不同多糖對凍藏過程中草魚肌原纖維蛋白流變性的影響

邵　穎，王小紅，熊光權，李　新，吳文錦，喬　宇，丁安子，廖　李，王　俊，汪　蘭，*

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術研究所，湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心農(nóng)產(chǎn)品加工研究分中心，湖北 武漢 430064；2.華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070）

不同多糖對凍藏過程中草魚肌原纖維蛋白流變性的影響

邵穎1，2，王小紅2，熊光權1，李新1，吳文錦1，喬宇1，丁安子1，廖李1，王俊1，汪蘭1，*

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術研究所，湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心農(nóng)產(chǎn)品加工研究分中心，湖北 武漢 430064；2.華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070）

以草魚肌原纖維蛋白作為研究對象，添加魔芋葡甘聚糖降解產(chǎn)物及葡聚糖（7 000 D，T7），測定草魚肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和流變性質(zhì)的變化，比較不同多糖對凍藏過程中肌原纖維蛋白的冷凍保護效果，探討不同多糖對草魚肌原纖維蛋白結構的冷凍保護機制。研究發(fā)現(xiàn)，隨凍藏時間的延長，空白、酶解魔芋葡甘聚糖、輻解魔芋葡甘聚糖、T7及商業(yè)抗凍劑各組對應草魚肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度和流變儲能模量（G’）均下降，與凍藏過程草魚肌原纖維蛋白SDS-PAGE的變化基本吻合。同時，添加上述不同多糖各組草魚肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度和G’均高于空白組。研究結果表明：T7、酶解魔芋葡甘聚糖及輻解魔芋葡甘聚糖通過保護副肌球蛋白和肌球蛋白輕鏈，延緩草魚肌原纖維蛋白的變性，其中，輻解魔芋葡甘聚糖效果最強，T7次之，酶解魔芋葡甘聚糖最弱，但都具有明顯的冷凍保護作用。

肌原纖維蛋白；多糖；冷凍保護；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳；流變

隨著中國漁業(yè)經(jīng)濟保持良好的發(fā)展態(tài)勢，淡水魚產(chǎn)量持續(xù)升高，魚類食品加工業(yè)不斷發(fā)展。目前，為了實現(xiàn)魚糜的長期保藏，工業(yè)化生產(chǎn)通常采用冷凍貯藏的方式，而肌原纖維蛋白作為魚糜的主要功能性成分［1］，極易發(fā)生冷凍變性，從而導致功能性的降低和品質(zhì)的劣化［2］，嚴重影響消費者對口感和營養(yǎng)成分的需求，因而常常添加抗凍劑以降低冰點、提高抗凍能力，在一定程度上抑制蛋白質(zhì)冷凍變性。現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)上廣泛采用商業(yè)抗凍劑（4%山梨糖醇+4%蔗糖），但是，該抗凍劑甜度和熱量較高，不符合現(xiàn)代生活中人們對健康飲食的追求［3］，因而關于開發(fā)低甜度、低熱量抗凍劑的研究有待進一步深入。本課題組在前期研究的基礎上，篩選出β-葡聚糖酶酶解魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）、輻解KGM及葡聚糖（7 000 D，T7）這3 種多糖，發(fā)現(xiàn)它們對肌原纖維蛋白具有優(yōu)良的冷凍保護作用，現(xiàn)從肌原纖維蛋白的結構角度探討上述3 種多糖的冷凍保護作用機制。

蛋白質(zhì)作為參與生理活動和構成生物體的必要物質(zhì)，其流變性及凝膠性等流變學性質(zhì)會影響食品的感官特性［4］及其在加工、運輸或貯藏過程中的理化特性。由于肌原纖維蛋白是魚糜蛋白的主要成分，因而冷凍草魚魚糜的品質(zhì)及后續(xù)加工性能高低與凍藏過程中肌原纖維蛋白發(fā)生聚集變性的程度密切相關。尤其，肌原纖維蛋白凝膠化過程中的流變特性反映蛋白質(zhì)的品質(zhì)［5］，其中，儲能模量（G’）作為凝膠材料的彈性反映，反映了蛋白質(zhì)在加熱過程中形成三維彈性凝膠網(wǎng)絡結構的變化情況以及展幵和聚集過程。Liu Ru等［6］研究表明不同離子強度、蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和溫度條件下魚肉肌球蛋白的靜態(tài)流變性質(zhì)差異顯著。Westphalen等［7］研究發(fā)現(xiàn)由于蛋白質(zhì)凝膠的逐步形成，豬肉肌原纖維蛋白在加熱至40 ℃后，G’不斷增加。

目前，蛋白水解物、酶解物及低聚糖類等抗凍劑對魚糜的冷凍保護作用已成為近年來的研究熱點［1］，且主要研究其對魚糜蛋白總巰基含量、二硫鍵含量和Ca2+-ATPase活性等理化指標及質(zhì)構特性、持水力等凝膠性能的影響。另外，許多研究探討了魚糜蛋白的變性機制，發(fā)現(xiàn)海藻糖、木糖、聚葡萄糖及乳酸鈉等對蛋白質(zhì)凝膠特性及理化性質(zhì)影響顯著，有助于抑制冷凍變性，可作為傳統(tǒng)商業(yè)抗凍劑的替代物［1，8］。但是對β-葡聚糖酶酶解KGM、輻解KGM及T7等不同多糖鮮有研究，本實驗以草魚肌原纖維蛋白為研究對象，測定草魚肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和流變性能的變化，比較不同多糖對凍藏過程中肌原纖維蛋白的冷凍保護效果，為開發(fā)新型低甜度、低熱量抗凍劑提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1 450～1 500 g的新鮮健康草魚（Ctenopharyngodon idellus，2 h內(nèi)致死） 湖北省武漢市武商量販農(nóng)科城店。

pH值校正緩沖液（pH 4.00、6.86、9.18；25 ℃）邦西儀器科技（上海）有限公司；牛血清蛋白（生化試劑）、β-葡聚糖（200 000 U/g）（化學純） 美國BioSharp公司；NaCl、EDTA、MgCl2·6H2O、KH2PO4、NaOH、HCl、Na2HPO4·12H2O、KCl、雙縮脲試劑及葡聚糖T7（含鹽量0%）（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；KGM（化學純） 湖北強森魔芋科技有限公司。

1.2儀器與設備

AR2000ex流變儀 美國TA儀器公司；GL-21M高速冷凍離心機 湖北賽特湘儀離心機儀器有限公司；XHF-D型高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；722G可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；鈷60γ射線輻照裝置、pH-5A酸度計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。

1.3方法

1.3.1原料處理

每條魚取背部即自魚體兩側鰓蓋骨后至尾鰭前肌肉作為樣品進行測定［9］。將魚宰殺去掉魚頭、魚皮和內(nèi)臟，用水將其沖洗干凈，手工采取側線上方、背鰭附近的白肉，將其切成魚塊（2 mm×2 mm×2 mm），放于自封袋（120 mm×170 mm）中，置于4 ℃冰箱中冷藏，備用。

1.3.2肌原纖維蛋白的提取

參照劉紅彥［10］的方法從魚肉肌肉中提取肌原纖維蛋白，并適當修改。將新鮮魚肉切碎，加入4 倍體積的冷50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（1 mmol/L EDTA、2 mmol/LMgCl2、0.1 mol/L NaCl，pH 7.0），高速勻漿2 min，在轉速8 000×g、溫度4 ℃條件下冷凍離心15 min，棄除上清液，收集沉淀，重復上述步驟3 次；向沉淀中加入4 倍體積的冷0.1 mol/L NaCl溶液，高速勻漿30 s，調(diào)整混合液的pH值為6.25，在轉速8 000×g、溫度4 ℃條件下冷凍離心15 min，棄除上清液，收集沉淀，重復2 次，收集的沉淀為肌原纖維蛋白。

1.3.3KGM降解產(chǎn)物的制備

輻解KGM（分子質(zhì)量1.209×104D［11］，純度100%，含鹽量0%）的制備：取5 g KGM精粉，以料液比1∶60（g/mL）溶解于蒸餾水中，在靜態(tài)常溫條件下進行20 kGy降解，然后冷凍干燥，粉碎備用［12］；β-葡聚糖酶酶解KGM（分子質(zhì)量2.093×104D［11］，純度100%，含鹽量5.75×10-2.5%）的制備：取5 g KGM精粉，以料液比1∶60（g/mL）溶解于稀鹽酸溶液（pH 5.5）中，50 ℃水浴加熱，加入β-葡聚糖酶，緩慢攪拌至均勻分散，酶解100 min，然后用1 mol/L的NaOH溶液中和，干燥后粉碎備用［12］。

1.3.4樣品制備

稱取0.25 g酶解KGM（0.5%）、0.25 g輻解KGM（0.5%）及0.25 g T7（0.5%），分別加入25 g 50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH 6.25），溶解均勻，再分別加入至25 g肌原纖維蛋白沉淀中，均質(zhì)，然后分裝至50 mL離心管中，共3 份，每份約15 g，放置于-18 ℃冰箱中貯藏，分別在0、10、75 d后取出進行分析。空白組不添加任何糖類，陽性對照組添加商業(yè)抗凍劑，即2.0 g山梨糖醇（4.0%）與2.0 g蔗糖（4.0%）的復配物。

1.3.5蛋白質(zhì)量濃度測定

向樣品中加入25 倍體積的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH 6.25），高速勻漿2 min，4 ℃放置1 h，得到肌原纖維蛋白溶液［10］。參照周茹等［13］的方法，采用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)量濃度，標準蛋白為牛血清白蛋白。標準曲線為Y=0.043 7X+0.015 4，相關系數(shù)R2=0.999 4，對照標準曲線求得樣品蛋白質(zhì)量濃度。

1.3.6SDS-PAGE測定

參照Laermmli［14］、郭殼君［15］等的方法，并適當修改：取干凈的微量離心管，將樣品按體積比1∶1加入SDS緩沖液（2 倍配比），沸水浴5 min后取出。吸取10 μL蛋白樣品及5 μL標準分子質(zhì)量蛋白Marker，輕輕加入梳孔中，然后向內(nèi)槽中加入適量的電泳緩沖液（1 倍配比），選擇恒壓條件，積層膠（4%）中于60 V電壓跑膠，待樣品跑成一條直線且進入分離膠（10%）后，調(diào)節(jié)電壓至100 V，繼續(xù)電泳，直到溴酚藍跑出凝膠底部，關閉電源。將膠從玻璃板取出后置于干凈的玻璃培養(yǎng)皿中，加入適量的考馬斯亮藍染色液 R-250，置于搖床過夜染色。染色完畢后，回收染色液，加入適量脫色液，置于搖床脫色，換液數(shù)次，直至凝膠上的背景色完全脫去，然后置于濕潤的白板上，使用凝膠成像儀照相。

1.3.7流變性能測定

參照劉澤宇等［16］的方法，并適當修改：采用直徑40.00 mm、角度0 °的平行板進行測定。取2 mL樣品上樣，控制夾縫高度為1 mm，刮除四周溢出的樣品，蓋住避免外周水分的蒸發(fā)。溫度掃描條件：頻率0.1 Hz，應變1%，程序升溫范圍20～90 ℃，升溫速率1 ℃/min，在90 ℃處恒溫2 min后，以5 ℃/min的降溫速率降溫至20 ℃后結束，然后進行該樣品的頻率掃描。頻率掃描條件為：頻率0.1～10 Hz，應變1%，恒溫20 ℃。每個樣品測定4～5 次，記錄肌原纖維蛋白G’，繪制升溫和降溫過程中G’隨溫度T變化以及頻率掃描過程中G’隨頻率f變化的曲線圖。

1.4數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用數(shù)學軟件SAS 8.0和Microsoft Excel，結果采用±s形式表示，差異顯著性水平為P＜0.05。

2　結果與分析

2.1肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度的變化

表1　凍藏過程中不同多糖作用條件下的草魚肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度Table1　Effect of different-molecular-weight polysaccharides on the concentration of grass carp myofibrillar protein during frozen storage mg/mL

如表1所示，隨時間延長，空白、酶解KGM、輻解KGM、T7及商業(yè)抗凍劑各組對應凍藏過程中草魚肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度均在一定程度上降低。其中，空白組、輻解KGM組和T7組凍藏0 d與凍藏10 d對應肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度變化不顯著（P＞0.05），但是凍藏時間延長至75 d時，變化顯著（P＜0.05）；酶解KGM組凍藏0、10 d及75 d時肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度變化均顯著（P＜0.05）；商業(yè)抗凍劑組凍藏0、10、75 d時肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度變化顯著（P＜0.05），但呈現(xiàn)微弱的波動性變化。當凍藏0 d及10 d時，酶解KGM、輻解KGM及T7各組草魚肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度均高于空白組及商業(yè)抗凍劑組，且差異顯著（P＜0.05），凍藏0 d時空白組與商業(yè)抗凍劑組相近，差異不顯著（P＞0.05），而凍藏10 d時商業(yè)抗凍劑組高于空白組，差異顯著（P＜0.05）；當凍藏75 d時，酶解KGM、輻解KGM、T7及商業(yè)抗凍劑各組草魚肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度均高于空白組，差異顯著（P＜0.05），酶解KGM及輻解KGM兩組均低于商業(yè)抗凍劑組，差異顯著（P＜0.05），T7組與商業(yè)抗凍劑組相近，差異不顯著（P＞0.05）。凍藏過程中蛋白質(zhì)量濃度的降低源于蛋白質(zhì)的冷凍變性。楊芳［17］研究指出冰晶的形成會導致蛋白質(zhì)發(fā)生冷凍變性，主要表現(xiàn)在結合水發(fā)生脫離，蛋白質(zhì)容易聚集，并且伴隨冰晶逐漸增大，細胞液外流加劇。在添加多糖后，肌原纖維蛋白最終質(zhì)量濃度高于空白組可能是由于多糖的冷凍保護作用，即多糖一方面排除蛋白質(zhì)表面的穩(wěn)定溶質(zhì)，促使其優(yōu)先水合［18］，另一方面與蛋白質(zhì)的功能基團以離子鍵或氫鍵結合，取代極性基團附近的水分子，避免氫鍵連接點的直接暴露，進而穩(wěn)定蛋白質(zhì)的高級結構。Macdonald［19］、Carvajal［20］等研究認為多糖可以形成玻璃態(tài)結構或固定水，從而穩(wěn)定蛋白質(zhì)，發(fā)揮冷凍穩(wěn)定劑的作用。綜上，酶解KGM、輻解KGM及T7對凍藏過程中的草魚肌原纖維蛋白皆具有一定的冷凍保護作用，且T7效果最佳，與傳統(tǒng)商業(yè)抗凍劑接近。

2.2肌原纖維蛋白SDS-PAGE結果

圖1　添加不同多糖的草魚肌原纖維蛋白SDS-PAGE圖Fig.1　SDS-PAGE patterns of grass carp myofibrillar protein with different-molecular-weight polysaccharides added

如圖1所示，草魚肌原纖維蛋白是一個較為復雜的蛋白體系，在SDS-PAGE圖譜上可清晰分辨出約10 條蛋白帶，其中主要條帶為肌球蛋白重鏈（220 kD）、副肌球蛋白（100 kD）、肌動蛋白（44.3 kD）、原肌球蛋白（37 kD）、肌原蛋白（33 kD）以及3 種肌球蛋白輕鏈（15、17、24 kD），結果與Lametsch［21］、Mignino［22］等研究基本一致。另外，還有一些分子質(zhì)量在72～95 kD間的明顯蛋白條帶，而肌球蛋白重鏈和肌動蛋白為最主要的蛋白條帶。電泳條帶顏色深淺在一定程度上反映肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度高低，觀察發(fā)現(xiàn)以上電泳條帶深淺與肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度相吻合。

在凍藏0 d時，空白、酶解KGM、輻解KGM、T7及商業(yè)抗凍劑各組蛋白條帶間沒有太大差別。但是，當凍藏時間延長至10 d及75 d時，上述各組蛋白條帶間出現(xiàn)明顯差異。隨凍藏時間的延長，空白組蛋白條帶整體變窄變淺，其中，肌球蛋白重鏈、肌球蛋白輕鏈、副肌球蛋白及肌動蛋白變化明顯，最后肌球蛋白輕鏈甚至消失。肌球蛋白重鏈變窄可能是因為大分子的肌球蛋白重鏈降解為小分子的蛋白質(zhì)從而導致肌球蛋白重鏈量的減少。同時，分子質(zhì)量在72～95 kD間蛋白條帶變淺，肌動蛋白及原肌球蛋白的條帶變窄，且靠近原肌球蛋白處有新的小分子質(zhì)量條帶出現(xiàn)，說明原肌球蛋白和肌動蛋白可能發(fā)生部分變性，蛋白質(zhì)在一定程度上發(fā)生降解。相比于空白組，凍藏10 d及75 d時酶解KGM組蛋白條帶整體更窄，凍藏75 d時輻解KGM及T7兩組蛋白條帶中肌球蛋白重鏈及肌動蛋白均寬于空白組，但是凍藏10 d時原肌球蛋白及肌原蛋白更窄；在凍藏過程中商業(yè)抗凍劑組蛋白條帶整體寬于空白組，且靠近原肌球蛋白處沒有新的小分子質(zhì)量條帶出現(xiàn)，而酶解KGM、輻解KGM及T7各組均出現(xiàn)。另外，最為突出的是酶解KGM、輻解KGM、T7及商業(yè)抗凍劑各組副肌球蛋白及肌球蛋白輕鏈顏色均明顯深于空白組，說明酶解KGM、輻解KGM及T7對凍藏過程中的草魚肌原纖維蛋白尤其對副肌球蛋白及肌球蛋白輕鏈具有有效的冷凍保護作用。

2.3肌原纖維蛋白流變性能變化

2.3.1升溫過程中草魚肌原纖維蛋白G’的變化

流變學特性可以代表蛋白質(zhì)在升溫過程中的相關變化，其中，肌原纖維蛋白G’的改變表明蛋白質(zhì)彈性凝膠網(wǎng)絡形成速率的變化，反映結構的打開、折疊和凝集情況［23］。

圖2 升溫過程中草魚肌原纖維蛋白G’的變化Fig.2　Changes in G’ of grass carp myofibrillar protein in heating process

圖2a顯示，當凍藏0 d時，隨著溫度的升高，空白、酶解KGM、輻解KGM、T7及商業(yè)抗凍劑各組對應凍藏過程中草魚肌原纖維蛋白G’總體變化趨勢相同。當溫度由20 ℃上升至40 ℃時，G’升高但變化平緩，其間，空白、酶解KGM、輻解KGM、T7及商業(yè)抗凍劑各組對應最高G’分別為618（33 ℃）、559.9（37.7 ℃）、823.1（38.7 ℃）、732.4 Pa（36 ℃）及642.05 Pa（39.7 ℃）；在40～50 ℃時，G’迅速下降且在50 ℃左右到達最低值，空白、酶解KGM、輻解KGM、T7及商業(yè)抗凍劑各組對應最低G’分別為125（48.3 ℃）、142.75（48.3 ℃）、210.9（47.9 ℃）、159.05 Pa（47.9 ℃）及214.15 Pa（49.6 ℃），在50～65 ℃時呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，在溫度上升至90 ℃的過程中，G’緩慢升高最終趨于平緩。

圖2b顯示，凍藏10 d時，隨著溫度的升高，空白、酶解KGM、輻解KGM及T7各組對應凍藏過程中草魚肌原纖維蛋白G’總體變化趨勢相同。當溫度由20 ℃上升至35 ℃左右時，G’基本保持不變，然后略微下降，當溫度到達36 ℃附近時，空白、酶解KGM、輻解KGM及T7各組出現(xiàn)最低G’分別為43.67（36.3 ℃）、48.17（35.6 ℃）、89.18 Pa（38.7 ℃）及69.27 Pa（36.7 ℃）；當溫度升高至40 ℃時，G’上升且在40 ℃左右到達峰頂，空白、酶解KGM、輻解KGM及T7各組對應最高G’分別為76.51（40.1 ℃）、77（40.1 ℃）、122.9 Pa（40.4 ℃）及 101.85 Pa（40.1 ℃），在40～48 ℃左右時，G’下降至最低值，空白、酶解KGM、輻解KGM及T7各組對應最低G’分別為29.06（47.9 ℃）、43.1（48.6 ℃）、77.6 Pa（47.6 ℃）及54.43 Pa（47.9 ℃），當溫度上升至65 ℃前，G’迅速上升，在溫度上升至90 ℃的過程中，G’緩慢升高。在溫度上升至90 ℃的過程中，G’緩慢升高趨于平緩。但是，商業(yè)抗凍劑組在升溫過程中草魚肌原纖維蛋白G’的變化與上述樣品組存在明顯差別。在20～40 ℃之間，G’基本保持不變，在溫度40～50 ℃時，G’迅速下降至最低值88.79 Pa（50 ℃），當溫度上升至65 ℃前，G’迅速上升，在溫度上升至90 ℃的過程中，G’緩慢升高。

圖2c顯示，凍藏75 d時，隨著溫度的升高，酶解KGM、輻解KGM及T7各組對應凍藏過程中草魚肌原纖維蛋白G’總體變化趨勢相同。當溫度由20 ℃上升至33 ℃左右時，G’緩慢上升至第一個峰頂，此時酶解KGM、輻解KGM及T7各組對應草魚肌原纖維蛋白G’為4.749（33.6 ℃）、37.79 Pa（32.6 ℃）及11.25 Pa（34 ℃），然后緩慢下降，當溫度接近37 ℃時出現(xiàn)峰谷，此時酶解KGM、輻解KGM及T7各組對應草魚肌原纖維蛋白G’為3.693（37 ℃）、32.14 Pa（36.7 ℃）及9.487 Pa（37 ℃），當溫度到達36 ℃附近時，空白、酶解KGM、輻解KGM及T7各組出現(xiàn)最低G’分別為43.67（36.3 ℃）、48.17（35.6 ℃）、89.18 Pa（38.7 ℃）及69.27 Pa（36.7 ℃）；當溫度升高至40 ℃時出現(xiàn)第2個峰頂，此時KGM、輻解KGM及T7各組對應G’為4.569（40.1 ℃）、33.37 Pa（39.8 ℃）及12.55 Pa（40.4 ℃），然后緩慢下降，直至47 ℃左右后G’緩慢上升。但是，空白組及商業(yè)抗凍劑組在升溫過程中草魚肌原纖維蛋白G’的變化與上述樣品組存在明顯差別。對于空白組，在20～33 ℃之間，G’緩慢上升至第一個峰頂，此時G’為7.683 Pa（33.6 ℃），在溫度上升至48 ℃的過程中，G’緩慢下降，最后在溫度上升至90 ℃期間G’再次緩慢上升趨于穩(wěn)定。對于商業(yè)抗凍劑組，在20～40 ℃之間，G’緩慢下降至第一個峰谷，此時G’為63.33 Pa（40.1 ℃），當溫度升高至44 ℃，G’上升至第一個峰頂78.54Pa（43.8 ℃），然后迅速下降至第2個峰谷，此時G’為37.46 Pa（49.7 ℃），之后迅速上升直至溫度到達70 ℃，最后在70～90 ℃之間，G’上升但變化微弱。

升溫過程中肌原纖維蛋白G’的變化曲線反映了蛋白質(zhì)開始變性、發(fā)生聚集及形成空間網(wǎng)絡的過程［24］。圖2a、b中，在溫度由20 ℃上升至30 ℃左右時，G’的上升可能由于肌原纖維蛋白在低溫條件下發(fā)生的相互作用［25］。G’于40 ℃附近出現(xiàn)一個峰可能是因為肌球蛋白開始形成網(wǎng)絡結構，而圖2c中，G’于30～40 ℃之間出現(xiàn)兩個峰一方面因為變性肌球蛋白頭部與解旋肌球蛋白尾部的結合［26］，另一方面歸于肌球蛋白頭部和尾部熱穩(wěn)定性不同，因此發(fā)生熱變性形成網(wǎng)絡結構的溫度存在一定差異。隨后，在40～50 ℃之間G’迅速下降一方面因為肌球蛋白發(fā)生解螺旋，從而破壞蛋白質(zhì)網(wǎng)絡結構的完整性［27］并導致流動性增強［27］，另一方面因為肌動球蛋白復合物的解體［7］，還可能因為加熱激活蛋白酶，肌球蛋白量降低，更容易擊破松散的凝膠網(wǎng)絡［25］。當溫度由50 ℃上升至65 ℃左右時，G’再次升高是由于超過變性溫度后分子展開，活躍基團暴露［28］，解螺旋蛋白質(zhì)開始聚集、沉淀及交聯(lián)，再次構建空間網(wǎng)絡結構［29］，這主要依靠二硫鍵、疏水相互作用及肌球蛋白的不可逆交聯(lián)［30］。最后，溫度在上升至90 ℃過程中，G’上升意味著蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡隨著活性基團的暴露剛性增強。有研究發(fā)現(xiàn)草魚肌原纖維蛋白G’與溫度密切相關，在升溫過程中G’先上升（20～55 ℃），再下降（55～63 ℃），最后上升（63～85 ℃）［5，31］，其中，G’的減小源于蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的破壞，當?shù)鞍踪|(zhì)螺旋轉變?yōu)榫砬鸂顦嬒蠛?，半凝膠的流動性急劇增大，故而破壞蛋白質(zhì)網(wǎng)絡結構［32］，與本實驗的結果基本吻合。

當凍藏0 d時，在升溫過程（20～90 ℃）中草魚肌原纖維蛋白G’由高到低依次為：輻解KGM組＞商業(yè)抗凍劑組＞T7組＞酶解KGM組＞空白組，即加入不同相對分子質(zhì)量多糖的樣品彈性大小由高到低依次為：輻解KGM組＞商業(yè)抗凍劑組＞T7組＞酶解KGM組＞空白組；當凍藏10 d及75 d時升溫過程中草魚肌原纖維蛋白G’由高到低依次為：商業(yè)抗凍劑組＞輻解KGM組＞T7組＞酶解KGM組＞空白組，即加入不同相對分子質(zhì)量多糖的樣品彈性大小由高到低依次為：商業(yè)抗凍劑組＞輻解KGM組＞T7組＞酶解KGM組＞空白組。

隨凍藏時間的延長，空白、酶解KGM、輻解KGM及T7各組對應草魚肌原纖維蛋白G’均下降，與各組凍藏過程草魚肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度的變化基本吻合。不同樣品組在相同凍藏時間條件下，草魚肌原纖維蛋白G’大小與SDS-PAGE圖譜中蛋白條帶顏色深淺及寬度相關聯(lián)。肌球蛋白作為肌原纖維蛋白主要組成成分，其熱變性溫度在40 ℃左右，圖2中40 ℃附近各組峰值大小則與蛋白條帶中肌球蛋白條帶顏色深淺及寬度吻合；同一樣品組在不同凍藏時間下，草魚肌原纖維蛋白G’大小隨凍藏時間的延長整體逐漸減小，同時SDS-PAGE圖譜中蛋白條帶也呈現(xiàn)整體逐漸變淺變窄的趨勢，即二者相互吻合。觀察草魚肌原纖維蛋白G’發(fā)現(xiàn)，商業(yè)抗凍劑作為陽性對照，效果明顯優(yōu)于酶解KGM、輻解KGM及T7這3 種多糖，這可能與商業(yè)抗凍劑的高添加量密切相關。但是，從上述現(xiàn)象中不難得出這3 種多糖對整個凍藏過程中的草魚肌原纖維蛋白皆起到一定的冷凍保護作用，且對照SDS-PAGE圖譜發(fā)現(xiàn)它們主要保護副肌球蛋白和肌球蛋白輕鏈。肌球蛋白輕鏈具有與肌動蛋白結合的能力及ATP酶活性［33-34］，由于肌動蛋白無法單獨形成凝膠，只有與肌球蛋白輕鏈結合后，再與伸展的肌球蛋白形成蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡［35］，故而肌球蛋白輕鏈在很大程度上決定肌原纖維蛋白凝膠的形成［33-34］。副肌球蛋白主要由α-螺旋組成，在冷凍變性時α-螺旋會部分轉化為β-折疊和無規(guī)則卷曲結構［36］，蛋白質(zhì)構象的穩(wěn)定性和緊密程度大幅下降，在進一步解旋后，多肽鍵伸展，蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水殘基暴露，疏水相互作用增強，同時巰基氧化成二硫鍵，導致蛋白質(zhì)相互聚合從而變性［37］。本課題組在前期研究的基礎上發(fā)現(xiàn)，輻解KGM和酶解KGM通過穩(wěn)定α-螺旋和β-折疊保護蛋白質(zhì)二級結構從而延緩聚集變性［12］。由此，推測這3 種多糖可能保護副肌球蛋白的α-螺旋及肌球蛋白輕鏈，在一定程度上延緩副肌球蛋白的解螺旋及肌球蛋白輕鏈的重折疊，有利于保持蛋白質(zhì)結構的完整性，從而減小蛋白質(zhì)凝膠性能的損失，故而G’均高于空白組，即這3 種多糖對整個凍藏過程中的草魚肌原纖維蛋白皆起到一定的冷凍保護作用，其中，輻解KGM冷凍保護作用最強，T7次之，酶解KGM具有冷凍保護作用但是效果最弱。

2.3.2降溫過程中草魚肌原纖維蛋白G’的變化

圖3 升溫過程中草魚肌原纖維蛋白G’的變化Fig.3　Changes in G’ of grass carp myofibrillar protein in heating process

圖3a顯示，當凍藏0 d時，隨著溫度的降低（由90 ℃下降至20 ℃），空白、酶解KGM、輻解KGM、T7及商業(yè)抗凍劑各組對應凍藏過程中草魚肌原纖維蛋白G’均呈上升趨勢，說明低溫有利于肌原纖維蛋白凝膠形成，不同多糖組變化趨勢相同。在降溫過程中草魚肌原纖維蛋白G’由高到低依次為：T7組＞空白組＞商業(yè)抗凍劑組＞輻解KGM組＞酶解KGM組，即加入不同相對分子質(zhì)量多糖的樣品彈性大小由高到低依次為：T7組＞空白組＞商業(yè)抗凍劑組＞輻解KGM組＞酶解KGM組。

圖3b顯示，當凍藏10 d時，隨著溫度的降低，空白、酶解KGM、輻解KGM、T7及商業(yè)抗凍劑各組對應凍藏過程中草魚肌原纖維蛋白G′均呈上升趨勢，說明低溫有利于肌原纖維蛋白凝膠形成，不同多糖組變化趨勢相同。在降溫過程中草魚肌原纖維蛋白G′由高到低依次為：商業(yè)抗凍劑組＞酶解KGM組＞T7組＞輻解KGM組＞空白組，即加入不同相對分子質(zhì)量多糖的樣品彈性大小由高到低依次為：商業(yè)抗凍劑組＞酶解KGM組＞T7組＞輻解KGM組＞空白組。

圖3c顯示，當凍藏75 d時，隨著溫度的降低，空白、酶解KGM、輻解KGM、T7及商業(yè)抗凍劑各組對應凍藏過程中草魚肌原纖維蛋白G’均呈上升趨勢，說明低溫有利于肌原纖維蛋白凝膠形成，不同多糖組變化趨勢相同。在降溫過程中草魚肌原纖維蛋白G’由高到低依次為：商業(yè)抗凍劑組＞T7組＞酶解KGM組＞輻解KGM組＞空白組，即加入不同相對分子質(zhì)量多糖的樣品彈性大小由高到低依次為：商業(yè)抗凍劑組＞T7組＞酶解KGM組＞輻解KGM組＞空白組。

已有研究［25，28］發(fā)現(xiàn)，在溫度由90 ℃下降至20 ℃過程中，草魚和雞肉肌原纖維蛋白G’一直上升，這意味著蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡在冷卻過程中增強。隨著凍藏時間的延長，同一樣品組在降溫過程中草魚肌原纖維蛋白G’下降，代表著蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡強度逐漸下降，但是，在相同凍藏時間條件下酶解KGM、輻解KGM、T7及商業(yè)抗凍劑各組G’均上升且基本皆高于空白組，說明酶解KGM、輻解KGM、T7及商業(yè)抗凍劑都能夠增強草魚肌原纖維蛋白凝膠網(wǎng)絡的強度。其中，商業(yè)抗凍劑作為陽性對照，效果明顯優(yōu)于酶解KGM、輻解KGM及T7這3 種多糖。但是，從上述現(xiàn)象中不難發(fā)現(xiàn)這3 種多糖對整個凍藏過程中的草魚肌原纖維蛋白皆起到一定的冷凍保護作用，且三者中T7冷凍保護作用最強，酶解KGM次之，輻解KGM具有冷凍保護作用但是效果最弱。

2.3.3頻率掃描過程中草魚肌原纖維蛋白G′的變化

圖4 頻率掃描過程中草魚肌原纖維蛋白G’的變化Fig.4　Changes in G’ of grass carp myofibrillar protein in frequency scanning process

圖4a顯示，當凍藏0 d時，隨著頻率的升高（0.1～10 Hz），空白、酶解KGM、輻解KGM、T7及商業(yè)抗凍劑各組對應凍藏過程中草魚肌原纖維蛋白G’總體變化趨勢相同且皆略有升高。在頻率掃描過程中草魚肌原纖維蛋白G′由高到低依次為：輻解KGM組＞T7組＞商業(yè)抗凍劑組＞空白組＞酶解KGM組，即加入不同相對分子質(zhì)量多糖的樣品彈性大小由高到低依次為：輻解KGM組＞T7組＞商業(yè)抗凍劑組＞空白組＞酶解KGM組。

圖4b顯示，當凍藏10 d時，隨著頻率的升高，空白、酶解KGM、輻解KGM、T7及商業(yè)抗凍劑各組對應凍藏過程中草魚肌原纖維蛋白G’總體變化趨勢相同且皆略有升高。在頻率掃描過程中草魚肌原纖維蛋白G’由高到低依次為：商業(yè)抗凍劑組＞酶解KGM組＞T7組＞輻解KGM組＞空白組，即加入不同相對分子質(zhì)量多糖的樣品彈性大小由高到低依次為：商業(yè)抗凍劑組＞酶解KGM組＞T7組＞輻解KGM組＞空白組。

圖4c顯示，當凍藏75 d時，隨著頻率的升高，空白、酶解KGM、輻解KGM、T7及商業(yè)抗凍劑各組對應凍藏過程中草魚肌原纖維蛋白G’總體變化趨勢相同且皆略有升高。在頻率掃描過程中草魚肌原纖維蛋白G’由高到低依次為：商業(yè)抗凍劑組＞T7組＞酶解KGM組＞輻解KGM組＞空白組，即加入不同相對分子質(zhì)量多糖的樣品彈性大小由高到低依次為：商業(yè)抗凍劑組＞T7組＞輻解KGM組＞酶解組＞空白組。

頻率掃描主要反映材料力學性能和頻率的關系，展示不明顯次級轉變的特性［38］。在相同凍藏時間條件下，各組G’在整個頻率掃描范圍內(nèi)皆呈單調(diào)性增大，與部分聚合物溶液在低頻率掃描時表現(xiàn)的黏彈性極為相似［39］，很好地揭示了凝膠微觀結構的變化［40］，另外，這意味著隨掃描頻率的升高，肌原纖維蛋白三維凝膠網(wǎng)絡的凝膠性能增強。隨著凍藏時間的延長，同一樣品組在頻率掃描過程中草魚肌原纖維蛋白G’下降，代表蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡強度逐漸下降，但是，酶解KGM、輻解KGM、T7及商業(yè)抗凍劑各組基本皆高于空白組，說明酶解KGM、輻解KGM、T7及商業(yè)抗凍劑都能夠增強草魚肌原纖維蛋白凝膠網(wǎng)絡的彈性。其中，商業(yè)抗凍劑作為陽性對照，效果明顯優(yōu)于酶解KGM、輻解KGM及T7這3 種多糖。但是，從上述現(xiàn)象中不難發(fā)現(xiàn)這3 種多糖對整個凍藏過程中的草魚肌原纖維蛋白皆起到一定的冷凍保護作用，且三者中T7冷凍保護作用最強，酶解KGM次之，輻解KGM具有冷凍保護作用但是效果最弱。

3　結 論

隨凍藏時間的延長，空白、酶解KGM、輻解KGM、T7及商業(yè)抗凍劑各組對應草魚肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度和G’皆下降，與凍藏過程草魚肌原纖維蛋白SDS-PAGE條帶的變化基本吻合。同時，添加上述不同多糖各組草魚肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度和G’均高于空白組，對照SDS-PAGE圖發(fā)現(xiàn)多糖主要保護副肌球蛋白和肌球蛋白輕鏈，延緩副肌球蛋白的解螺旋及肌球蛋白輕鏈的重折疊，減輕蛋白質(zhì)的冷凍變性，有利于保持蛋白質(zhì)結構的完整性，從而減小蛋白質(zhì)凝膠性能的損失。其中，輻解KGM、T7、酶解KGM效果依次減弱，但都對凍藏過程中的草魚肌原纖維蛋白具有一定的冷凍保護作用。

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Effect of Different Polysaccharides on the Rheology of Grass Carp Myofibrillar Proteins during Frozen Storage

SHAO Ying1，2， WANG Xiaohong2， XIONG Guangquan1， LI Xin1， WU Wenjin1， QIAO Yu1， DING Anzi1， LIAO Li1， WANG Jun1， WANG Lan1，*
（1. Farm Products Processing Research Sub-Center of Hubei Innovation Center of Agriculture Science and Technology，Institute of Agricultural Products Processing and Nuclear-Agricultural Technology， Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064， China； 2. College of Food Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

The study aimed to investigate the cryoprotective effect and mechanism of different polysaccharides on grass carp myofibrillar protein during frozen storage. Grass carp myofibrillar proteins added with 0.5% β-glucanase konjac glucomannan （KGM） hydrolysate， 0.5% irradiation degraded KGM and 0.5% dextran， respectively， were stored at -18 ℃ for 0， 10 d and 75 d. Changes in myofibrillar protein concentration， sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE） pattern and rheology were measured. Results showed that the concentration and storage modulus （G’） of grass carp myofibrillar protein added with nothing， β-glucanase KGM hydrolysate， irradiation degraded KGM， dextran T7 and a commercial antifreeze decreased with frozen storage time， which was in accordance with the changes in SDS-PAGE pattern during frozen storage. At the same time， the concentration and storage modulus （G’） of grass carp myofibrillar protein added with different polysaccharides were higher than those of the control. It was demonstrated that the cryoprotection of β-glucanase KGM hydrolysate， irradiated degraded KGM and dextran on grass carp myofibrillar proteins was achieved by protecting the alpha helix structure of vice myosin and myosin light chain. The cryoprotection of different polysaccharides was in the decreasing order: irradiation degraded KGM ＞ dextran T7 ＞ β-glucanase KGM hydrolysate.

myofibrillar protein； polysaccharide； cryoprotective effect； SDS-PAGE； rheology

10.7506/spkx1002-6630-201618048

TS254.1

A

1002-6630（2016）18-0304-09

邵穎， 王小紅， 熊光權， 等. 不同多糖對凍藏過程中草魚肌原纖維蛋白流變性的影響［J］. 食品科學， 2016， 37（18）: 304-312. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618048. http://www.spkx.net.cn

SHAO Ying， WANG Xiaohong， XIONG Guangquan， et al. Effect of different polysaccharides on the rheology of grass carp myofibrillar proteins during frozen storage［J］. Food Science， 2016， 37（18）: 304-312. （in Chinese with English abstract）DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618048. http://www.spkx.net.cn

2016-03-16

武漢市青年科技晨光計劃項目（2015070404010197）；湖北省重大科技創(chuàng)新計劃項目（2015ABA038）；湖北省科技支撐計劃項目（2014BBA158）；湖北省農(nóng)科院青年科學基金項目（2013NKYJJ16）

邵穎（1994—），女，學士，研究方向為水產(chǎn)品加工。E-mail：275673017@qq.com

汪蘭（1981—），女，副研究員，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工和天然產(chǎn)物化學。E-mail：11060577@qq.com