熱毒寧調(diào)節(jié)MCMV感染的肺炎模型小鼠肺組織內(nèi)IFN-γ和IL-4水平的研究*

張文輝 左麗娜 孫　思 顧　翔 陳玉玲

（徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，江蘇　徐州221002）

·實(shí)驗(yàn)報(bào)告·

熱毒寧調(diào)節(jié)MCMV感染的肺炎模型小鼠肺組織內(nèi)IFN-γ和IL-4水平的研究*

張文輝 左麗娜 孫思 顧翔 陳玉玲

（徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，江蘇徐州221002）

目的觀察熱毒寧對(duì)鼠巨細(xì)胞病毒（MCMV）感染小鼠肺組織干擾素-γ（IFN-γ）和白介素-4（IL-4）細(xì)胞因子水平的影響及其抗MCMV作用機(jī)制。方法40只BALB/c鼠隨機(jī)分5組，每組8只，A為空白對(duì)照組，B為免疫低下對(duì)照組，C為MCMV肺炎模型組，D為熱毒寧治療組，E為更昔洛韋治療組。HE染色觀察小鼠肺組織的病理改變，熒光定量PCR檢測(cè)肺組織MCMV DNA的變化，酶聯(lián)免疫試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)肺組織中IFN-γ和IL-4的變化。結(jié)果1）與A組相比，C組肺組織病理染色顯示肺泡壁內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁增寬，部分肺泡腔內(nèi)有蛋白滲出；MCMV DNA含量升高，肺組織中炎癥因子IFN-γ和IL-4明顯增多（P＜0.05）；2）與C組相比，給予藥物干預(yù)后，D、E組肺組織病理改變較前減輕，MCMV DNA含量降低，炎性因子IFN-γ和IL-4明顯下降（P＜0.05）；而D、E兩組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論熱毒寧干預(yù)后，肺組織的病理改變較前減輕，抑制CMV DNA的復(fù)制，IFN-γ和IL-4明顯下降；此效應(yīng)可能是通過(guò)抑制CMV的復(fù)制周期并干預(yù)下游細(xì)胞因子從而發(fā)揮抗病毒作用。

熱毒寧更昔洛韋巨細(xì)胞病毒IFN-γIL-4

【Abstract】Objective：To investigate the effect and its anti-MCMV mechanism of Reduning Decoction on the expression of IFN-γand IL-4 of lung tissue in pneumonia model mice with MCMV infection.M ethods：40 BALB/cmice were randomly divided into five groups，8 in each：the normal control group（A），immunosuppressive control group（B），MCMV infection group（C），Reduning decoction group（D），and ganciclovir group（E）.The pathological changes of lung tissue inmice were observed by HE staining.Real time PCR was used to analyze expression of MCMV DNA；the expression of IFN-γand IL-4 was detected by ELISA.Results：Compared with the normal control group，the pathological changes of the lung tissue of themice in themodel group showed alveolar interstitial edema，alveolar wall wider and a large number of inflammatory cells；the number of MCMV DNA increased；the expression of IFN-γand IL-4 also increased significantly（P＜0.05）.Compared with themice in the model group，the pathological changes of the lung tissue of drug groups showed the inflammatory cells decreased；the number of MCMV DNA decreased，and the expression of IFN-γand IL-4 also decreased significantly（P＜0.05）.At the same time，the expression of IFN-γand IL-4 was no statistically significant between group D and E（P＞0.05）.Conclusion：After Reduning Decoction′s intervention，pathological changes of lung tissue decreased；the replication of CMV DNA was inhibited，and FN-γand IL-4 also decreased significantly.This effectmay be achieved by inhibiting the replication cycle of CMV and intervening downstream cytokines to exert antiviral effects.

【Key words】Reduning Decoction；Ganciclovir；Cytomegalovirus；IFN-γ；IL-4

巨細(xì)胞病毒（CMV）屬β-皰疹病毒亞科，是一組可以在宿主細(xì)胞中建立終身潛伏感染的特異性的皰疹病毒。CMV易感染免疫缺陷患者的器官、組織，同時(shí)它也是導(dǎo)致移植患者移植物喪失的主要原因［1-2］。目前已有研究證實(shí)，不論是在巨細(xì)胞病毒感染的潛伏或活化期，肺部都是一個(gè)最主要的感染器官。由于目前可用的抗病毒藥物有限以及長(zhǎng)期低劑量的使用，以至于目前還

沒(méi)有有效的藥物以阻止CMV感染的炎癥反應(yīng)。熱毒寧是新型中藥制劑，目前已成為國(guó)內(nèi)治療病毒性疾病的一線用藥。國(guó)內(nèi)大量的臨床研究已證實(shí)，熱毒寧對(duì)病毒性肺炎有一定的治療作用［3-4］，但它對(duì)CMV肺炎的作用以及對(duì)干擾素-γ（IFN-γ）和白介素-4（IL-4）細(xì)胞因子的影響尚不明確。通過(guò)檢測(cè)熱毒寧對(duì)MCMV感染模型小鼠肺組織中IFN-γ和IL-4細(xì)胞因子表達(dá)強(qiáng)度的影響，從整體水平上探討熱毒寧對(duì)MCMV感染小鼠肺組織IFN-γ和IL-4細(xì)胞因子水平的影響及其抗MCMV作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料及方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇40只SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠為研究對(duì)象，年齡均為8周齡（由徐州醫(yī)學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體質(zhì)量23～27 g，平均（25.23±1.84）g，所有動(dòng)物均在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)行標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)。

1.2藥物與試劑MCMV株由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物研究所提供。DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生物有限公司，IFN-γ、IL-4的ELASA試劑盒購(gòu)自上海依科賽生物制品有限公司，PCR引物均由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3分組與給藥BALB/c鼠隨機(jī)分5組，每組8只，A為空白對(duì)照組，B為免疫低下對(duì)照組，C為MCMV肺炎模型組，D為熱毒寧治療組，E為更昔洛韋治療組。A組腹腔注射成纖維細(xì)胞0.8mL/只，C組腹腔注射MCMV懸液0.8 mL/只；D組腹腔注射熱毒寧7.2 mL/kg，E組腹腔注射更昔洛韋60 mg/kg（每日1次，均連續(xù)給藥7 d），A組、B組、C組分別予以同體積的0.9%氯化鈉注射液腹腔注射。上述劑量均按人與動(dòng)物用藥量折算系數(shù)表計(jì)算用藥量。

1.4標(biāo)本采集與檢測(cè)1）肺組織病理學(xué)。留取肺組織，甲醛固定，石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)改變（×400）。2）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MCMV DNA。將肺組織勻漿，離心后留取沉淀，按照DNA試劑盒說(shuō)明分別提取肺組織中的MCMV-DNA。上游引物：5′-TCAGCCATCAACTCTGC TACCAAC-3′，下游引物：5′-ATCTGAAACAGCCGTA TATCATCTTG-3′。反應(yīng)體系為10μL，DNA模板2μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，ddH2O 7μL，反應(yīng)條件為95℃15 s，95℃5 s，58℃30 s，72℃10 s，40個(gè)循環(huán)。行瓊脂糖凝膠電泳，于紫外燈下觀察結(jié)果、拍照。3）ELASA法檢測(cè)IFN-γ及IL-4的表達(dá)。將肺組織勻漿離心，留取上清液，嚴(yán)格按照ELISA說(shuō)明行IFN-γ、IL-4的檢測(cè)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。所有計(jì)量資料均以（表示，用單因素方差分析檢驗(yàn)其差異性，組間兩兩比較用SNK檢驗(yàn)完成。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1各組小鼠行為學(xué)異常表現(xiàn)情況比較A組和B組小鼠在實(shí)驗(yàn)期間未表現(xiàn)出行為異常，C、D、E 3組的小鼠在MCMV 3 d后表現(xiàn)出嗜睡、活動(dòng)減少、毛發(fā)脫落等異常。給藥后，D、E組小鼠用藥7 d時(shí)行為異常表現(xiàn)有所減輕，與C組相比明顯改善。

2.2光鏡下的病理學(xué)改變見(jiàn)圖1。A、B組未表現(xiàn)出明顯的病理改變，C組小鼠肺泡壁和支氣管周圍肺間質(zhì)內(nèi)有大量的炎性細(xì)胞存在，主要表現(xiàn)為肺泡壁增寬，肺泡腔內(nèi)有大量蛋白滲出，肺間質(zhì)內(nèi)大量單核細(xì)胞浸潤(rùn)表達(dá)。D組小鼠經(jīng)熱毒寧干預(yù)后，肺組織病理改變較C組減輕；且E組減輕較D組更明顯。

圖1　各組小鼠肺組織病理變化（HE染色，400倍）

2.3各組小鼠ELISA檢測(cè)IFN-γ和IL-4水平比較見(jiàn)表1。與A組比較，C組IFN-γ和IL-4明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；B組無(wú)明顯變化（P＞0.05）；D、E組IFN-γ和IL-4明顯少于C組（P＜0.05），且E組下降較D組更明顯（P＜0.05）。

表1　各組肺組織IFN-γ和MCP-1表達(dá)的比較（pg/mL，

表1　各組肺組織IFN-γ和MCP-1表達(dá)的比較（pg/mL，

與A組比較，△P＜0.05；與C組比較，*P＜0.05；與D組比較，▲P＜0.05。下同。

組別n IFN-γIL-4 A組8 21.37±4.49 28.57±3.86 B組8 23.14±3.32 29.75±5.75 C組8 275.57±17.45△11.86±3.95△D組8 104.64±23.47*20.65±4.36*E組8 98.72±19.57*▲21.63±4.58*▲

2.4各組小鼠熒光定量PCR檢測(cè)MCMV-DNA表達(dá)比較見(jiàn)表2。與B組比較，C、D、E組的MCMV-DNA明顯升高（P＜0.05）；經(jīng)藥物干預(yù)后MCMV-DNA較前下降（P＜0.05）；提示通過(guò)熱毒寧干預(yù)后，MCMV的濃度顯著降低。

表2　各組肺組織CMV-DNA的表達(dá)（Ig/mL，

表2　各組肺組織CMV-DNA的表達(dá)（Ig/mL，

組別n CMV-DNA A組8 1 B組8 1 C組8 4.52±1.13#D組8 2.37±0.44#*E組8 1.72±0.11#*

3　討　論

CMV是一種普遍存在的機(jī)會(huì)性致病菌，是目前已知的人類最大的病毒之一。雖然免疫功能正常的個(gè)體感染CMV后無(wú)明顯臨床癥狀出現(xiàn)，但它可在體內(nèi)建立終身潛伏感染［5］。而在免疫缺陷患者中，如移植接受者、HIV患者感染CMV后可導(dǎo)致嚴(yán)重的后果［6］。理解CMV是如何引起并損害機(jī)體免疫反應(yīng)的，對(duì)有效治療CMV具有重要作用。

研究顯示［7-8］，機(jī)體受到MCV感染后發(fā)生免疫紊亂的機(jī)制十分復(fù)雜，目前主要認(rèn)為與細(xì)胞因子作用和細(xì)胞因子的表達(dá)失衡有著重要關(guān)系。細(xì)胞因子作為機(jī)體內(nèi)免疫細(xì)胞分泌的對(duì)細(xì)胞功能具有調(diào)節(jié)作用的小分子多肽類物質(zhì)，是調(diào)控細(xì)胞間相互作用、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的主要功能性物質(zhì)，細(xì)胞因子水平和功能的失衡則決定了細(xì)胞功能特別是免疫功能的狀態(tài)［9-10］。機(jī)體中，Th作為主要的免疫細(xì)胞，其主要分化形式為T(mén)h1細(xì)胞和Th2細(xì)胞，Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β等因子，是介導(dǎo)細(xì)胞毒性和局部炎癥的關(guān)節(jié)因子，廣泛參與細(xì)胞的免疫反應(yīng)。相對(duì)應(yīng)Th1細(xì)胞而言，Th2細(xì)胞則主要分泌IL-4、IL-5和IL-10等白介素因子，主要功能是刺激B細(xì)胞分泌大量的免疫蛋白，調(diào)控免疫功能的形式以參與體液免疫反應(yīng)為主［11］。正常機(jī)體狀態(tài)中，Th1和Th2細(xì)胞功能處于動(dòng)態(tài)平衡，這兩種細(xì)胞因子的表達(dá)水平一旦失衡，將會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生免疫功能紊亂及自身免疫性疾病等，保持這兩種細(xì)胞因子的平衡是保障機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫功能正常的重要原因［12-13］。有臨床研究指出，CMV感染可導(dǎo)致機(jī)體Th1/Th2平衡失調(diào)，而Th1/Th2平衡狀況又在CMV感染和其致病機(jī)制中具有十分重要的意義［14］。機(jī)體遭受病毒感染后，細(xì)胞因子在病毒感染過(guò)程中，可同時(shí)發(fā)揮宿主介導(dǎo)的病毒復(fù)制過(guò)程的參與者和病毒破壞免疫系統(tǒng)的重要的因子，可通過(guò)雙重作用促進(jìn)機(jī)體免疫功能的紊亂和自身免疫的失調(diào)。

研究顯示［15］，機(jī)體遭受CMV感染后，被活化的NK細(xì)胞可產(chǎn)生大量的IFN-γ，可同時(shí)發(fā)揮抑制病毒復(fù)制和抑制炎性反應(yīng)的雙重作用，被認(rèn)為是Th1亞群中抑炎作用較強(qiáng)的因子。IL-4作為T(mén)h2細(xì)胞亞群所分泌重要細(xì)胞因子，被認(rèn)為對(duì)CMV感染的炎性反應(yīng)有著重要促進(jìn)作用，所以臨床上常選擇IFN-γ/IL-4來(lái)反映Th1和Th2的優(yōu)勢(shì)應(yīng)答狀態(tài)［16］。在本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠感染MCMV后，肺組織內(nèi)的IFN-γ水平明顯升高，而IL-4水平則顯著降低，提示Th1/Th2處于失衡狀態(tài)且Th1抵抗MCMV的能力占優(yōu)勢(shì)地位，有利于機(jī)體通過(guò)免疫防御機(jī)制調(diào)節(jié)消除病原體。IL-4表達(dá)水水平的下降程度有限，無(wú)法發(fā)揮強(qiáng)大的拮抗IFN-γ分泌的作用，對(duì)IFN-γ介導(dǎo)的肺組織的改善作用比較有限，可認(rèn)為機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能失衡是造成MCMV感染相關(guān)肺組織損傷加重的重要因素之一。

本研究中，應(yīng)用熱毒寧及更昔洛韋干預(yù)后，IFN-γ/ IL-4的值均較模型小鼠明顯增大，其中IFN-γ的表達(dá)下調(diào)，IL-4水平升高，MCMV-DNA表達(dá)減少，上述指標(biāo)在兩治療組的變化趨勢(shì)相同，與更昔洛韋相似。熱毒寧通過(guò)調(diào)節(jié)IFN-γ及IL-4的表達(dá)，糾正CMV感染所致的Th1/Th2的失衡，可能是通過(guò)誘導(dǎo)Th1分化，造成Th1優(yōu)勢(shì)反應(yīng)狀態(tài)，從而增強(qiáng)了特異性細(xì)胞免疫功能，使機(jī)體提前進(jìn)入恢復(fù)期，縮短病程，更有利于機(jī)體清除病毒，減輕這些炎癥因子引起的肺部炎癥損傷，保護(hù)肺組織。此效應(yīng)可能與熱毒寧發(fā)揮抗病毒作用有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)是以小鼠模型為基礎(chǔ)，熱毒寧在臨床上的具體治療作用仍需大量的臨床實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)，同時(shí)MCMV肺炎的具體機(jī)制及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚待進(jìn)一步的研究來(lái)明確。

［1］Boeckh M，Geballe AP.Cytomegalovirus：pathogen，paradigm，and puzzle［J］.Clin Invest，2011，121（5）：1673-1680.

［2］BrittW.Manifestations of human cytomegalovirus infection：proposed mechanisms of acute and chronic disease［J］.Curr Top Microbiol Immunol，2008，325：417-470.

［3］車向前，林育紅.熱毒寧聯(lián)合抗生素治療社區(qū)獲得性肺炎的效果觀察［J］.中國(guó)藥導(dǎo)報(bào)，2012，19（32）：89-91.

［4］左麗娜，陳玉玲，張文輝.巨細(xì)胞病毒肺炎肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-6的水平觀察［J］.臨床肺科雜志，2013，18（11）：1979-1981.

［5］Jarvis MA，Nelson JA.Human cytomegalovirus persistence and latency in endothelial cells and macrophages［J］.Curr Opin Microbiol，2002，5（4）：403-407.

［6］Boeckh M，Geballe AP.Cytomegalovirus：pathogen，paradigm，and puzzle［J］.Clin Invest，2011，121（5）：1673-1680.

［7］李靈芝，常國(guó)良.養(yǎng)陰清肺湯對(duì)巨細(xì)胞病毒性肺炎模型小鼠的保護(hù)作用［J］.中國(guó)藥房，2015，14（16）：2196-2198.

［8］倪德群，趙紀(jì)強(qiáng)，張瑋，等.MCMV感染同種異型皮膚移植小鼠間質(zhì)性肺炎模型的建立［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，46（6）：509-514.

［9］左麗娜.熱毒寧注射液治療鼠巨細(xì)胞病毒肺炎的實(shí)驗(yàn)研究［D］.徐州醫(yī)學(xué)院，2013.

［10］Yi ES，Kim YJ.Cytomegalovirus infection according to cell source afterhematopoietic cell transplantation in pediatric pa-tients［J］.YonseiMed J，2012，53（2）：393-400.

［11］McHeyzer-Williams LJ，McHeyzer-Williams MG.Developmentally distinctTh cells controlplasma cellproduction in vivo［J］.Immunity，2004，20（2）：231-242.

［12］Lenzo JC，Mansfield JP，Sivamoorthy S，et al.Cytokine expression inmice cytomegalovirus-induced myocarditis：modualtion with interferon therapy［J］.Cell Immunol，2003，223（1）：77-86.

［13］胡廷雪.熱毒寧注射液治療小兒病毒性肺炎的Meta分析［J］.長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版：醫(yī)學(xué)旬刊，2013，10（6）：87-90.

［14］Corinna La Rosa，Don JDiamond.The immune response to human CMV［J］.Future Virol，2012，7（3）：279-293.

［15］Alcendor DJ，Charest AM，Zhu WQm Infection and upregulation of proinflammatory cytokines in human brain vascular pericytes by humancytomegalovirus［J］.Neuroinflammation，2012，18（9）：95.

［16］趙凱株，魯繼榮，喬紅梅，等.病毒性心肌炎患兒血清IL-4和干擾素-γ含量變化的臨床意義［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2003，29（3）：322-325.

The Effect of Reduning Decoction on the Expression of IFN-γand IL-4 of Lung Tissue in Pneumonia Model M ice w ith MCMV Infection

ZHANG Wenhui，ZUO Lina，SUN Si，et al.The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Jiangsu，Xuzhou 221002，China.

R285.5

A

1004-745X（2016）09-1730-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.09.027

2016-04-09）

徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院院內(nèi)科研課題（XYFY2013018）