曹芳芳 李娟 劉海峰
摘要:應(yīng)用RT-PCR和 SMART RACE等技術(shù)克隆山葡萄二氫黃酮醇4-還原酶基因的全長cDNA序列,結(jié)果表明,該基因全長1 362 bp,包括1 014 bp的完整開放閱讀框,推測其編碼337個氨基酸。該基因表達產(chǎn)物相對分子質(zhì)量為37.50 ku,等電點為5.95,是穩(wěn)定蛋白,不包含信號肽。蛋白質(zhì)疏水性分析結(jié)果表明,DFR疏水性最大值為2.511,最小值為-2.267,平均值為-0.146,整體表現(xiàn)為親水性。二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明,DFR的二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋(35.31%)和不規(guī)則卷曲(46.29%)為蛋白最大量的結(jié)構(gòu)元件。對不同植物DFR氨基酸序列進行多重比對發(fā)現(xiàn),同源性較高,DFR與NADPH結(jié)合區(qū)域和底物結(jié)合區(qū)域都表現(xiàn)出高度保守。用推導(dǎo)的氨基酸序列與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行同源性比較,其氨基酸序列與歐亞種葡萄、大豆、矮牽牛等植物的DFR氨基酸序列兩兩比對的相似性系數(shù)分別為98%、76%、74%。
關(guān)鍵詞:山葡萄;二氫黃酮醇4-還原酶;克隆;序列分析
中圖分類號: S663.101 文獻標志碼: A 文章編號:1002-1302(2016)07-0034-05
山葡萄(Vitis amurensis)為葡萄科葡萄屬多年生藤本植物,植株似葡萄而細小。山葡萄是葡萄屬中最抗寒的一個種,是葡萄屬植物抗性育種的珍貴資源,已被多個國家和地區(qū)所重視。山葡萄是一種經(jīng)濟價值很高的野生經(jīng)濟植物,成熟后的果實味甜酸,富含果汁,可生食,用山葡萄漿果釀造的葡萄酒品質(zhì)優(yōu)良,是我國東北地區(qū)葡萄酒工業(yè)的主要原料。葡萄酒具有預(yù)防心腦血管疾病的作用,原花青素[1]是其中最主要的作用成分。研究表明,原花青素存在較強的抗氧化活性和抗癌活性,對降低毛細血管的滲透性有重要的藥理作用。葡萄酒的品質(zhì)與葡萄中原花青素的含量有直接關(guān)系[2]。花青素類化合物也是植物中可溶性天然色素的主要來源,因此研究花色苷植物資源有重要意義?;ㄇ嗨刂苯踊蜷g接影響果實的外觀顏色形成,在合成花青素過程中[3],DFR(dihydrofla-vonol 4-reductase,二氫黃酮醇-4-還原酶) 起決定性作用。DFR反應(yīng)需要NADPH(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)的參與。DFR依賴DHM(dihydromyricetin,二氫楊梅黃酮)、DHK(dihydrokaempferol,二氫堪非醇)、DHQ(dihydroquercetin,二氫櫟皮黃酮)3種底物,它們結(jié)構(gòu)相似,只在B苯環(huán)上的羥基數(shù)目上不同,DFR將DHM、DHK、DHQ底物還原,分別生成相應(yīng)的無色花翠素、無色花葵素、無色花青素[4],通過后續(xù)途徑最終將無色的二氫黃酮醇轉(zhuǎn)化合成有色花色素[5]。不同物種DFR對3種底物具有選擇特異性[6],所以能合成不同的花色素[7],導(dǎo)致植物呈現(xiàn)出不同的花色、果色。DFR基因最早由OReilly等于1985年從金魚草(Antirrhinum majus)和玉米(Zea mays)中分離得到[8]。目前,研究人員已經(jīng)從許多不同的植物中成功分離出DFR及其他基因[9],但對山葡萄中的DFR研究尚未見報道。本研究以山葡萄為試驗材料,利用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)等方法[10]克隆DFR全長基因,成功得到山葡萄DFR基因的cDNA全長序列,并進行生物信息學(xué)分析以及序列比對,旨在為分析及調(diào)控山葡萄中花色苷的合成提供依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 試材山葡萄雙豐(V.amurensis ‘Shuang Feng)采自國家山葡萄種質(zhì)資源圃,采摘無病蟲害、飽滿的成熟期果粒,立即置于液氮中冷凍,-80 ℃冰箱中保存,取其果皮作為供試材料。
1.1.2 試劑材料 Tris-HCl、CTAB、EDTA、LiCl、β-巰基乙醇、DEPC水、AMP、IPTG、X-gal為AITiresco分裝試劑;大腸桿菌(Escherichia coli) DH5-α、pMD19-T載體、Taq酶、Marker DL2000購自TaKaRa公司;膠回收試劑盒購于Omega公司;反轉(zhuǎn)錄酶SuperScript Ⅱ購自Invitrogen公司;SMARTTM RACE試劑盒購于Clonteeh公司;其他試劑為國產(chǎn)分析純。引物由英俊生物技術(shù)有限公司合成,DNA測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 引物設(shè)計 登錄NCBI網(wǎng)站,根據(jù)GenBank中已登陸的DFR基因的核苷酸序列和氨基酸序列,通過多序列比對確定其共有的保守區(qū),利用Primer 6.0設(shè)計1對特異引物(用來擴增目的片段):VAmDFRs,5′-TCATCGGTTCATGGCTGGTC-3′;VAmDFRa,5′-CAGTTATGAGGCTTGGAGGC-3′。
1.2.2 山葡萄果皮總RNA的提取及cDNA的合成 采用改良的CTAB法[11]提取山葡萄果皮中的總RNA。用紫外分光光度計測定其D230 nm、D260 nm、D280 nm及總RNA濃度,用1% TAE檢測RNA的完整性。按照Invitrogen公司的SuperScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明書,以O(shè)ligo(dT)20為引物,總RNA為模版,進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA第1條鏈。
1.2.3 PCR擴增目的基因片段 PCR擴增反應(yīng)體系如表1所示。
擴增反應(yīng)程序:94 ℃ 預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 退火1 min,72 ℃退火2 min,72 ℃ 延伸7 min,35個循環(huán)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,回收純化目的片段。
1.2.4 5′-RACE和3′-RACE片段的獲得 用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit方法進行RACE cDNA擴增。根據(jù)保守區(qū)測序結(jié)果,克隆中間片段的引物可以繼續(xù)用于RACE,其中VAmDFRs用作3′-RACE引物,VAmDFRa用作5′-RACE引物。繼續(xù)擴增所得到的程序,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物確定條帶。
1.2.5 目的片段的回收和連接 按照膠回收試劑盒說明書對PCR產(chǎn)物的DNA片段進行回收、連接與轉(zhuǎn)化。將回收的DNA片段與pMD-19載體連接,16 ℃連接3 h。反應(yīng)體系為pMD-19載體 0.5 μL DNA片段4.5 μL、SolutionⅠ5 μL。
1.2.6 轉(zhuǎn)化 將DH5-α感受態(tài)細胞解凍后,取50 μL加入10 μL連接產(chǎn)物,冰浴30 min;取出后熱激90 s,置于冰上2~3 min;加入預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基300 μL,37 ℃ 190 r/min培養(yǎng)1 h;取適量菌液,涂布于含有AMP、X-Gal、IPTG的LB固體培養(yǎng)基平板上,37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜。次日,挑白色單克隆置于37 ℃培養(yǎng)箱中,200 r/min培養(yǎng)12 h。隨后進行菌液PCR檢測,將成功克隆的菌樣測序。
1.3 VamDFR基因序列及推測蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析
用DNAstar軟件查找VamDFR基因的開放閱讀框(ORF)并推導(dǎo)其氨基酸序列;利用 NCBI的BLAST程序檢索數(shù)據(jù)庫,對VamDFR基因全長cDNA序列及其氨基酸序列進行比對分析。利用在線軟件(表2)進行生物信息學(xué)分析,采用GeneDoc軟件進行多序列比對,并用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。
2 結(jié)果與分析
2.1 山葡萄VamDFR基因cDNA全長的克隆及序列分析
采用改良的CTAB法提取成熟期葡萄果皮中的總RNA,總RNA質(zhì)量合格,無降解。將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板,用DFR基因引物VAmDFRs、VAmDFRa進行PCR擴增,獲得目的特異條帶,約580 bp,與預(yù)期片段大小相近。產(chǎn)物經(jīng)連接轉(zhuǎn)化,篩選測序后獲得保守序列片段,用NCBI/BLAST程序進行同源搜索,結(jié)果與Vitis vinifera基因的相似性為98%。參照RACE試劑盒說明,以逆轉(zhuǎn)錄分別合成的5′-RACE-Ready-cDNA和3′-RACE-Ready-cDNA為模板,GSP與UPM為引物,分別進行5′-RACE和3′-RACE擴增,結(jié)果如圖1所示。以3′-RACE-Ready-cDNA為模板,DFRs與UPM為引物擴增得到1 241 bp條帶。以5′-RACE-Ready-cDNA為模板,DFRa與UPM為引物擴增得到約702 bp 條帶。陽性對照反應(yīng)用GSP1、GSP2為引物進行擴增,得到與預(yù)期大小相同(約580 bp)的條帶。陰性對照單引物擴增,沒有條帶產(chǎn)生。
將5′-RACE和3′-RACE測序結(jié)果應(yīng)用Vector NTI Ssuire 9.0軟件去除載體序列后拼接獲得cDNA全長。應(yīng)用DNAStar軟件對獲得的山葡萄DFR進行開放閱讀框分析,并將其推導(dǎo)為相應(yīng)的氨基酸序列,結(jié)果顯示,該基因全長 1 362 bp,包括1 014 bp完整開放閱讀框、76 bp 5′-非轉(zhuǎn)譯區(qū)、272 bp 3′-非轉(zhuǎn)譯區(qū),推測其編碼337個氨基酸,GenBank登錄號為FJ645768,將其命名為VamDFR。
2.2 VamDFR基因編碼蛋白質(zhì)理化性狀分析
利用ProParam工具在線預(yù)測分析VamDFR基因編碼蛋白的理化性質(zhì),發(fā)現(xiàn)該蛋白由337個氨基酸組成,分子量(MV)為37.50 ku,等電點值為5.95。 正電荷殘基(精氨酸+賴氨酸)37個,負電荷殘基(天冬氨酸+谷氨酸)42個,不穩(wěn)定指數(shù)34.68,脂肪指數(shù)81.31,表明VamDFR基因蛋白屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)。
2.3 VamDFR蛋白保守區(qū)預(yù)測
利用NCBI的BlastP,在蛋白保守區(qū)數(shù)據(jù)庫對山葡萄VamDFR基因進行蛋白保守區(qū)預(yù)測,VamDFR有多個保守域,如cd05193(AR_like_SDR_e)、PLN02583(PLN02583)、pfam01073(3Beta_HSD)等,該基因應(yīng)屬于DFR超基因家族[12](圖2)。
2.4 VamDFR蛋白的親水性分析
利用ProtScale程序分析了山葡萄VamDFR蛋白氨基酸序列的親水性/疏水性(圖3)。圖中縱坐標為氨基酸標度值,橫坐標為氨基酸序列位置。依據(jù)氨基酸分值越低親水性越強,分值越高疏水性越強的規(guī)律,結(jié)果顯示,VAmDFR疏水性最大值為2.511,最小值為-2.267,疏水性平均值為
-0.146;可明顯看出疏水性最大值在第168位點,值為 1.900;最小值在第145位點,值為-2.722;總平均親水性指數(shù)為-0.146,整體表現(xiàn)為親水性。
2.5 VamDFR蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域分析
根據(jù)TMHMM和TMpred Server網(wǎng)站分析,超過500分的才被認為顯著。從分析結(jié)果中可以得出,VamDFR蛋白無跨膜螺旋,所以可推測VamDFR不含有跨膜結(jié)構(gòu)域。
2.6 VamDFR蛋白的信號肽預(yù)測及二級結(jié)構(gòu)分析
利用SignalP4.1 Server對山葡萄VamDFR基因蛋白進行信號肽預(yù)測,結(jié)果表明,VamDFR基因編碼的蛋白不具有信號
肽。利用網(wǎng)上資源HNN在線預(yù)測VamDFR二級結(jié)構(gòu) (圖4),結(jié)果顯示,該蛋白的二級結(jié)構(gòu)由35.31%的α-螺旋、46.29%的不規(guī)則卷曲和18.40%的延伸鏈組成。
2.7 山葡萄VamDFR編碼蛋白質(zhì)的同源性及進化分析
用推導(dǎo)的氨基酸序列與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行同源性比較,其氨基酸序列與歐亞種葡萄(V. vinifera,X75964)、圓葉葡萄(V. rotundifolia,KC460268)、蘋果(Malus domestica,XM_008379159)、大豆(Glycine max,NM_001251683)、飛燕草(Delphinium grandiflorum,LC029441)和矮牽牛(Petunia hybrida,X15537)等植物的DFR氨基酸序列兩兩比對的相似性系數(shù)分別為98%、98%、81%、76%、77%、74%,多序列比對結(jié)
果見圖5。
山葡萄(V. amurensis,F(xiàn)J645768)、歐亞種葡萄(V. vinifera,X75964)、圓葉葡萄(V. rotundifolia,KC460268)蘋果(M. domestica,XM_008379159)大豆(G. max,NM_001251683)、飛燕草(D. grandiflorum,LC029441)和矮牽牛(P. hybrida,X15537)VAmDFR中含有與NADPH結(jié)合的保守基序(V8-Y30)[13]和26個氨基酸組成的底物特異結(jié)合的保守基序(T131-K156),其中N132和E144直接影響DFR的底物特異性,不同物種存在一定差異,Q138、Y142、D149、F152非常保守[7]。這些位點在結(jié)構(gòu)和功能上均與已知的葡萄VvDFR(CAA72420)及其他DFR蛋白相似,而且都在相同或相近的位置,從而可推斷VAmDFR屬于NADPH依賴的還原酶家族中的二氫黃酮醇4-還原酶。
用MEGA 4軟件對該基因及其他植物的DFR氨基酸序列進行多序列比對,繪制分子進化樹,結(jié)果(圖6)表明,山葡萄VAmDFR氨基酸序列與歐亞種葡萄(V.vinifera,X75964)、圓葉葡萄(V.rotundifolia,KC460268)、美國蔓藤(A.grossedentata,KC753780)、棉花(G.hirsutum,EF187441)、臍橙(C.sinensis,NM_001288931)可歸為一類,親緣關(guān)系較近;與水稻(O.sativa,AF134807)、玉米(Z.mays,NM_001158995)、小麥(T.aestivum,AY209183)、薺菜(B.juncea,GU230159)、擬南芥(A.thaliana,M86359)、飛燕草(D.grandiflorum,LC029441)等親緣關(guān)系較遠。
3 結(jié)論與討論
植物的花色和果色主要受花色素直接或間接控制,DFR是合成花色素苷的關(guān)鍵酶,因此研究DFR意義重大,DFR是單基因編碼的NADPH依賴性短鏈還原酶家族[14]。對不同物種的DFR基因編碼的氨基酸序列進行同源性比較,發(fā)現(xiàn)有2個保守區(qū)域,其中底物特異性選擇結(jié)構(gòu)域是由26個氨基酸組成[15]。DFR分子中底物結(jié)合區(qū)的氨基酸序列決定它對不同
底物的結(jié)合,此序列在不同物種中也是高度保守的[16]。研究表明,保守區(qū)域中存在的132、141位氨基酸對酶的底物特異性有很大影響,大部分的物種在132位是D(天冬氨酸)或N(天冬酞胺)。當132位氨基酸為D時是ASP型DFR,為N時是ASN型DFR,也存在少數(shù)既不是D也不是N的,被稱作非ASP/ASN型DFR[7]。Johnson等在矮牽牛中發(fā)現(xiàn),它的132位氨基酸為天冬氨酸,它的DFR主要催化DHM,其次是DHQ,而對DHK則無作用[7],不能利用DHK為底物生成天竺葵素,但許多132位是天冬酞胺的植物能利用DHK作為底物[17]。本試驗克隆得到的山葡萄DFR基因編碼的氨基酸在132位是N,為ASN型,推測它能夠催化DHK生成無色花葵素,也有報道在山葡萄果皮中檢測到花葵素[18],更加確定了筆者這一觀點。有關(guān)山葡萄花色素組成成分的報道中也有花青素、花翠素的存在,由此推測DFR基因可能不是單拷貝,而是多基因拷貝。
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