大血藤總黃酮分離純化工藝研究

王建權(quán)，李奎永.慈溪市中醫(yī)醫(yī)院，浙江 慈溪 35300；.華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海 0037

大血藤總黃酮分離純化工藝研究

王建權(quán)1，李奎永2
1.慈溪市中醫(yī)醫(yī)院，浙江 慈溪 315300；2.華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海 200237

目的：研究大孔吸附樹(shù)脂分離純化大血藤總黃酮的工藝條件。方法：以蘆丁為對(duì)照品，考察大孔吸附樹(shù)脂對(duì)大血藤總黃酮的富集純化工藝。結(jié)果：采用DA201型大孔吸附樹(shù)脂，上樣吸附后，用純化水和30%乙醇除雜，再用5BV、50%乙醇洗脫，可得到總黃酮含量為69.78%的大血藤提取物。結(jié)論：DA201型大孔吸附樹(shù)脂在確定的工藝條件下，具有工藝簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、可靠的特點(diǎn)，能得到總黃酮純度較高的大血藤提取物。

大血藤；總黃酮；大孔吸附樹(shù)脂；分離純化

大血藤亦被稱為大活血、血藤等，為木通科植物大血藤的干燥根莖，多以莖入藥，在我國(guó)南方地區(qū)分布廣泛，具有活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)、祛風(fēng)除濕、清熱解毒等功效，臨床上主要用于治療跌打損傷、風(fēng)濕痹痛、痛經(jīng)、腹痛等。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大血藤含有蒽醌類、黃酮類、皂苷類等成分［1］，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明［2～3］，其含有的活性成分具有保護(hù)心肌、增加缺氧耐受力、抗菌消炎等作用，在臨床應(yīng)用較為廣泛。大血藤總黃酮為其主要活性成分，目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道其分離純化工藝研究，筆者采用大孔吸附樹(shù)脂分離純化得到了總黃酮含量較高的大血藤提取物，可為工業(yè)化生產(chǎn)大血藤總黃酮提供參考。

1　材料與儀器

1.1材料蘆丁對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定所研究院，120716-201409）；HP20、HPD100、HPD600、HPD700、D101、DA201型大孔吸附樹(shù)脂（均為滄州寶恩化工有限公司提供）；大血藤購(gòu)自河北安國(guó)藥材市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為木通科大血藤屬植物藤莖；甲醇（色譜純）（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司，20130320）；其余試劑均為分析純。

1.2儀器Agilent 1200系列高效液相色譜儀（Agilent 1200色譜泵，ELSD-2000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，Agilent 1200色譜工作站）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；KQ3200E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DFT-50手提式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；R-501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）。

2　方法與結(jié)果

2.1方法

2.1.1大血藤總黃酮的提取取大血藤藥材飲片，干燥、粉碎、過(guò)篩，取粉末約0.5 g，精密稱定，置于具塞的錐形瓶中，加40 mL甲醇，超聲提取60 min，放冷、靜置、過(guò)濾。濾渣用少量甲醇洗入錐形瓶中，加適量甲醇（總體積約40 mL），超聲提取60 min，放冷、靜置、過(guò)濾。合并兩次所得濾液，置于100 mL量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，即得。

2.1.2大血藤總黃酮含量測(cè)定采用紫外-可見(jiàn)分光光度法，以蘆丁為對(duì)照品，在360 nm處測(cè)定其吸光度值，以吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y=0.2078X-0.2011，R2=0.9991，大血藤提取物照該方法稀釋并測(cè)定，計(jì)算其總黃酮含量。

2.1.3上柱液的預(yù)處理稱取大血藤藥材飲片，加10倍量50%乙醇，于80℃加熱回流提取2次，每次1 h，合并提取液，濾過(guò)、減壓濃縮，配制成適用于樹(shù)脂吸附的大血藤浸出液。

2.2工藝參數(shù)的考察與優(yōu)化

2.2.1大孔吸附樹(shù)脂的預(yù)處理分別稱取HP20、HPD100、HPD600、HPD700、D101、DA201大孔吸附樹(shù)脂適量，乙醇溶脹24 h后回流提取12 h，除去樹(shù)脂中殘留的致孔劑等雜質(zhì)。濕法裝柱，用95%乙醇洗滌樹(shù)脂至流出液加等量水不呈現(xiàn)白色混濁為止。再用水洗至無(wú)醇味。改用5%鹽酸溶液沖洗樹(shù)脂，水洗至中性后換用2%氫氧化鈉溶液洗滌，最后水洗至中性即可。

2.2.2大孔吸附樹(shù)脂類型的選擇取已處理好的樹(shù)脂，置100 mL三角瓶中，加入30 mL固含量為12.14 mg·mL-1的預(yù)處理液。密塞，室溫下以振蕩頻率200次/h振蕩24 h。待充分吸附后，靜置，傾出上清液，并加入適量蒸餾水洗滌樹(shù)脂。洗滌液與上清液合并，另器儲(chǔ)存。再加入100 mL95%乙醇在室溫下洗脫。測(cè)定殘留液和95%乙醇洗脫液中總黃酮含量，各種類型樹(shù)脂對(duì)大血藤總黃酮的吸附量及解吸率結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

按以下公式計(jì)算吸附率（%）、吸附量（mg/mL）以及解吸率（%）。吸附率（%）=（M0-C1V1）/M0×100%；吸附量（mg/mL）=（M0-C1V1）/V0；解吸率（%）=C2V2/（M0-C1V1）×100%。其中M0為初始加入的大血藤提取物的質(zhì)量；V0為樹(shù)脂的體積；C1為殘留液中大血藤總黃酮的濃度；V1為殘留液體積（100 mL）；C2為醇洗液中大血藤總黃酮的濃度；V2為醇洗液體積（100 mL）。

表1　不同類型樹(shù)脂對(duì)大血藤總黃酮的吸附量　mg·mL-1

表2　不同類型樹(shù)脂對(duì)大血藤總黃酮的解吸率　%

由表1、表2可知：DA201樹(shù)脂對(duì)大血藤總黃酮的吸附量為最大，且解吸效果最好。故選用DA201樹(shù)脂用于大血藤總黃酮的分離純化。

2.2.3動(dòng)態(tài)吸附條件的考察選取DA201樹(shù)脂為模型，考察不同影響因素對(duì)大血藤總黃酮吸附效果的影響。經(jīng)預(yù)處理過(guò)的樹(shù)脂裝入內(nèi)徑為1 cm的玻璃柱，上樣，飽和吸附6 h后，開(kāi)始洗脫。

2.2.3.1上樣流速對(duì)吸附率的影響上樣流速太快，大血藤總黃酮得不到充分吸附就隨上樣液流出；流速過(guò)慢雖可提高大血藤總黃酮的吸附率，但耗時(shí)較多。筆者考察了樹(shù)脂柱床體積為5 mL，流速分別為0.5、1.0、1.5 mL·min-1時(shí)對(duì)吸附率的影響。結(jié)果顯示：當(dāng)流速為0.5 mL·min-1，上樣體積為濕樹(shù)脂柱床體積20倍時(shí)，大血藤總黃酮基本不泄漏，而流速為1.0 mL·min-1時(shí)泄露點(diǎn)出現(xiàn)較晚，可以通過(guò)反復(fù)上樣的方法彌補(bǔ)。上樣流速為1.5 mL·min-1時(shí)泄露點(diǎn)出現(xiàn)較早。為節(jié)約上樣時(shí)間，選擇流速1.0 mL·min-1為佳。

2.2.3.2吸附量與樹(shù)脂量的關(guān)系見(jiàn)表3。本試驗(yàn)考察了吸附液濃度為245 mg·mL-1，大血藤提取物與大孔樹(shù)脂用量的比值（m1∶m2）分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25時(shí)大血藤總黃酮的吸附率。

表3　不同的m1：m2的吸附率

由表3可知，當(dāng)大血藤提取物與大孔樹(shù)脂質(zhì)量比為1∶20時(shí)較合適。雖然大血藤提取物與樹(shù)脂之間質(zhì)量比為1∶25時(shí)吸附效果更好，但這與大血藤提取物與樹(shù)脂質(zhì)量比為1∶20時(shí)相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），故選取大血藤提取物與樹(shù)脂之間質(zhì)量比1∶20為最佳條件。

2.3洗脫劑濃度及用量的確定

2.3.1洗脫劑濃度的確定DA201樹(shù)脂為非極性樹(shù)脂，大血藤總黃酮為中等極性的物質(zhì)，可先用純化水除去水溶性雜質(zhì)，再用不同濃度的乙醇為洗脫劑依次洗脫。乙醇的洗脫濃度梯度為：0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%。結(jié)果顯示，大血藤總黃酮主要富集于70%濃度的乙醇中。故應(yīng)收集50%濃度的乙醇洗脫液。

2.3.2洗脫劑用量的考察經(jīng)飽和吸附的樹(shù)脂，先分別用純化水和30%乙醇洗去部分雜質(zhì)，均以洗脫液無(wú)色或接近無(wú)色為終點(diǎn)，然后更換下一個(gè)濃度梯度。收集50%乙醇洗脫液，每2.5 BV（柱床體積）收集一次，并進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，當(dāng)洗脫劑用量為5 BV時(shí)，大血藤總黃酮可基本洗脫完全。故選定洗脫劑用量為5 BV。

2.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室小試所得到的工藝參數(shù)的穩(wěn)定性，保證工業(yè)化生產(chǎn)的順利進(jìn)行，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室研究成果的產(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)變。本試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室研究的基礎(chǔ)上對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了3批中試分離純化。對(duì)50%濃度乙醇洗脫液進(jìn)行了含量測(cè)定，可得到總黃酮含量為69.78%（批次1、2、3純度均數(shù)）的大血藤提取物。結(jié)果見(jiàn)表4。三批中試結(jié)果表明，所建立的DA201大孔吸附樹(shù)脂法分離純化大血藤總黃酮的方法穩(wěn)定、可靠，適宜于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

表4　DA201大孔吸附樹(shù)脂純化大血藤總黃酮驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3　討論

大血藤總黃酮為大血藤中較重要的活性成分，近年來(lái)有關(guān)大血藤總黃酮報(bào)道的文獻(xiàn)較多，如倪士峰等［4］研究表明，大血藤總黃酮具有清除氧自由基的作用，還可抑制細(xì)胞凋亡、抗腫瘤、防治心血管疾?。桓鹈骶盏龋?］采用聚酰胺薄層層析的方法對(duì)大血藤提取物進(jìn)行分離，獲得了10余種黃酮類成分，并采用高效液相色譜法對(duì)大血藤葉片、嫩莖、葉柄等藥用部位中黃酮類成分進(jìn)行分析，初步可知大血藤葉片及嫩莖中黃酮類化合物較多。盡管大血藤總黃酮的藥理活性、化學(xué)成分分析較多，但大血藤總黃酮的分離純化研究報(bào)道極少，因而研究大血藤總黃酮分離純化工藝具有較大的應(yīng)用價(jià)值，有可能為臨床提供治療疾病的有效部位［6］。

大孔吸附樹(shù)脂的類型、用量等對(duì)活性成分的分離純化有較大的影響，本研究前期通過(guò)靜態(tài)吸附及動(dòng)態(tài)解吸附實(shí)驗(yàn)，篩選得到了適合用于大血藤提取物中總黃酮富集的樹(shù)脂類型，即中等極性的DA201樹(shù)脂，同時(shí)對(duì)樹(shù)脂的用量與分離純化效果的相關(guān)性進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，樹(shù)脂的用量越大，越有利于其吸附總黃酮，即吸附率越高，但實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中需充分考慮分離純化工藝的經(jīng)濟(jì)性、可行性、高效性等，因樹(shù)脂用量過(guò)大會(huì)消耗過(guò)多的洗脫溶劑，部分雜質(zhì)亦會(huì)進(jìn)入洗脫液，導(dǎo)致大血藤總黃酮含量降低，間接降低了樹(shù)脂的分離純化效果［7］，故本研究綜合各方面影響大血藤總黃酮純度的因素及工業(yè)化生產(chǎn)的效率，篩選最適宜的樹(shù)脂和大血藤提取物的比例，以便提高工業(yè)化生產(chǎn)大血藤總黃酮的效率。

本研究最終確定了大血藤總黃酮的分離純化條件為：大血藤提取物經(jīng)初步后，用已處理好的DA201型大孔吸附樹(shù)脂將大血藤提取物進(jìn)行吸附，待吸附完成后，先用純化水及30%乙醇除雜，再用5BV、50%乙醇洗脫，收集洗脫液，過(guò)濾并濃縮干燥即得大血藤總黃酮。為保證工藝的可行性，在實(shí)驗(yàn)室研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行了三批中試試驗(yàn)，結(jié)果顯示該分離純化工藝具有工藝穩(wěn)定、可靠，適宜于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的特點(diǎn)，為工業(yè)化生產(chǎn)大血藤總黃酮提供了參考。

［1］馬瑞麗，于小鳳，徐秀泉，等.大血藤的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)野生植物資源，2012，31（6）：1-5.

［2］丁越，張永，丁文平，等.HPLC測(cè)定大血藤藥材中綠原酸的含量［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（4）：99-102.

［3］劉宇文，殷紅妹，鄒耀華.HPLC同時(shí)測(cè)定大血藤中紅景天苷和綠原酸的含量［J］.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2012，29（10）：947-949.

［4］倪士峰，傅承新，吳平.大血藤化學(xué)成分及藥學(xué)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)野生植物資源，2004，23（4）：8-10.

［5］葛明菊，金則新，李鈞敏，等.大血藤黃酮類化合物組成的初步研究［J］.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，19（4）：382-386.

［6］衛(wèi)建琮，李華峰，喬華，等.中藥蒲公英花中總黃酮的分離純化研究［J］.中國(guó)藥物與臨床，2014，14（1）：19-21.

［7］趙惠茹，馬姣姣，魏彩霞，等.大孔吸附樹(shù)脂分離純化蒲公英中總黃酮的工藝研究［J］.中國(guó)藥業(yè)，2014，23（12）：81-83.

（責(zé)任編輯：劉淑婷）

R284.2

A

0256-7415（2016）04-0275-02

10.13457/j.cnki.jncm.2016.04.104

2015-12-19

王建權(quán)（1979-），男，主管中藥師，主要從事中藥研究工作。