續(xù)斷水提液對(duì)小鼠脛骨骨折愈合影響的實(shí)驗(yàn)研究*

武春明袁慧敏楊　迪劉　魏毛　矛

鄒斌杰1，2蘇　彪1，2胡偉龍1，2劉晉閩1，2

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江　杭州310053；2.浙江省中醫(yī)院，浙江　杭州310006；3．浙江省人民醫(yī)院，浙江　杭州310014）

·研究報(bào)告·

續(xù)斷水提液對(duì)小鼠脛骨骨折愈合影響的實(shí)驗(yàn)研究*

武春明1，2袁慧敏1，2楊迪3△劉魏1，2毛矛1，2

鄒斌杰1，2蘇彪1，2胡偉龍1，2劉晉閩1，2

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州310053；2.浙江省中醫(yī)院，浙江杭州310006；3．浙江省人民醫(yī)院，浙江杭州310014）

目的觀察續(xù)斷水提液對(duì)小鼠脛骨橫行骨折愈合過(guò)程的影響。方法選用12周齡C57小鼠70只，無(wú)菌條件下實(shí)施脛骨干橫形骨折髓內(nèi)釘固定術(shù)，脛骨X線正側(cè)位片剔除不合格小鼠，余下隨機(jī)分為模型組、治療組，每組再隨機(jī)分為5個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)。治療組予續(xù)斷水提液灌胃，模型組給予同體積生理鹽水，分別于造模后第4天、7天、10天、14天、21天取樣，固定后X線觀察骨折愈合大體情況，Micro-CT測(cè)量ROI總體積（TV）、骨痂總體積（BV）、骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）和骨小梁相關(guān)參數(shù)，同時(shí)通過(guò)組織形態(tài)學(xué)HE染色評(píng)估續(xù)斷水提液對(duì)小鼠骨折愈合過(guò)程的形態(tài)學(xué)影響。結(jié)果X線顯示兩組在骨折愈合早期（4、7、10 d）兩組骨折線多較清晰，而在骨折愈合中后期（14、21 d）治療組骨折線模糊程度高于模型組（P＜0.05）；Micro-CT顯示兩組間BV、BV/TV、Tb.Pf和SMI在術(shù)后14 d、21 d差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而TS兩組間在各時(shí)間點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；術(shù)后7 d和10 d時(shí)，骨痂多為軟組織，14 d和21 d則逐漸向骨性轉(zhuǎn)化。在術(shù)后14 d和21 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，治療組骨痂骨量明顯多于模型組，而且治療組骨痂的形狀也更為規(guī)則，與皮質(zhì)骨貼合更為緊密。結(jié)論依據(jù)X線、Micro-CT及組織形態(tài)學(xué)HE染色發(fā)現(xiàn)續(xù)斷水提液可促進(jìn)小鼠脛骨橫行骨折的愈合，且其作用時(shí)間點(diǎn)為小鼠骨折愈合中后期。

骨折Micro-CT續(xù)斷骨折

【A bstract】Objective：To explore the promoting effect of Radix Dipsaci extract on tibial fracture healing in mice.M ethods：12-week-old C57BL/6mouse were chosen for the experiment，and made a unilateral open tibiae transverse fracture with intramedullary needle fixationmodel.After the operation，They were divided into 2 groups for 5 time points random ly.The treatment group and themodel group were given Teasel rootextractand saline respectively.The samples were taken on 4th，7th，10th，14thand 21stday.3 days later，X-ray was used to observe the general situation of fracture healing，and the characteristics of bone volume of ROI（TV），volume of callus（BV），bone volume fraction（BV/TV）and Trabecular related indexes were detected with Micro-CT.At the same time，histological staining（HE）was used to assess themorphological effect of Radix Dipsaciextrac on fracture healing process ofmice.Results：X-ray showed that in the early fracture healing（4th，7th，10thday），most of fracture lines of two groupswere clear，but in the late stage of fracture healing（14th，21stday），the fuzzy degree of the treatment group was higher than that of themodel group.Micro-CT showed that there were statistical differences in BV，BV/ TV，Tb.Pf，and SMIbetween the treatment group and themodel group on 14thday and 21stday after the operation（P＜0.05）.TS showed no statistical differences among all time points.Morphological HE staining showed that 10th，14thand 21stday after operation，callus quantity，shape and direction of the treatment group were better than those of themodel group.Conclusion：Radix Dipsaci extract has a promoting effect on tibial fracture healing in mice and the promoting effect focuses on themiddle and late period.

【Key words】Fracture；Micro-CT；Radix Dipsaci

骨折是指骨的連續(xù)性與完整性被破壞，骨的機(jī)械性能超生理負(fù)荷的結(jié)果。近年來(lái)，骨折發(fā)生逐年上升［1］，骨不連、延遲愈合等骨折并發(fā)癥也顯著增多，嚴(yán)重威脅人們的健康和勞動(dòng)能力［2］。因此，如何促進(jìn)骨折愈合，縮短骨折愈合時(shí)間，減少患者并發(fā)癥的發(fā)生，是廣大創(chuàng)傷骨科醫(yī)生非常關(guān)心的問(wèn)題之一。骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)修復(fù)過(guò)程，而中醫(yī)藥在治療骨折方面歷史悠久、療效肯定，且方便易行、成本低廉、毒副作用低，已被廣泛運(yùn)用于骨折治療中。本研究通過(guò)建立小鼠脛骨橫行骨折模型，運(yùn)用X線、Micro-CT和組織形態(tài)方法觀察中藥續(xù)斷水提物對(duì)小鼠脛骨骨折愈合的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康正常12周齡C57BL/6JSPF級(jí)小鼠70只，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：ACXK（滬）2013-0016，雌雄不拘，體質(zhì)量20～25 g，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，所有小鼠均用標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒類動(dòng)物飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程對(duì)動(dòng)物的處置符合浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2試藥與儀器續(xù)斷水提液的制備：稱取續(xù)斷（由浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥廠提供），10倍超純水浸泡1 h后，大火煮沸后調(diào)小至微沸，以藥液剛好沸騰為宜，煎熬1.5 h，反復(fù)提取3次，3次藥液混合后經(jīng)旋蒸儀（杭州大衛(wèi)）濃縮至質(zhì)量濃度0.45 g/mL后待用。戊巴比妥鈉，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司生產(chǎn)，批號(hào)F20020915；青霉素，華北制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)F3117217；絡(luò)合碘，杭州朗索醫(yī)用消毒劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20150720。慶大霉素，宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)：5150126C。組織脫水機(jī)，Sakura，Tissue-Tek VIP5Jr；輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，Thermo，HM325；全自動(dòng)石蠟包埋機(jī)，Thermo，EC350-1；Micro-CT，BRUKER MICROCT N. V，型號(hào)Skyscan1176。

1.3模型制備小鼠實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉（0.2 mL/10g），待小鼠喪失意識(shí)，刮毛器刮除右側(cè)脛骨前方體毛。小鼠取仰臥位，絡(luò)合碘常規(guī)消毒，消毒面積近端達(dá)腹股溝，遠(yuǎn)端至足趾。無(wú)菌孔巾覆蓋小鼠，僅暴露右后肢。沿右側(cè)脛骨縱軸做一切口，暴露皮下組織和脛骨前緣。取27號(hào)注射器針頭1枚，沿脛骨骨髓腔縱軸插入至約1/2脛骨總長(zhǎng)度時(shí)，拔除針頭。肉眼尋找脛骨前外側(cè)向前凸起最高點(diǎn)，取11號(hào)刀片，在此凸起最高點(diǎn)后約3mm垂直緩慢戳入脛骨，刀片基本與操作臺(tái)同一水平時(shí)，用小錘子垂直敲擊刀片基部，直至聽(tīng)到“啪”聲，刀片尖戳入泡沫板；移除刀片，輕輕側(cè)方移位活動(dòng)以確認(rèn)骨折構(gòu)建成功。取一枚25號(hào)注射器針頭，復(fù)位固定；用鋼絲鉗橫行剪斷針頭；絡(luò)合碘消毒皮膚，間斷縫合皮膚［3］。

1.4分組與給藥依據(jù)術(shù)后正側(cè)位X線片，只選擇發(fā)生脛骨中部單發(fā)橫形骨折的小鼠進(jìn)行分組［4］，剔除不符合者后，60只小鼠隨機(jī)分為兩組：模型組30只，治療組30只，每組再隨機(jī)均分成4、7、10、14、21 d 5個(gè)時(shí)間段［5］。術(shù)后肌肉注射青霉素4萬(wàn)U和慶大霉素1萬(wàn)U，以預(yù)防感染，連續(xù)2 d。治療組在術(shù)后24 h開(kāi)始灌胃給藥續(xù)斷水提液（質(zhì)量濃度4.5 g/mL，0.4 mL），模型組則給予0.4mL生理鹽水灌胃，每日1次。

1.5樣本采集與檢測(cè)造模后4、7、10、14、21 d予0.3%戊巴比妥鈉0.3mL/10 g注射處死小鼠，取整個(gè)脛骨。10%中性甲醛固定標(biāo)本后，10%乙二胺四乙酸（EDTA）中性脫鈣液中脫鈣4周后，脫水機(jī)脫水處理，石蠟包埋，連續(xù)切取厚度為3μm組織切片，60℃烤片過(guò)夜，待制備組織切片。1）X線：取兩組5個(gè)時(shí)間段的骨折樣本，4%多聚甲醛固定72 h后，Skyscan1176進(jìn)行X線掃描，得到骨折側(cè)位二維圖像。此外，通過(guò)3名不同的實(shí)驗(yàn)員（采用盲法）對(duì)X線骨折線模糊程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。2）Micro-CT：取各實(shí)驗(yàn)組5個(gè)時(shí)間段的骨折樣本，運(yùn)用Skyscan1176進(jìn)行掃描分析。電壓42 kV、電流555μA，濾光片Al 0.2 mm，分辨率8.73μm，掃描角度360°，獲取連續(xù)的平面CT圖像。選出橫行骨折端上下各200張圖片作為感興趣區(qū)域（ROI），運(yùn)用機(jī)載軟件進(jìn)行骨折端骨痂三維圖像重建與分析。主要檢測(cè)參數(shù)如下：骨體積（BV）、相對(duì)骨體積或骨體積分?jǐn)?shù)BV/TV、骨痂表面積（TS）、骨小梁模式因子（Tb.Pf）；結(jié)構(gòu)模型指數(shù)（SMI）［5］。3）HE染色：將切好的載玻片，60℃烤片2 h后進(jìn)行HE染色，步驟如下：二甲苯脫蠟3次，每次5 min，之后酒精梯度脫水，脫蠟脫水完成后，純水洗2次，每次3min，蘇木精染液染色1min，純水漂洗3次，每次3 min，PBS溶液浸泡1 min，純水漂洗3次，每次3min，直至充分藍(lán)化，伊紅溶液染色1min，隨后依次置于95%酒精3次、100%酒精2次、二甲苯3次，每次1min，中性樹(shù)脂封片［6］。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS.19統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（表示，采用t檢驗(yàn)，組間不同時(shí)間點(diǎn)采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析。計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1兩組骨折線二維影像分析見(jiàn)圖1，表1。通過(guò)X線獲得小鼠脛骨二維圖片，比較兩組間骨折線模糊程度［3］，發(fā)現(xiàn)兩組6只小鼠術(shù)后第4天、7天骨折線依舊清晰，未見(jiàn)任何骨性連接影像。術(shù)后第10天，兩組多數(shù)小鼠骨折線依然清晰可見(jiàn)，但在骨痂周圍可見(jiàn)少許骨性連接影像。術(shù)后第14天兩組小鼠骨折線多數(shù)已模糊，可見(jiàn)較多骨性連接影像在骨痂周圍。術(shù)后第21天治療組非常模糊比例達(dá)83.33%，而模型組仍有50%的小鼠處于模糊。

圖1　脛骨骨折線X線平面圖

表1　小鼠骨折線模糊程度觀察（n）

圖2　脛骨骨折端ROI區(qū)域骨痂3D圖

2.2續(xù)斷提取液對(duì)骨折端骨痂形成的影響見(jiàn)圖2。骨折端骨痂三維圖像重建，從圖中可以發(fā)現(xiàn)術(shù)后4 d，骨折端骨痂都較稀少；術(shù)后7 d骨痂的總量明顯增多，多數(shù)分布在骨折端骨膜附近；而在術(shù)后第10天治療組骨痂骨量較模型組多，且骨痂較多已經(jīng)爬過(guò)骨折線；在術(shù)后14 d骨痂總量都達(dá)到峰值，治療組中骨痂網(wǎng)狀骨減少，可能已轉(zhuǎn)化為板狀骨，而模型組中仍然存在較多的網(wǎng)狀骨痂；在術(shù)后21 d模型和治療組骨痂均被吸收，與模型組不同，治療組中骨痂多數(shù)已轉(zhuǎn)化為致密的板狀。

2.3兩組Micro-CT檢測(cè)參數(shù)比較見(jiàn)表2。通過(guò)Micro-CT分析軟件進(jìn)行骨痂微觀結(jié)構(gòu)分析，得到相關(guān)參數(shù)。從表中可見(jiàn)在骨折術(shù)后14 d、21 d，治療組BV，BV/TV比值高于模型組，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而掃描區(qū)域組織TS在治療組和模型組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；此外，Tb.Pf與SMI兩組指標(biāo)同樣在骨折術(shù)后14 d、21 d兩組間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表2　兩組Micro-CT檢測(cè)參數(shù)比較（

表2　兩組Micro-CT檢測(cè)參數(shù)比較（

與模型組比較，△P＜0.05。

BV（mm3）0.12±0.03 0.63±0.05 1.53±0.13 14 d 2.78±0.17△21 d 1.60±0.12△模型組4 d 0.10±0.00（n=6）7 d 0.57±0.03 10 d 1.42±0.07 14 d 1.75±0.13 21 d 1.36±0.03組別　時(shí)間治療組4 d（n=6）7 d 10 d BV/TV TS（mm2）0.05±0.01 85.77±4.45 0.18±0.03 76.79±1.19 0.29±0.01 71.81±1.12 Tb.Pf（mm-1）SMI 46.42±1.74 2.53±0.08 21.02±3.39 2.18±0.13 13.39±1.06 1.81±0.08 0.42±0.01△70.11±1.39 0.31±0.02△69.72±0.47 7.80±1.06△1.50±0.06△0.04±0.00 87.22±3.27 48.85±2.41 2.59±0.05 0.17±0.01 75.82±0.87 23.02±6.73 2.25±0.17 0.27±0.01 71.58±1.06 14.82±1.08 1.84±0.11 0.28±0.02 69.78±0.45 13.01±1.21 1.84±0.05 0.25±0.02 70.49±0.35 11.51±1.55 1.74±0.06 9.82±1.82△1.63±0.05△

2.4兩組HE染色比較見(jiàn)圖3。骨折術(shù)后7、10、14和21 d樣本HE染色結(jié)果，考慮到骨折術(shù)后4 d組織多為血腫，在骨痂形態(tài)學(xué)上本研究在術(shù)后4 d并未進(jìn)行比較。由圖3可見(jiàn)，術(shù)后7 d和10 d時(shí)，骨痂多為軟組織，14 d和21 d則逐漸向骨性轉(zhuǎn)化。在術(shù)后14 d和21 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，治療組骨痂骨量明顯多于模型組，而且治療組骨痂的形狀也更為規(guī)則，與皮質(zhì)骨貼合更為緊密。

圖3　兩組術(shù)后7、10、14、21 d HE染色比較（50倍）

3　討　論

骨折愈合是指骨折斷端間的組織修復(fù)反應(yīng)，以恢復(fù)骨的正常結(jié)構(gòu)與功能，骨折愈合過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的組織學(xué)、生物學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)及生物力學(xué)的動(dòng)態(tài)過(guò)程［7］。治療中除采用手術(shù)、手法復(fù)位、夾板固定、練功活動(dòng)等方法外，配合藥物治療也至關(guān)重要，而中醫(yī)藥治療骨折主要遵循骨折3期辨證施治原則。早期，骨折移位，軟組織損傷，組織充血水腫，腫脹明顯，治療主要以活血化瘀、行氣止痛藥物為主；中期，局部血腫吸收，水腫緩解、骨痂開(kāi)始形成，而局部腫脹、疼痛仍然未盡，治療以接骨續(xù)筋類藥物為主；后期，骨折已臨床愈合，但氣血耗損，筋骨松軟，本研究治療以補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋壯骨為主［8-9］。

續(xù)斷因其續(xù)筋接骨功效而得名［10］。本品性味苦、甘、辛，微溫，歸肝腎經(jīng)，具有補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，行血脈，療傷續(xù)折功效，為補(bǔ)肝腎療骨傷之要藥，廣泛運(yùn)用在骨傷科疾病治療中，而續(xù)斷具體的作用機(jī)理也被所更多關(guān)注。程志安等［10］在體外實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)續(xù)斷能有效促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞增殖、分化，抑制凋亡，這也被武密山等［11］證實(shí)，此外他們還發(fā)現(xiàn)續(xù)斷具有促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與向成骨細(xì)胞分化的作用。段衛(wèi)華等［12］認(rèn)為續(xù)斷能糾正局部腫脹，促進(jìn)血腫的吸收、機(jī)化，加速膠原合成，改善膠原結(jié)構(gòu)和排列來(lái)加速骨折愈合。而相關(guān)臨床試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，續(xù)斷可縮短骨折愈合時(shí)間，對(duì)老年骨折及骨折遲緩愈合有效果明顯［13］，其機(jī)理是續(xù)斷能促進(jìn)骨折部位骨基質(zhì)鈣沉積，提高骨痂質(zhì)量，促進(jìn)相關(guān)生長(zhǎng)因子的分泌，加快骨折愈合這一復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程［14］。

Micro-CT技術(shù)是一種能全面、立體、精確、無(wú)創(chuàng)測(cè)量骨微結(jié)構(gòu)手段，可精確計(jì)量標(biāo)本整體骨量參數(shù)，準(zhǔn)確描述結(jié)構(gòu)的3D分布和形態(tài)特征，可補(bǔ)充X線、病理切片等二維觀測(cè)方法的不足［15］。Micro-CT檢測(cè)中，BV、BV/TV是觀察骨性骨痂的指標(biāo)，是評(píng)價(jià)骨折愈合重要依據(jù)［16-17］。本研究結(jié)果表明治療組和模型組BV、BV/ TV值隨著時(shí)間逐漸升高，在術(shù)后14 d時(shí)達(dá)到高峰，而術(shù)后21 d均不同程度的降低，這可能與在骨折愈合后期骨痂的吸收有關(guān)［18］。骨折術(shù)后14、21 d治療組BV、BV/TV比值高于模型組（P＜0.05），提示續(xù)斷水提液可在骨折愈合中后節(jié)點(diǎn)增加骨性骨痂的生成，促進(jìn)骨折愈合，這可能與補(bǔ)腎中藥促進(jìn)成骨分化相關(guān)基因的上調(diào)作用發(fā)生在骨折愈合中后節(jié)點(diǎn)有關(guān)［19］，這也與組織形態(tài)學(xué)染色所現(xiàn)一致。Tb.Pf為骨小梁模式因子提示的是骨痂內(nèi)骨小梁凸凹面的程度，其值變小表示骨小梁由桿狀向板狀變化，力學(xué)特性增強(qiáng)［20］。兩組在骨折術(shù)后Tb.Pf值逐漸變小，而在術(shù)后14 d、21 d治療組Tb.Pf值顯著低于模型組，說(shuō)明續(xù)斷水提液在小鼠骨折愈合中后期可對(duì)骨痂再塑形，恢復(fù)骨的力學(xué)特性。SMI為骨痂的結(jié)構(gòu)模型指數(shù)，反映骨痂內(nèi)骨小梁板狀、桿狀的程度，趨近于0時(shí)骨小梁多為板狀，反之趨近3時(shí)骨小梁轉(zhuǎn)向桿狀，而在骨量減少相關(guān)疾病中SMI值常接近3［21］。在本實(shí)驗(yàn)中，術(shù)后第14、21天治療組SMI均顯著低于模型組，說(shuō)明續(xù)斷水提液在骨折愈合中后節(jié)點(diǎn)可使新生骨痂中力學(xué)強(qiáng)度較差的網(wǎng)狀、桿狀骨小梁向板狀轉(zhuǎn)化，而Tb.Pf、SMI值所提示的新生骨痂生物力學(xué)特性上的恢復(fù)，在HE染色中也有所體現(xiàn)，在術(shù)后14 d和21 d治療組骨痂的外形、方向都趨于恢復(fù)。

綜上所述，續(xù)斷作為代表性的續(xù)筋接骨藥，續(xù)斷水提液可以增加骨性骨痂的生成，同時(shí)又可對(duì)新生骨痂再塑形，加快恢復(fù)新生骨的生物力學(xué)特性，而且這些作用主要集中在骨折愈合的中后期。

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Experimental Study on Promoting Effect of Radix Dipsaci Extract on Tibial Fracture Healing in M ice under M icro-CT

WU Chunming，YUAN Huimin，YANG Di，et al.Zhejiang Chinese Medicine University，Zhejiang，Hangzhou 310053，China.

R285.5

A

1004-745X（2016）09-1682-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.09.011

2016-06-16）

·研究報(bào)告·

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃一般項(xiàng)目（2014ZB008）

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