牡蠣育種研究進展

寧　岳,郭　香,曾志南,祁劍飛,巫旗生

(福建省水產(chǎn)研究所,福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心,福建廈門361013)

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牡蠣育種研究進展

寧岳,郭香,曾志南*,祁劍飛,巫旗生

(福建省水產(chǎn)研究所,福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心,福建廈門361013)

綜述了近些年來國內(nèi)外牡蠣育種的研究現(xiàn)狀與進展,包括傳統(tǒng)的選擇育種、雜交育種及現(xiàn)代各種生物技術如多倍體、轉(zhuǎn)基因和分子標記技術在牡蠣育種中所取得的成就,以期為牡蠣及其他貝類的育種研究與應用提供參考．

牡蠣;選擇育種;雜交育種;分子標記

牡蠣屬軟體動物門(Mollusca)、雙殼綱(Bivalvia)、珍珠貝目(Pterioida),牡蠣科(Ostreidae),是一種重要的海洋生物,其肉味鮮美,營養(yǎng)價值較高,素有“海中牛奶”之美稱．牡蠣地理分布廣，生長快，產(chǎn)量高,具有很高的經(jīng)濟價值,是世界各國重要的海水養(yǎng)殖對象．2014年世界牡蠣產(chǎn)量達516萬t，中國牡蠣產(chǎn)量居全球首位,達435萬t,占世界牡蠣產(chǎn)量的84.3%,特別是近15年來中國牡蠣年產(chǎn)量均在300萬t以上,牡蠣已成為中國乃至世界養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的經(jīng)濟貝類[1-2]．

牡蠣養(yǎng)殖與食用的歷史悠久,目前牡蠣養(yǎng)殖苗種來源主要是通過自然采苗和人工育苗,但長期人工育苗養(yǎng)殖會導致遺傳變異降低、近交衰退、瓶頸效應,養(yǎng)殖牡蠣普遍出現(xiàn)個體變小、生長緩慢、高死亡率等現(xiàn)象[3],因此采用傳統(tǒng)遺傳育種方法和現(xiàn)代各種生物技術培育出符合生產(chǎn)需要的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和適應性廣的優(yōu)良品種，對推動牡蠣養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義．本文綜述了近年來國內(nèi)外牡蠣育種的研究現(xiàn)狀與進展,以期為牡蠣及其他貝類的育種研究與應用提供參考．

1　牡蠣選擇育種

選擇育種是遺傳育種的最基本方法,也是目前水產(chǎn)動物遺傳改良的主要途徑．牡蠣群體中因許多性狀存在可以遺傳的變異,且懷卵量大、性成熟較快、繁殖周期相對短,故牡蠣已成為良好的選擇育種材料[4]．

近年來除中國外,美國、澳大利亞、法國等先后開展了牡蠣選擇育種研究工作,并取得了一定的成效(表1)．在牡蠣抗病育種方面,1957年美國特拉華灣(Delaware Bay)美洲牡蠣(Crassostreavirginica)開始連續(xù)發(fā)生單孢子蟲病(MSX disease),其高感染率和高死亡率使美國東海岸牡蠣養(yǎng)殖業(yè)遭受嚴重影響[16];20世紀60年代開始,美國Rutgers大學Haskin等[5]進行了持續(xù)的研究,證實了美洲牡蠣對MSX抗性可遺傳,并通過幾十年的不懈努力,成功地人工選擇育種出5個抗單孢子蟲病(MSX disease)的美洲牡蠣新品系,選擇育種群體生長速度與自然群體無差異,但對該病的抗性提高了8～9倍,并成功進行了商業(yè)化養(yǎng)殖．在抗帕金蟲病(Dermo disease)選擇育種方面,Burreson等[6]和Calvo等[7]從特拉華灣美洲牡蠣自然群體中通過4代連續(xù)選擇育種,成功選擇育種出能同時抑制MSX和Dermo的雙抗品系,第3代比對照組死亡率減少22%,而且生長速度也有提高．20世紀80年代初,美國華盛頓大學的Hershberger等[23]針對長牡蠣夏季高死亡率,開展了較系統(tǒng)的選擇育種研究工作,并對性成熟周期、糖原含量變化等可能導致夏季死亡的影響因素進行了分析．1996年美國水產(chǎn)遺傳育種技術中心(ABC)繼續(xù)啟動了針對MSX和Dermo的美洲牡蠣育種項目,經(jīng)過近10年的研究,建立了8個ABC選擇育種系,在4個地方養(yǎng)殖的結(jié)果顯示,當MSX和Dermo發(fā)生時,選擇育種系存活率明顯高于對照組,其中EC(東海岸組)組、HY(東海岸與路易斯安那雜交組)組存活率分別比對照組高52%～82%和40%，選擇育種系平均產(chǎn)量也比對照組高29%[8]．

表1　部分牡蠣選擇育種研究成果總結(jié)

Tab.1　Summary of selective breeding research results in oyster

國家種類選擇育種目標主要成果文獻美國美洲牡蠣抗尼氏單孢子蟲病(MSX)選擇育種出5個抗MSX美洲牡蠣新品系,選擇育種群體生長速度與自然群體無差異,但對該病的抗性提高了8～9倍[5]美國美洲牡蠣抗派金蟲病(Dermo)通過4代連續(xù)選擇育種,成功選擇育種出能同時抑制MSX和Dermo疾病的雙抗品系,第3代比對照組死亡率減少22%,而且生長速度也有提高[6-7]美國美洲牡蠣抗MSX和Dermo建立了8個ABC選擇育種系,在4個地方養(yǎng)殖結(jié)果顯示,當MSX和Dermo和發(fā)生時,選擇育種系存活率明顯高于對照組,其中EC組、HY組存活率分別比對照組高52%～82%和40%;此外選擇育種系平均產(chǎn)量也比對照組高29%[8]澳大利亞悉尼巖牡蠣抗QX(Marteiliasydneyi)經(jīng)過4代選擇育種,當QX爆發(fā)時選擇育種系死亡率為28%,而未選擇育種組死亡率達97%[9-12]法國長牡蠣抗OsHV-1選擇育種至第4代時,選擇育種系存活達69.0%,而對照組僅存活7.3%;此外4代選擇育種系幼苗期存活率較對照組分別提高了22.2%,43.9%,50.2%和61.8%;通過連續(xù)4代的群體選擇育種,顯著提高了牡蠣存活及抗OsHV-1能力[13-15]美國美洲牡蠣生長速度培育出“Wildestrain”品系和“Milfordhigh-line”速長品系,其中“Wildestrain”品系在好的養(yǎng)殖條件下6個月可達商品規(guī)格[16]澳大利亞悉尼巖牡蠣生長速度第4代選擇育種系上市時間(平均總質(zhì)量≥50g)較未選擇育種組提前12.5個月[17-20]中國長牡蠣生長速度經(jīng)連續(xù)6代選擇育種,培育出“海大1號”長牡蠣新品種,該品種15月齡平均殼高較普通商品長牡蠣苗種提高16.2%,總濕重提高24.6%,出肉率提高18.7%,且殼型整齊度明顯優(yōu)于普通商品長牡蠣[21]中國葡萄牙牡蠣貝殼顏色、生長速度利用群體選擇技術,通過連續(xù)5代選擇育種,培育出金黃殼色速長葡萄牙牡蠣“金蠣1號”新品系[22]

澳大利亞Nell等[9-10]和Dove等[11-12]也開展了悉尼巖牡蠣(SaccostreaglomerataGould 1850)抗馬爾太蟲病(QX，Marteiliasydneyi引起)和抗冬季致死品系的選擇育種研究：經(jīng)過2代的選擇育種,選擇育種系的死亡率比對照組低22%,顯示抗QX的選擇育種有效可行;經(jīng)過第3代選擇,1號選擇育種系顯示抗QX能力強,但不抗冬季致死,2號選擇育種系同時抗QX和抗冬季致死,而3號選擇育種系僅對抗冬季致死有較好的效果;經(jīng)過第4代選擇育種,當QX爆發(fā)時選擇育種系死亡率為28%,而未選擇育種組死亡率達97%,顯示出較好的選擇育種效果．

法國是傳統(tǒng)的牡蠣養(yǎng)殖大國,20世紀70年代從日本引進長牡蠣(C.gigas)并開始進行人工養(yǎng)殖.針對牡蠣幼苗夏季高死亡率,法國海洋研究所(IFREMER)開展了“MOREST”牡蠣研究計劃,Dégremont等[13-15]建立了家系并在3個不同的地方進行養(yǎng)殖試驗,結(jié)果顯示在存活率方面家系效應顯著,占總方差組分的46%,同時也存在家系與環(huán)境互作效應．近年來由于牡蠣皰疹病毒病(OsHV-1)的爆發(fā),給法國牡蠣養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的損失,Dégremont等[13-15]從2009年開始針對存活及抗OsHV-1開展了長牡蠣群體選擇育種,建立了2個選擇育種系,平均存活率較對照組提高22.2%;選擇育種至第4代時,選擇育種系存活達69.0%,而對照組僅7.3%;此外4代選擇育種系幼苗期存活率較對照組分別提高了22.2%，43.9%，50.2%和61.8%,抗OsHV-1現(xiàn)實遺傳力在0.34～0.63之間;通過連續(xù)4代的群體選擇育種,顯著提高了牡蠣存活及抗OsHV-1能力．

在生長速度選擇育種方面,早在1968年馬里蘭州的Wilde就開始對美洲牡蠣生長速度及杯深(殼寬)等性狀進行選擇育種,并培育出“Wilde strain”品系,該品系在好的養(yǎng)殖條件下6個月可達商品規(guī)格,取得了很好的經(jīng)濟效益,并沿用至今[16]．20世紀70年代開始,美國國家海洋漁業(yè)局(NMFS)也開展了牡蠣選擇育種計劃,通過對長島海峽(Long Island Sound)的美洲牡蠣進行連續(xù)4代選擇育種,培育出速長品系“Milford high-line”,并一直用于養(yǎng)殖生產(chǎn);此后1988年美國緬因大學又對緬因州本地的“Milford high-line”品系進行了選擇育種,經(jīng)過一代選擇育種后獲得10%的遺傳進展[16]．1995年開始俄勒岡州立大學等單位聯(lián)合開展了養(yǎng)殖牡蠣選擇育種遺傳改良計劃[24-25];通過一代的全同胞家系選擇育種,長牡蠣7個測試群體平均體質(zhì)量比對照組高9.5%,同時通過在不同地點建立家系有力地證實遺傳與環(huán)境的互作[26];Evans等[27]進一步研究了長牡蠣遺傳與環(huán)境的互作效應,結(jié)果顯示長牡蠣24個家系中,收獲時個體大小、成活率和產(chǎn)量都顯著地受家系、環(huán)境及其交互作用影響,其中家系、環(huán)境及其交互作用分別占產(chǎn)量總表型方差的14%,62%和5%．

澳大利亞也是傳統(tǒng)牡蠣養(yǎng)殖大國,主要養(yǎng)殖悉尼巖牡蠣和長牡蠣．1990年新南威爾士州啟動了以悉尼巖牡蠣快速生長為選擇育種目標的育種計劃,Nell等[17-19]建立了4個選擇育種系,經(jīng)17個月的養(yǎng)殖,第2代選擇育種系平均體質(zhì)量較未選擇育種組分別提高0%,2.9%,5.0%和8.5%;經(jīng)連續(xù)2代選擇后，第3代4個選擇育種系的平均體質(zhì)量比對照組高18%(各選擇育種系在14%～23%之間),將牡蠣上市時間(平均總質(zhì)量≥50 g)提前了3個月;第4代選擇育種系經(jīng)3年養(yǎng)殖,上市時間較未選擇育種組提前12.5個月,其中2號選擇育種系提前15個月;Dove等[20]在7個養(yǎng)殖區(qū)對第5代選擇育種系開展了生產(chǎn)性能評價試驗,結(jié)果顯示各養(yǎng)殖區(qū)選擇育種系均比未選擇育種組個體大,平均上市時間為29.3個月．20世紀40—50年代,澳大利亞從日本引進長牡蠣并開始進行養(yǎng)殖,Ward等[28]從1996年起開展長牡蠣選擇育種研究,他們首先分析了本地種與日本原種的遺傳差異,建立了2個獨立的基礎群體,并通過歧化選擇(divergent selection,又稱雙向選擇)分別建立起快速生長和慢速生長系;147和275 d后,快速生長系生長速度明顯高于慢速生長系;此后還建立了多個家系,對多個不同生長指標進行了主因子分析,并開展了分子標記輔助育種研究．此外,新西蘭考思倫研究所(Cawthron Institute)等機構(gòu)也開展了牡蠣育種研究,Adams等[29]將精子冷凍保存技術應用于長牡蠣選擇育種上,利用冷凍精子建立了20個組合(1雌×1雄),其中17個獲得了足夠多的D型幼蟲,顯示精子冷凍保存技術可以很好地應用于家系構(gòu)建．

在國內(nèi),王慶志等[30]獲得56個全同胞家系,估算了長牡蠣成體階段生長性狀的遺傳參數(shù),結(jié)果顯示長牡蠣成體階段各生長性狀間的遺傳和表型均為正相關,殼高和總質(zhì)量具有較高的遺傳力,分別為0.35±0.15和0.27±0.13．孔寧等[31]采用模型擬合方法研究了長牡蠣F3代快速生長選擇育種群體不同時期各生長性狀的發(fā)育規(guī)律,并利用多項式模型擬合了養(yǎng)成期各生長性狀的發(fā)育規(guī)律,揭示了長牡蠣的生長發(fā)育特征．張景曉等[32]利用連續(xù)2代的長牡蠣近交群體,研究了不同近交系數(shù)的長牡蠣家系在幼蟲期和稚貝期產(chǎn)生的近交效應,結(jié)果顯示:幼蟲階段,F1組和F2組的殼高與殼長均從12日齡開始出現(xiàn)衰退；稚貝階段,F1組和F2組的平均殼高在各日齡均表現(xiàn)出近交衰退．這些研究為長牡蠣選擇育種和遺傳改良提供了很好的基礎數(shù)據(jù)和理論參考．張景曉等[32]以山東乳山海區(qū)自然采苗養(yǎng)殖的長牡蠣為基礎群體,采用群體選擇育種技術,以生長速度和殼型作為選擇育種指標,經(jīng)連續(xù)6代選擇育種,培育出“海大1號”長牡蠣新品種,該品種15月齡平均殼高較普通商品長牡蠣苗種提高16.2%,總濕質(zhì)量提高24.6%,出肉率提高18.7%,且殼型整齊度明顯優(yōu)于普通商品長牡蠣．

曾志南等[22]收集福建沿海詔安、漳浦、羅源及廣東南澳等牡蠣主養(yǎng)區(qū)人工育苗養(yǎng)殖的葡萄牙牡蠣(C.angulata),分別以貝殼顏色和生長速度為選擇育種目標性狀,利用群體選擇技術,通過多代連續(xù)選擇育種,培育出金黃殼色速長葡萄牙牡蠣“金蠣1號”新品系．

2　牡蠣雜交育種

相對于選擇育種,牡蠣雜交育種進展相對緩慢[33-34]．牡蠣的遠緣雜交研究至今已有130多年的歷史,Bouchon-Brandely[35]最早開展了葡萄牙牡蠣與歐洲牡蠣的種間雜交．20世紀50年代開始陸續(xù)開展了許多牡蠣種間雜交實驗和研究,但由于未進行遺傳鑒定,其可信度令人懷疑[36]．目前已經(jīng)過遺傳鑒定的牡蠣種間雜交組合有:美洲牡蠣×長牡蠣[37]、美洲牡蠣×近江牡蠣(C.rivularis)[37]、長牡蠣×近江牡蠣[37]、長牡蠣×葡萄牙牡蠣[38-39]、長牡蠣×熊本牡蠣(C.sikamea)[40-41]、近江牡蠣×熊本牡蠣[42]、香港巨牡蠣(C.hongkongensis)×長牡蠣[43]、香港巨牡蠣×近江牡蠣[44]等(表2)．大多數(shù)牡蠣種間雜交幼蟲存活率低，不變態(tài),僅很少一部分可以變態(tài)成稚貝．

表2　5種巨蠣屬牡蠣受精方向性及其兼容性

Tab.2　The fertilizion direction and compatibility among five Crassostrea oyster species

♀♂長牡蠣葡萄牙牡蠣熊本牡蠣香港巨牡蠣近江牡蠣長牡蠣××葡萄牙牡蠣××熊本牡蠣香港巨牡蠣近江牡蠣××

注：“√”表示可以受精,“×”表示不可受精(引自張躍環(huán)等[34])．

雜交是否會產(chǎn)生積極的雜種優(yōu)勢是育種學家們最關心的,但雜種優(yōu)勢的產(chǎn)生機理十分復雜,既與親本間的遺傳差異有關,同時還與基因的表達調(diào)控、基因效應的大小和方向、效應間的相互作用及所處的環(huán)境有密切關系[45-46]．在牡蠣雜種優(yōu)勢方面,長牡蠣×熊本牡蠣[41]、香港巨牡蠣×長牡蠣[47]雜交后代生長情況均不如自交組,表現(xiàn)出生長緩慢特點;在長牡蠣與近江牡蠣的種間雜交中,以長牡蠣為母本的雜交組具有顯著的生長及存活優(yōu)勢,而反交則表現(xiàn)出生長及存活劣勢[48];近江牡蠣×熊本牡蠣雜交后代有明顯的生長及存活雜種優(yōu)勢[42];香港巨牡蠣×葡萄牙牡蠣雜種幼蟲生長緩慢,但變態(tài)成稚貝后,在不同環(huán)境條件下培育的生長狀況不同(適宜的條件下,會表現(xiàn)出快速生長的特征;不利于生長的條件下,表現(xiàn)出生長劣勢),表明生長性狀與環(huán)境互作具有一定的相關性[49];目前僅有報道香港巨牡蠣×近江牡蠣雜交后代表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢,1齡雜交子代平均殼高分別比香港巨牡蠣和近江牡蠣大54%和25%[44]．

種間雜交后經(jīng)常會出現(xiàn)雜交不親和、雜種后代育性差和“瘋狂”分離等現(xiàn)象[45],可利用可育的雜種 F1與親本種間的輪回雜交來改良雜種個體中某一親本的性狀表現(xiàn)．霍忠明等[50]開展了香港巨牡蠣×近江牡蠣雜種與雙親的回交試驗,香港巨牡蠣與近江牡蠣的雜交牡蠣與香港巨牡蠣或近江牡蠣都可以正常交配,但各回交組受精率明顯低于兩牡蠣自交組,未發(fā)現(xiàn)明顯的回交優(yōu)勢．喻子牛等[51]對香港巨牡蠣開展了雜交育種研究,以牡蠣種間雜種(香港巨牡蠣♀×長牡蠣♂)個體與香港巨牡蠣速生品系(F4)個體回交獲得的回交一代(BC1F1)為基礎群,通過表型性狀與分子標記協(xié)同篩選,以生長率作為指標,篩選出的生長快、鹽度適應范圍略高于香港巨牡蠣的牡蠣新品種“華南1號”,“華南1號”遺傳穩(wěn)定性達96.7%;在相同養(yǎng)殖條件下,總體質(zhì)量較香港巨牡蠣提高17.1%,產(chǎn)量提高23.1%,并可在較高鹽沿海河口水域養(yǎng)殖(拓寬養(yǎng)殖區(qū)域鹽度約5 g/L),適當擴大了現(xiàn)有養(yǎng)殖水域．

張國范[52]提出了貝類群體間的雜交及其雜種優(yōu)勢利用的可能性,闡明了地理種群或群體間的雜交與農(nóng)作物品系間雜交的類同性．在牡蠣不同群體雜交方面,孔令鋒等[53]以中國長牡蠣和日本長牡蠣為材料,進行了4個組合的雜交和自交實驗,揭示長牡蠣日本群體♀×中國群體♂的雜交子代在生長性狀方面具有顯著的雜種優(yōu)勢．王衛(wèi)軍等[54]以中國、日本和韓國長牡蠣F4代選擇育種群體為材料,建立了選擇育種系間雜交和自交群體,結(jié)果表明,各交配組合在180、360和450日齡生長優(yōu)勢差異顯著,多數(shù)雜交子代在生長性狀上存在一定程度的雜種優(yōu)勢．

3　分子標記技術在牡蠣育種中的應用

分子標記來源于個體DNA水平的變異,與傳統(tǒng)的形態(tài)標記相比有數(shù)量多、種類豐富的特點,近年來在經(jīng)濟動植物育種方面已經(jīng)取得了備受矚目的成果,如奶牛、水稻和番茄等．在牡蠣中,隨著測序成本的降低,基因組[55]和不同時空條件下轉(zhuǎn)錄組[56-60]測序的完成,表達序列標簽(expression sequence tag，EST)數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建[61],大量的共顯性分子標記被相繼開發(fā)[62-63]．遺傳分子標記的豐富將牡蠣的遺傳育種工作從傳統(tǒng)方法推向分子輔助育種的新層面．目前,分子標記技術已廣泛應用于牡蠣的遺傳多樣性分析、連鎖圖譜構(gòu)建、數(shù)量性狀定位以及關聯(lián)分析等研究領域,體現(xiàn)出有效可靠、快捷方便的優(yōu)勢,成為培育牡蠣優(yōu)良品系的有效手段之一．

3.1圖譜構(gòu)建

1997 年5月美國農(nóng)業(yè)部將包含牡蠣在內(nèi)的5 種水產(chǎn)種類作為基因組圖譜的研究對象,自此多種牡蠣品種都開展了圖譜構(gòu)建工作．Lallias等[64]基于AFLP(amplified fragment length polymorphism)和SSR(simple sequence repeats)標記構(gòu)建了歐洲食用牡蠣(Ostreaedulis)的雌雄兩性圖譜;Yu 等[65]構(gòu)建了美洲牡蠣的AFLP 連鎖圖;長牡蠣作為最重要的經(jīng)濟牡蠣品種,世界上多個實驗室開展了其遺傳圖譜構(gòu)建工作,目前已獲得了一系列分辨率較高的連鎖圖，Li和Guo[66]基于AFLP標記構(gòu)建的雌雄兩性圖譜,Dennis等[67]構(gòu)建的微衛(wèi)星連鎖圖,Hubert等[68]使用6個三倍體家系確定了52個微衛(wèi)星位點的基因-著絲粒距離圖譜，Guo等[69]基于AFLP和SSR繪制的性別平均連鎖圖(圖譜平均密度達到1.2 cM)，以及Zhong等[70]利用SSR和SNP兩種共顯性標記構(gòu)建的性別平均連鎖圖．為了提高長牡蠣遺傳圖譜上的微衛(wèi)星標記密度,郭香等[71]采用6個家系圖譜間的共有微衛(wèi)星標記作為錨定標記,構(gòu)建了長牡蠣的整合圖譜,研究發(fā)現(xiàn)不同作圖家系連鎖群上的標記分組保持一致,但標記順序存在差異,這可能歸因于長牡蠣自然群體中存在大量的染色體重排現(xiàn)象．牡蠣遺傳圖譜的構(gòu)建為后續(xù)的經(jīng)濟性狀定位、重要功能基因克隆和分子標記輔助育種打下了堅實的基礎．但是,連鎖圖構(gòu)建仍然處于初級階段,主要存在兩個方面的問題:1) 以顯性標記為主,缺少共顯性標記;2) 圖譜的密度和覆蓋度低,有待進一步完善．

3.2數(shù)量性狀定位及關聯(lián)分析

QTL(quantitative trait locus)定位是以一定飽和度的遺傳連鎖圖譜為基礎,通過連鎖分析確定數(shù)量性狀位點,牡蠣的定位工作主要集中在生長發(fā)育、抗性、性別和外觀顏色等重要經(jīng)濟性狀上．Yu和Guo[72]在美洲牡蠣的雌雄兩性遺傳圖譜上,鑒定到了12個與抗Dermo/Summer病毒相關的QTLs．Guo等[69]基于F1家系性別平均圖譜對長牡蠣生長相關性狀(殼長、殼高、殼寬、軟體部質(zhì)量、總質(zhì)量、殼容積、左殼深、出肉率和條件指數(shù))和性別進行QTL定位分析,共定位了3個與生長相關的QTLs,解釋的表型變異率為0.6%～13.9%;同時,檢測到一個與性別相關的QTL,父母本等位基因解釋的性別表型變異率分別為39.80%和0.01%．Zhong等[70]基于SSR和SNP標記連鎖圖定位了兩個QTLs,其中一個與糖原相關,解釋的表型變異率為0.27%～79.05%,另一個與殼色相關,定位在第9連鎖群上,父母本等位基因解釋的表型變異率為6.75%和17.44%．另外,仲等[73]對出肉率和殼型(殼寬和殼深)性狀也進行了QTL定位分析,共檢測到13個相關的QTLs,分布在3個連鎖群上,表型解釋率為0.25%～47.53%．

除了連鎖分析,重要功能基因與經(jīng)濟性狀的關聯(lián)分析在牡蠣分子遺傳育種中也備受關注．兩個淀粉酶基因在部分長牡蠣家系中呈緊密連鎖,顯著的生長差異在部分養(yǎng)殖場中被觀測到,暗示了這種多態(tài)性是非中性的,可能經(jīng)歷了選擇；兩種淀粉酶基因型的預期產(chǎn)量也是有差異的,表明淀粉酶標記在牡蠣選擇育種上的潛在育種價值[74]．隨后,Huvet等[75]又進一步檢測了淀粉酶基因與生長、生理生化和淀粉酶分子表達水平的關聯(lián)性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種關聯(lián)性更多地與長牡蠣的消化率而不是吸收率相關．劉思瑋等[76]在長牡蠣糖原合酶的外顯子編碼區(qū)域,通過連鎖不平衡分析構(gòu)建SNP單倍型,篩選到一個可能導致長牡蠣高糖原含量的單倍型;在糖原磷酸化酶基因中檢測到5個與生長性狀顯著相關的SNPs．采用候選基因重測序和mRNA表達分析法,在長牡蠣糖原脫支酶和磷酸化酶2個基因中共檢測到3個與糖原含量相關的SNP標記,且這2個候選基因在糖原含量高和低的兩組個體中的轉(zhuǎn)錄本豐度是有差異的[77]．Cong等[78-79]在長牡蠣胰島素相關多肽基因和胰島素受體相關受體基因中,均檢測到與生長性狀和糖原含量呈顯著相關的的SNP分子標記和單倍型．

在牡蠣的遺傳育種中,表觀性狀如殼色和外套膜顏色也是一個重要的經(jīng)濟性狀,成為一個新的重要的育種研究方向．采用兩個著色度相對的長牡蠣親本構(gòu)建的F1分離群體,分別選擇殼色相對的子代構(gòu)建DNA混合池,然后用AFLP標記掃描篩選到與該分離群體的貝殼著色相關聯(lián)的7條多態(tài)性片段,且這些標記全部位于同一個連鎖群上,可解釋80%的殼色表型變異,且其中一個AFLP標記成功轉(zhuǎn)化為共顯性的SCAR(sequence characterized amplified regions)標記,并整合到長牡蠣連鎖圖譜上[80]．為了加快長牡蠣殼金品系的選擇育種進展,Ge等[81]通過構(gòu)建殼金和殼白親本的F1分離群體,采用混合池分離分析法,利用AFLP標記篩選到7條多態(tài)性片段,其中4個轉(zhuǎn)化為共顯性標記,且7個片段全部來自母本,定位于同一連鎖群上．

3.3遺傳多樣性分析

Appleyard和Ward[82]采用同工酶和微衛(wèi)星標記,比較4個塔斯馬尼亞島連續(xù)選擇育種第4代群體與兩個塔斯馬尼亞島野生群體和兩個來自日本當?shù)氐娜后w發(fā)現(xiàn),在連續(xù)4代選擇育種群體中,微衛(wèi)星等位基因數(shù)目減少,雜合度受到了輕微影響.人工選擇育種明顯導致了部分遺傳變異的丟失，這一研究結(jié)果暗示了如果要繼續(xù)開展基于家系的人工選擇育種,育種者需要考慮增加親本數(shù)量[82]．

長牡蠣具備極高的繁殖力和很低的死亡率.Taris等[83]構(gòu)建了10個父本和3個母本的長牡蠣混養(yǎng)群體,遴選掉群體中偏小的50%個體,測量了幼蟲生長、死亡率、變態(tài)為面盤幼蟲的時間等性狀，結(jié)果表明遴選對于幼蟲性狀有一個相對較大的選擇效應,尤其是附著時間；同時,采用微衛(wèi)星多重PCR技術進行了混養(yǎng)群體的親子鑒定,評估了親本繁殖成功率差異、有效群體和群體遺傳結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖過程中的遴選導致群體的遺傳多樣性丟失,像野生狀態(tài)下的與體積大小相關的選擇壓一樣,很可能對種群產(chǎn)生了顯著的遺傳影響．

Li等[84]采用7個微衛(wèi)星位點檢測了5個中國長牡蠣養(yǎng)殖群體的遺傳變異和種群結(jié)構(gòu)，F(xiàn)st和Rst值在5個群體之間表現(xiàn)出顯著的遺傳差異，基于群體間遺傳距離構(gòu)建的NJ(neighbor-joining)樹拓撲結(jié)構(gòu)可以清晰地將5個群體分為南北兩組．

美國西北部的長牡蠣是20世紀20—70年代陸續(xù)從日本引進的種群．Camara[85]采用AFLP標記分析了1個日本野生群體、5個北美馴化群體、2個新西蘭群體、7個來自美國西海岸的選擇育種養(yǎng)殖群體,研究每一次大規(guī)模移植后美國長牡蠣群體的遺傳水平變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了蒂拉穆克群體之外,其他所有馴化群體在遺傳上都更加接近日本有明群體,而所有養(yǎng)殖選擇育種群體在遺傳上與日本宮城群體更相似．據(jù)當?shù)亻L牡蠣養(yǎng)殖者介紹,蒂拉穆克群體可能源自養(yǎng)殖牡蠣的新進殖民化．但在隨機遺傳漂變廣泛存在的情況下,這種一致性是出乎意料的．由此推測,自然和人工選擇可能已經(jīng)改變了AFLP等位基因在馴化和養(yǎng)殖群體中的頻率．

Miller等[86]采用微衛(wèi)星+重PCR,分析了韓國和日本當?shù)厝后w、法國和澳大利亞馴化群體以及澳大利亞育種項目養(yǎng)殖群體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)遺傳多樣性在自然群體和馴化群體中都非常高,養(yǎng)殖群體相對較低.該研究結(jié)果暗示了自長牡蠣引進以來,馴化群體在遺傳上沒有發(fā)生變化,該群體也可以作為優(yōu)良的選擇育種材料之一．

An等[87]采用微衛(wèi)星九重PCR技術探究了韓國長牡蠣野生和養(yǎng)殖群體之間遺傳上可能存在的相似和差異性，與野生群體相比,養(yǎng)殖群體雜合度和等位基因多樣性未顯著降低,但是兩個群體之間存在顯著的遺傳異質(zhì)性．研究結(jié)果暗示了多年的養(yǎng)殖實踐并未顯著影響牡蠣群體的遺傳水平．

長牡蠣現(xiàn)今已經(jīng)入侵歐洲沿海各地,Meistertzheim等[88]采用7個微衛(wèi)星標記評估了歐洲沿海自然群體和法國養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性,未發(fā)現(xiàn)2種群體間存在遺傳差異．這種遺傳同質(zhì)性可能是由于同一入侵群體作為親本在各地之間多次轉(zhuǎn)運．

Jiang等[89]采用AFLP和甲基化敏感擴增多態(tài)性技術評估了基礎群體和第3代選擇育種群體之間的遺傳和表觀遺傳差異，兩個群體相比,基因頻率有所改變,但是未觀測到遺傳多樣性的降低和平均甲基化水平的差異，不過觀測到少量的條帶在兩個群體之間出現(xiàn)頻率有差異．

An等[90]利用微衛(wèi)星九重PCR評估了韓國來自2個地理分區(qū)的6個長牡蠣群體的遺傳水平，所有的群體都表現(xiàn)出高水平的遺傳多樣性和雜合子缺失,在2個地理分區(qū)之間存在弱而顯著的遺傳差異,這主要歸因于泰安郡(Taean)和加德(Gaduk)2個群體間的遺傳差異，這種遺傳差異可能是最近才出現(xiàn)的,應該是多因素綜合作用的結(jié)果,暗示了來自2個地理分區(qū)的群體應該被區(qū)別對待．

歐洲牡蠣自30年前自緬因州被引進到加拿大沿海諸省,Vercaemer等[91]利用5個微衛(wèi)星位點分析了3個加拿大養(yǎng)殖群體和1個緬因州自然群體遺傳多樣性的差異，大量的等位基因丟失也被觀測到，但遺傳多樣性和雜合度在各群體中仍然是相當高的．

4　轉(zhuǎn)基因育種

轉(zhuǎn)基因技術的原理是將人工分離和修飾過的優(yōu)質(zhì)基因整合到生物體基因組中，并使其穩(wěn)定遺傳給后代,從而達到改造生物的目的．水產(chǎn)動物的轉(zhuǎn)基因研究比較滯后,自1985年Zhu等[92]報道了第1例轉(zhuǎn)基因魚以來,其他水產(chǎn)生物也相繼開展了一些轉(zhuǎn)基因術應用研究．在軟體動物中,常用的轉(zhuǎn)基因方法有顯微注射、基因槍轟擊和電穿孔法等,而實際使用中,多種方法聯(lián)合效果更佳．

1) 顯微注射法是利用專業(yè)的顯微操作設備將外源基因直接注入受體動物的受精卵原核內(nèi)部,使外源基因整合到受體細胞染色體上發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物的技術．顯微注射法可直接轉(zhuǎn)移目的基因,外源基因轉(zhuǎn)移效率高,實驗周期短；但是,這種方法整合的拷貝數(shù)和位點都具有不確定性,整合到染色體組的非活躍區(qū)時,會導致外源基因低表達或不表達．

2) 基因槍轟擊法是指利用火藥爆炸或高壓氣體加速等動力系統(tǒng),將攜帶了目的基因的金屬粒子(金或鎢)高速微彈送入生物組織和細胞中,從而實現(xiàn)外源目的基因在生物體內(nèi)穩(wěn)定表達的技術．基因槍轟擊法操作便捷,可同時處理大量受體細胞,但整合效率較低．

3) 電穿孔法是利用外部的脈沖電壓擊穿細胞膜后使外源基因直接從擊穿的膜孔通道進入受體細胞內(nèi)的方法．電穿孔法操作簡單,一次可以處理大量受精卵;但是,這種方法基因?qū)霟o定向、效率低,針對不同物種需要摸索最佳電脈沖條件．

轉(zhuǎn)基因技術在牡蠣中的應用研究比較滯后,還處于初始階段,迄今僅有少量的研究被報道．Boulo等[93]采用受精卵電穿孔后再用泛嗜性病毒處理的方法,成功實現(xiàn)了長牡蠣胚胎解離培養(yǎng)細胞的外源基因的表達；Cadoret等[94-95]采用受精卵顯微注射技術和對卵、受精卵及擔輪幼蟲的基因槍轟擊法探索了在長牡蠣中開展轉(zhuǎn)基因研究的可能性;Buchanan等[96]采用電穿孔和化學介導法將氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ基因成功導入美洲牡蠣受精后3 h的胚胎中,顯著提高了轉(zhuǎn)基因美洲牡蠣對新霉素和抗生素G418的耐受性．

5　多倍體育種

由于二倍體牡蠣在繁殖季節(jié)里性腺要經(jīng)過產(chǎn)卵排精的排放活動,使得牡蠣的軟體部會大幅消瘦,致使風味品質(zhì)受到較大影響;另外精卵排放后引起的體質(zhì)虛弱還會導致高溫季節(jié)的大量死亡．三倍體牡蠣因其不育或者育性差,在繁殖季節(jié)僅需要消耗少量能量用于性腺發(fā)育,從而節(jié)省更多的能量用于生長,全年都可以維持較高的糖原含量,肉質(zhì)肥滿．避免了二倍體牡蠣面臨的問題,是優(yōu)良的海水養(yǎng)殖對象．

5.1多倍體育種原理

牡蠣的精子在排放前已經(jīng)在體內(nèi)完成2次減數(shù)分裂,每個精子只攜帶了1組親本染色體．而排出的成熟卵子則仍然停留在第1次減數(shù)分裂中前期,只有在受精激活后,卵子才會進行第1次和第2次減數(shù)分裂,分別釋放出第一和第二極體．

目前,牡蠣三倍體育種主要有2種方法：1)人工直接誘導,通過抑制受精卵第一或第二極體的釋放,使極體攜帶的一組染色體停留在受精卵內(nèi),達到染色體組增加的目的,得到三倍體;2)通過四倍體和二倍體雜交,理論上可以產(chǎn)生100%三倍體子代．Guo等[97]認為抑制第一極體的釋放易導致第2次減數(shù)分裂過程中染色體的分離復雜化,并帶有很大的隨機性,得到二倍體、三倍體、四倍體和非整倍體胚胎的可能性增加,降低了三倍體誘導率．

5.2常用的誘導方法

Stanley等[98]最早在1981年使用細胞松弛素B(Cytochalasin B,CB)抑制第二極體誘導出美洲牡蠣三倍體.隨后,牡蠣的三倍體誘導研究相繼開展,使用的方法包括溫度休克、靜水壓、電脈沖和滲透壓等物理法，6-二甲氨基嘌呤(6-Dimethylaminopurine,6-DMAP)、CB、咖啡因和聚乙二醇等化學法以及利用二倍體和四倍體雜交的生物法．另外,還可通過細胞融合和雌核發(fā)育2種方法獲得牡蠣的四倍體．

5.2.1物理方法

1) 溫度休克主要是通過破壞受精卵細胞中的微管形成,從而阻礙了染色體向兩極方向移動,形成多倍體細胞．溫度休克法分低溫休克和熱休克,選擇合適的溫度是其關鍵步驟,需根據(jù)貝類原生活海區(qū)的水溫確定休克溫度,溫度過高或者過低都會導致多倍體的誘導效果較差．Quillet等[99]采用熱休克法(38 ℃)誘導日本長牡蠣,獲得60%的三倍體胚胎．長牡蠣的受精卵在0～4 ℃的低溫條件下,胚胎孵化率可高達90%以上,稚貝的三倍體率可達80%以上[100]．于瑞海[101]采用4～5 ℃的低溫休克法誘導長牡蠣,三倍體誘導率為68%．田傳遠等[102]發(fā)現(xiàn)在2～7 ℃的低溫條件下處理長牡蠣,均可獲得三倍體,三倍體率為36.8%．采用低溫(4～5 ℃)休克法處理大連灣牡蠣受精卵,可得到約70%的三倍體[103]．采用35 ℃的熱休克和10 ℃的低溫休克處理近江牡蠣的受精卵,獲得四倍體胚胎[104]．Guo等[97]采用35 ℃的熱休克法獲得長牡蠣的四倍體．

2) 靜水壓法的原理是利用較高的水靜壓(一般650 kg/cm3)作用于受精卵來抑制第二極體的排出,誘發(fā)三倍體．Chaiton等[105]利用靜水壓法誘導了長牡蠣的三倍體,成功率為57%．

3) 電脈沖休克可使細胞融合,從而誘發(fā)形成多倍體．Cadoret等[106]1992年采用電脈沖技術(600 V/m)對長牡蠣進行誘導,獲得20%的長牡蠣四倍體幼蟲．

4) 改變滲透壓通過改變滲透壓培育多倍體是一種新提出的誘導貝類三倍體的方法,其作用機理可能是海水鹽度的變化引起細胞內(nèi)的能量代謝紊亂,阻礙微管和微絲的形成,抑制細胞的分裂,使得復制的染色體留在胞質(zhì)內(nèi),從而形成三倍體[107]．于瑞海等[108]研究發(fā)現(xiàn),在低鹽6～10和高鹽55～60的范圍內(nèi),處理15 min,長牡蠣三倍體誘導率最高,可達到90%以上．王康等[109]采用低滲法誘導長牡蠣和近江牡蠣,均獲得高達89%的三倍體個體．通過改變海水鹽度培育牡蠣多倍體的方法顯示出了一定的應用前景．

5.2.2化學方法

1) CB是一種微絲抑制劑,可通過破壞構(gòu)成微絲的肌動蛋白纖維阻止細胞質(zhì)分裂和極體釋放,從而產(chǎn)生多倍體．但該藥難溶于水,劇毒可致癌,且價格昂貴．Downing等[110]使用CB誘導長牡蠣,三倍體率最高達(88±9)%．于瑞海等[111]在受精卵出現(xiàn)50%第一極體時,利用CB處理長牡蠣,獲得91.5%的三倍體子代．林位瑯[112]采用CB誘導長牡蠣,得到68.9%的三倍體子代．利用CB誘導僧帽牡蠣受精卵,三倍體誘導率最高可達87.5%[113]．利用CB,采用抑制第一和第二極體的方法,可以獲得長牡蠣四倍體[114-116]．

2) 6-DMAP是一種嘌呤毒素類似物,低毒無致癌性，較CB便宜，易溶于水,有較高的三倍體誘導率,可誘導蛋白質(zhì)進行去磷酸化,從而通過抑制牡蠣受精卵第二極體的釋放來獲得三倍體．Scarpa等[117]使用6-DMAP誘導美洲牡蠣得到的三倍體率為15%,而田傳遠等[118-119]利用6-DMAP抑制長牡蠣受精卵第一極體的釋放,最高可得到(71.3±1.2)%的三倍體;抑制受精卵第二極體的釋放,最高得到了93.8%的三倍體．利用6-DMAP抑制第一極體和第二極體的釋放,長牡蠣的幼蟲四倍體率分別平均為 38.57%～62.18%和50.45%～68.87%[115]．田傳遠等[120]在1996—1997年使用6-DMAP誘導長牡蠣三倍體時,出現(xiàn)了少量的四倍體．

3) 咖啡因可以通過提高細胞內(nèi)的Ca2+濃度引起微管二聚體的解聚,阻止分裂從而形成多倍體．Shpigel等[121]在1992年發(fā)現(xiàn)熱休克和咖啡因結(jié)合誘導效果更佳．林琪等[122]采用不同高溫結(jié)合不同濃度咖啡因誘導長牡蠣,三倍體率最高為71.88%．于瑞海等[123]采用咖啡因和熱休克結(jié)合的方法處理受精卵,誘導長牡蠣三倍體的成功率最高為90.5%．

4) 聚乙二醇是一種生物學中常用的細胞融合劑,通過促進細胞融合而形成多倍體．采用紫外線照射可使精子染色體失活,主要用于雌核發(fā)育,與化學處理相結(jié)合可誘導獲得四倍體．Guo等[124-125]1993年通過紫外線照射與CB處理相結(jié)合的方法獲得了長牡蠣四倍體胚胎,誘導率高達96%；1994年又采用聚乙二醇促進細胞融合得到了30%的長牡蠣四倍體胚胎．

5.2.3生物方法

物理方法安全無毒成本低,但是誘導率偏低；化學方法誘導率較高,但是使用的藥物通常具有毒性,殘留在三倍體牡蠣體內(nèi),對人類健康構(gòu)成威脅．而且三倍體不育或育性差,不能自我繁育延續(xù)種群,需要年年誘導,操作繁瑣,技術要求高,推廣難度大．而四倍體和普通二倍體雜交的生物方法可以解決上述問題,理論上它們雜交后可以產(chǎn)生100%的三倍體子代.并且四倍體牡蠣具有可育性,通過自身繁育可以形成穩(wěn)定的群系；方法簡單操作方便,且避免了理化處理對受精卵和幼蟲的傷害,可提高孵化率和幼蟲的存活率,是實現(xiàn)三倍體牡蠣規(guī)?；a(chǎn)的有效途徑．

1994年,Guo等[125]認為直接誘導的四倍體牡蠣難以培育至成體,可能是由于較大的四倍體核在正常體積的卵中卵裂而細胞數(shù)目不足引起的；隨后,使用熱休克(35 ℃)和合子融合,即換用體積更大的三倍體卵子與二倍體精子受精后抑制第一極體排出的方法,長牡蠣四倍體誘導成功率為45%,隨后采用四倍體母本和二倍體父本雜交,獲得100%的三倍體子代．因此,他們的方法首次成功獲得了存活的四倍體長牡蠣．另外,利用這種方法在美洲牡蠣中也培育出存活的四倍體,但是目前暫未見應用于生產(chǎn)的報道．學者們花費了大量的精力在牡蠣多倍體育種研究上,迄今為止,采用二倍體和四倍體雜交或者化學藥物誘導抑制第二極體排出的方法都可以得到大量的長牡蠣三倍體用以支撐商業(yè)生產(chǎn)．目前,三倍體長牡蠣已經(jīng)在美國西海岸、澳大利亞和我國北方地區(qū)獲得商業(yè)化生產(chǎn)和推廣．

6　展　望

牡蠣是一種重要的海洋生物資源，也是沿海各國重要的養(yǎng)殖對象，其養(yǎng)殖總產(chǎn)量在所有養(yǎng)殖品種中位居首位。牡蠣營養(yǎng)價值高，國內(nèi)外消費者對于牡蠣及其加工產(chǎn)品的需求日益增加.但在牡蠣的養(yǎng)殖過程中，仍經(jīng)常出現(xiàn)養(yǎng)殖個體小型化、生長慢、出肉率低等經(jīng)濟性狀持續(xù)衰退現(xiàn)象，嚴重影響牡蠣的養(yǎng)殖產(chǎn)量和質(zhì)量.特別是近年來由于牡蠣皰疹病毒病(OsHV-1)的爆發(fā)，給牡蠣養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的損失.優(yōu)良品種是牡蠣養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的關鍵所在，國內(nèi)外育種學家們通過選擇育種、雜交育種及多倍體等育種技術，培育出了一系列生長快、抗性強、品質(zhì)優(yōu)的牡蠣新品系/種，有效地促進了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展.未來在保護與挖掘優(yōu)質(zhì)牡蠣種質(zhì)資源的基礎上，利用各種育種技術，培育出更多品質(zhì)優(yōu)良的牡蠣新品種/系，結(jié)合高效健康養(yǎng)殖新技術，將進一步促進牡蠣養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展.

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Progress on Oyster Breeding

NING Yue,GUO Xiang,ZENG Zhinan*,QI Jianfei,WU Qisheng

(Fujian Fisheries Research Institute,Fujian Collaborative Innovation Center for Exploitation and Utilization of Marine Biological Resources,Xiamen 361013,China)

This paper gives a detailed statement of current status of and progress on oysters breeding at home and abroad,including traditional selective breeding,cross breeding and modern biological technologies,such as polyploid,transgenic and molecular markers.We are aiming to provide

for research and applications of oysters and other shellfish breeding.

oyster;selective breeding;cross breeding;molecular marker

10.6043/j.issn.0438-0479.201604106農(nóng)業(yè)生產(chǎn)專題

2016-04-14錄用日期：2016-06-26

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項(CARS-48)；福建省人民政府種業(yè)工程項目(2014S1477-9)

xmzzn@sina.com

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Q 953;S 917

A

0438-0479(2016)05-0624-13