組8模型組8秋水仙堿組8 97.59±4.25 120.31±8.64 98.35±16.74 113.11±11.36 119.87±19.22△△139.56±16.89△△132.27±25.60△△123.49±17.20△95.38±13.26**105.64±24.26**131.79±14.89 112.71±25.35*芪紅水煎液組8 84.07±8.38**115.69±10.87**105.87±11.19**131.84±31.81*

3　討　論

慢性肝病中肝細(xì)胞的炎癥損傷是導(dǎo)致多種細(xì)胞、細(xì)胞因子參與肝纖維化的形成與發(fā)展的重要因素，所以有效保護(hù)肝細(xì)胞功能、抑制炎癥細(xì)胞浸潤，是目前已獲公認(rèn)的抗肝纖維化治療的有效策略之一。血清HA、LN、Ⅳ-C及血清PCⅢ是肝內(nèi)膠原組織的降解產(chǎn)物，能夠反映肝纖維化的增生活動(dòng)度、估計(jì)肝臟組織損害的程度［5］。近年來臨床研究表明血清肝纖四項(xiàng)檢查已被認(rèn)為是理想的診斷慢性肝病患者病情發(fā)展?fàn)顩r和治療效果，其變化是臨床衡量炎癥活動(dòng)情況、纖維化水平、評價(jià)療效及預(yù)后的重要參考依據(jù)［6］。HA是肝纖維化變化中最為敏感的指標(biāo)之一，在肝纖維化早期其他指標(biāo)尚未升高時(shí)就會(huì)升高，且其含量情況與肝纖維化水平呈正相關(guān)，對判斷肝纖維化活動(dòng)性及預(yù)后具有重要意義［7］。LN是反映肝損害嚴(yán)重程度及判斷有無活動(dòng)性肝纖維化的指標(biāo)之一，主要與肝竇毛細(xì)血管化和匯管區(qū)纖維化情況相關(guān)，且在肝纖維化晚期的升高尤其明顯［8］。Ⅳ-C是一類反映肝基底膜膠原變化的可靠指標(biāo)，與門脈高壓的程度密切相關(guān)［9-10］。PCⅢ血清含量可以反應(yīng)Ⅲ型膠原的代謝情況［11］。秋水仙堿是目前公認(rèn)的具有抗炎、抗肝纖維化［12］有效藥物，臨床試驗(yàn)表明該藥可以增加肝硬化患者的生存率。

黃芪味甘，性微溫，入脾肺二經(jīng)，其富含黃芪皂苷，黃芪多糖，異黃酮類化合物及硒元素，含有21種氨基酸，參與機(jī)體的多種代謝，具有廣泛藥理作用。臨床上用于增強(qiáng)機(jī)體免疫力、利尿、抗衰老、護(hù)肝、降壓、抗病毒等［13］，黃芪在肝病早期可起到延緩肝功能損害及纖維化的作用［14］。實(shí)驗(yàn)研究報(bào)告［15］，黃芪可以減少總膠原及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ膠原在大鼠肝臟中的病理性沉積，使膠原含量明顯下降，對實(shí)驗(yàn)性肝纖維化具有明顯的治療作用。實(shí)驗(yàn)還進(jìn)一步提示，黃芪抗肝臟纖維化的作用機(jī)制與其能夠抑制星狀細(xì)胞Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)水平有關(guān)［16-17］，還有學(xué)者［18］認(rèn)為，黃芪抑制肝組織ICAM-1的表達(dá)，從而抑制肝纖維化時(shí)的免疫反應(yīng)可能是其抗肝纖維化的重要機(jī)制之一。學(xué)者［19］應(yīng)用黃芪注射液治療慢性乙型肝炎，結(jié)果表明其具有明顯抗纖維化作用，其抗肝纖維化作用可能與其調(diào)節(jié)免疫，改變細(xì)胞因子活性有關(guān)。水紅花子，又名葒草實(shí)（《本草綱目》），咸、微寒，入肝、胃、脾經(jīng)，可化痞散結(jié)，清熱止痛，常用于痞塊腹脹、肝脾腫大、頸淋巴結(jié)核、消渴、胃痛等病的治療，臨床配伍用水紅花子消癥破積，健脾利濕主，治脅腹痞塊、腫瘤、水鼓、食少腹脹、痰核瘰疬，取得了較好效果［20］。有研究表明，水紅花子可有效降低肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)（HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ）水平，作用優(yōu)于秋水仙堿［21］。

本研究以免疫肝纖維化大鼠模型作為研究對象，觀察芪紅水煎液對模型大鼠的抗肝纖維化作用，經(jīng)過治療后，發(fā)現(xiàn)芪紅水煎液治療組的免疫肝纖維化實(shí)驗(yàn)大鼠的血清ALT、AST、ALP含量等臨床常用的反映肝細(xì)胞功能的重要血清生化指標(biāo)的水平均有不同程度改善，證明芪紅水煎液對免疫肝纖維化大鼠的肝細(xì)胞功能具有明確保護(hù)作用，且優(yōu)于秋水仙堿組，說明芪紅水煎液可以通過保護(hù)肝細(xì)胞、抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮其抗肝纖維化作用。芪紅水煎液可降低模型組大鼠HA、LN、Ⅳ-C水平，且優(yōu)于秋水仙堿，與相關(guān)報(bào)道結(jié)果類似［21］，證明芪紅水煎液具有較好抗肝纖維化作用，并對肝內(nèi)膠原的多個(gè)環(huán)節(jié)均有干預(yù)作用。

綜上所述，芪紅水煎液對肝纖維化有一定的防治作用，可減輕肝細(xì)胞損傷，改善肝功能，保護(hù)肝組織，并降低肝纖維化程度。但在肝纖維化復(fù)雜的病理過程，芪紅水煎液的具體藥理機(jī)制和作用靶點(diǎn)值得進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究與臨床探索。

［1］杜宇瓊，宋乃光，車念聰，等.“絡(luò)病”理論指導(dǎo)下的肝纖維化治療思路研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2010，25（10）：1604-1606.

［2］杜宇瓊，車念聰，張秋云，等.錢英教授“養(yǎng)血柔肝法”治療肝纖維化經(jīng)驗(yàn)初探［J］.2012，22（6）：366-367.

［3］中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)肝病專業(yè)委員會(huì).肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療指南［J］.中華肝臟病雜志，2006，14（11）：866-870.

［4］林利靜，徐列明．肝纖維化四項(xiàng)血清標(biāo)志物是否存在可信診斷價(jià)值［J］．肝臟，2012，17（6）：433-435.

［5］Jamall IS，F(xiàn)inelliVN，Que Hee SS.A simplemethod to determine nanogram levels of 4-hyproxyproline in biological tissue［J］.AnalyticalBiochemistry，1981，112：70-73.

［6］王軍．血清肝纖維化四項(xiàng)檢測在慢性肝病診斷中的意義［J］．實(shí)用醫(yī)藥雜志，2013，30（7）：590-592.

［7］李紅娟，李慶．血清肝纖維化四項(xiàng)檢查在肝硬化診斷中的價(jià)值［J］．國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012，33（12）：1532-1533.

［8］陸燕婷，汪太松，顧欣.血清肝纖維化指標(biāo)在各型肝病診斷中的應(yīng)用［J］.標(biāo)記免疫分析與臨床，2010，17（6）：350-353.

［9］劉杰，王吉耀，陸曄.血清纖維化指標(biāo)對肝纖維化診斷價(jià)值的研究［J］.中華內(nèi)科雜志，2006，45（6）：475-477.

［10］黃莉霞，甘紹軍．血清肝纖維化四項(xiàng)檢測在慢性肝病中的臨床分析［J］.世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2015，15（1）：134-135.

［11］MacwellP R，F(xiàn)lisiak R.Change in serological biomarkers of liver function and connective tissue turnover in chronic hepatitisB during lamivudine therapy［J］.Biomarkers，2005，10（6）：475-484.

［12］Kershehobich O.Colchine in the treatment of cirrhosis of the liver［J］.NEngl JMed，1988，318：1709-1714.

［13］楊李，文曄，王曉昆，等.芪蓮湯對2型糖尿病大鼠治療作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.華南國防醫(yī)學(xué)雜志，2008，22（3）：10-13.

［14］梁棋，陳堅(jiān)，徐三榮，等.黃芪防治實(shí)驗(yàn)性肝纖維化和肝硬化形成的再探討［J］.中華現(xiàn)代內(nèi)科學(xué)雜志，2008，5（8）：673-676.

［15］馬紅，王寶恩，陳翌陽，等.黃芪對肝纖維化治療作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華肝臟病雜志，1997，5（1）：32-33.

［16］馬雪梅，陰宏，馬紅，等.黃芪對HSC-T6細(xì)胞Col-I、TIMP1 mRNA影響表達(dá)的研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)刊，2002，20（1）：99-100.

［17］馬紅，王寶恩，馬雪梅.黃芪抑制大鼠肝星狀細(xì)胞增殖及膠原分泌的研究［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2001，8（4）：35-36.

［18］王要軍，權(quán)啟鎮(zhèn)，孫自勤，等.黃芪對實(shí)驗(yàn)性肝纖維化組織ICAM-1表達(dá)影響的免疫組化研究［J］.中國臨床藥理學(xué)和治療學(xué)，2000，5（1）：49-51.

［19］程鵬，劉素俠，孫晉浩，等.黃芪抗肝纖維化的作用與轉(zhuǎn)化生長因子β1和干擾素γ的關(guān)系［J］.臨床軍醫(yī)雜志，2000，28（3）：22-23.

［20］孫維娜.方和謙和解法治療肝纖維化的經(jīng)驗(yàn)［J］.北京中醫(yī)，2004，23（3）：143-145.

［21］杜宇瓊，趙暉，張秋云，等.水紅花子對免疫肝纖維化大鼠肝功能及血清肝纖維化標(biāo)志物的影響［J］.中國中醫(yī)急癥，2011，20（9）：1433-1434.

Effect of Astragalus Root Combined w ith Polygonum Orientale L.Decoction on Liver Function and Hepatic Fibrosis Index of Rats w ith Immunological Liver Fibrosis

DU Yuqiong，CHE Niancong，ZHANG Qiuyun，et al.School of Traditional Chinese Medicine，Capital Medical University，Beijing Key Laboratory of TCM Collateral Disease Theory Research，Beijing 100069，China.

R285.5

A

1004-745X（2016）09-1679-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.09.010

2016-06-07）

北京市教委科研計(jì)劃項(xiàng)目（KM201610025012）